SperimEstate 2014 Marta Malavolta Elisa Mannini Greta Novelli ISIT BASSI BURGATTI

1. Mantenimenti e adesione
cellulare a diversi substrati
SperimEstate 2014
Marta Malavolta
Elisa Mannini
Greta Novelli ISIT BASSI BURGATTI

2. Obiettivo
L’obiettivo della nostra ricerca sui
mantenimenti era quello di studiare quali
fossero i substrati più adatti alla crescita di
fibroblasti (NIH3T3). I substrati migliori erano
quelli dove le cellule aderivano meglio e in
maggior numero.

3. Indice
1. Fibroblasti
2. Mantenimento cellulare
- Split e conta
- Fissazione
3. Substrati
- Polidimetilsilossano (PDMS)
- Chitina
4. Semina su substrati
5. Osservazione dei risultati
- Microscopio ottico
- Microscopio a fluorescenza
- Microscopio a scansione
elettronica (SEM)

4. Fibroblasti
• I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di
sintetizzare i componenti della matrice extracellulare.
• I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti citoplasmatici che
arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore.
• I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse embryonic
fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che
codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere
osservati al microscopio a fluorescenza.
Fibroblasto in
divisione

5. Fibroblasti
• I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di
sintetizzare i componenti della matrice extracellulare.
• I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti citoplasmatici che
arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore.
• I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse embryonic
fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che
codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere
osservati al microscopio a fluorescenza.
Fibroblasto in
divisione

6. Mantenimento cellulare
• Il mantenimento di cellule in vitro serve
per studiare fenomeni biologici come la
crescita e l’adesione delle cellule su un
determinato substrato.
• Le cellule crescono all’interno di fiasche
contenenti il mezzo cellulare specifico
per il tipo di cellula.
• Le cellule che abbiamo coltivato sono
cresciute in incubatore a 37°C con una
concentrazione del 5 % di CO2.
• Durante la coltura cellulare sono
necessarie alcune procedure atte a
mantenere condizioni ottimali alla
crescita cellulare, come il cambio
medium e lo split.
• Per quanto riguarda l’osservazione delle
cellule al microscopio fluorescente o al
SEM, è prima necessaria una fissazione.

7. • Quando le cellule arrivano a confluenza
(ovvero quando il numero di cellule
diventa elevato e si perdono le condizioni
ideali per la coltura cellulare) occorre
eseguire lo split.
• Essendo cellule adese, è necessario
rompere i contatti focali che hanno col
substrato, tramite l’enzima tripsina, in
modo da poter risospendere le cellule e
trasferirle nella camera di conta.
• Per stimare il numero di cellule presenti
nel campione si esegue la conta con la
camera di Burker.
Split e conta
Camera di Burker al microscopio ottico

8. Fissazione
• La fissazione ha la funzione di
mantenere inalterata la
morfologia dei campioni
biologici al fine di osservarli ed
impedire l’avanzamento dei
processi putrefattivi.
• A seconda del tipo di campione
e delle tecniche che si
intendono utilizzare, si può
ricorrere a differenti modalità
di fissazione con mezzi chimici
(paraformaldeide,
glutaraldeide, etc.) o fisici.

9. Substrati
• I substrati sono materiali che vengono utilizzati per l’adesione
cellulare.
• Ogni substrato presenta caratteristiche differenti che possono
permettere o meno l’adesione cellulare. Quelli da noi studiati
sono stati: il PDMS e la chitina.
PDMS Chitina

10. PDMS
• Il PDMS è un polimero
composto da silicone e un
agente curante.
• È biocompatibile e
perfettamente trasparente
ma non è biodegradabile.
• È facilmente lavorabile
grazie alla sua flessibilità.
• È utilizzato per la
costruzione di chip
microfluidici, come
additivo alimentare e
dall’industria cosmetica.

11. Chitina
• La chitina è il secondo
polisaccaride più diffuso
dopo la cellulosa. È il
costituente fondamentale
di crostacei, artropodi,
molluschi e funghi.
• È biodegradabile e
biocompatibile e per
questo è molto studiata
per la medicina
rigenerativa e trova
impiego anche nel settore
cosmetico.

12. Semina su substrati
• Abbiamo seminato i
fibroblasti in una multiwell
da 24 pozzetti, all’interno
della quale abbiamo inserito
i diversi substrati da
analizzare: PDMS, chitina e
vetro (controllo).
• La funzione del controllo è
quella di verificare di aver
seminato correttamente le
cellule, a prescindere dai
risultati ottenuti con i
diversi materiali.

13. Osservazione dei risultati
Gli strumenti che abbiamo utilizzato per l’osservazione dei campioni sono 3
microscopi di diverso tipo:
Microscopio
ottico
Sfrutta la radiazione luminosa nella lunghezza
d’onda della luce visibile.
Microscopio
ottico a
fluorescenza
Utilizzato per osservare campioni organici o
inorganici, sfruttando i fenomeni della
fluorescenza o della fosforescenza indotti nel
campione.
Microscopio a
scansione
elettronica
(SEM)
Sfrutta un fascio di elettroni che colpisce il
campione e viene catturato da un rilevatore,
fornendo un immagine digitale.

14. OSSERVAZIONE RISULTATI AL
MICROSCOPIO OTTICO

15. Controllo al microscopio ottico
Osservazione cellule del controllo su coverslip.

16. Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura.
La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e
la proliferazione cellulare.
CHITINA e FIBRINA
al microscopio ottico

17. OSSERVAZIONE RISULTATI AL
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

18. Controllo al microscopio a fluorescenza
La presenza delle cellule esclude eventuali errori sistematici

19. PDMS al microscopio a
fluorescenza
Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità
(indice di mancata adesione).

20. Pozzetto del PDMS al microscopio a fluorescenza
Come ulteriore verifica della corretta semina delle cellule (oltre al vetrino di controllo)
abbiamo osservato anche al microscopio il pozzetto della multiwell nel quale avevamo
posto il PDMS per seminare le cellule. È chiaramente visibile il segno dell’angolo di
PDMS. Nel pozzetto le cellule hanno dunque aderito senza problemi.

21. CHITINA al microscopio a fluorescenza
Cellule sulla chitina non trattata per
idrolisi alcalina.
Le cellule sono poche e non hanno
aderito bene data la loro sfericità (indice
di mancata adesione).
Cellule su chitina trattata per idrolisi
alcalina per rimuovere le proteine sulla
struttura.
Il numero di cellule adese è maggiore ma
ancora non siamo nelle condizioni ottimali
per la crescita cellulare.

22. CHITINA con FIBRINA
al microscopio a fluorescenza
Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura.
La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e
la proliferazione cellulare.
La colorazione è data dall’uso di un saggio di immunofluorescenza che permette di
evidenziare le strutture citoplasmatiche, il nucleo e i contatti focali.

23. OSSERVAZIONE RISULTATI AL SEM

24. CHITINA al SEM
Chitina trattata per idrolisi alcalina a diversi ingrandimenti SEM.
Chitina tratta per idrolisi alcalina ricoperta con un gel proteico a base di fibrina.

25. NIH-3T3 su CHITINA al SEM
330 mm 100 mm
15 mm 3 mm

26. Conclusioni
• Osservando (dopo 24 ore dalla semina) l’effettiva
presenza di cellule nel controllo abbiamo potuto
escludere eventuali errori sistematici.
RISULTATI:
- Le cellule non hanno aderito al PDMS
- Sulla chitina non trattata rispetto a quella trattata,
si è notato che l’adesione cellulare è sfavorita.
- Per rendere la chitina favorevole per la crescita
dei fibroblasti abbiamo ricoperto il substrato con
un gel proteico a base di fibrina.

27. JESSAMINE M. K. NG et al. "Components for integrated poly(dimethylilosane)
microfluidic system ". Electrophoresis (2002) 23:3461-3473
MORGANTI P. "Uso biomedico delle nanofibrine di chitina". Ricerca e industria clinica
(2009) 4.
http://www.lastampa.it/2013/02/18/scienza/benessere/medicina/ustioni-e-cicatrici-
dai-crostacei-una-soluzione-efficace-per-la-cura-
9UEZNtYrgx6nrPwOjNTOoK/pagina.html
http://www.elveflow.com/microfluidic-reviews-and-tutorials/the-poly-di-methyl-
siloxane-pdms-and-microfluidic
http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fibroblast