1. Rapporto per l’ASEA sui Risultati Sperimentali – Potenziamento degli Antiossidanti in Vitro
e Riduzione dello Stress Ossidativo.
Eseguito dal Pacific Northwest National Laboratory (PNNL)*
2009
Scopo:
Il presente documento contiene dati da inviare all’ASEA pertinenti ai risultati delle analisi in vitro condotte
da febbraio a marzo 2009. Cellule vive in colture cellulari sono state esposte all’ASEA e sono stati misurati
sia la bioattività relativa all’azione antiossidante del glutatione perossidasi (GPx) e del superossido
dismutasi (SOD) che l’aumento della produzione naturale di questi antiossidanti nelle cellule. Inoltre, sono
state condotte analisi per determinare se lo stress ossidativo è diminuito nelle cellule e se la viabilità delle
cellule è aumentata grazie all’esposizione all’ASEA.
Metodi sperimentali per l’attività antiossidante:
Le cellule sono state coltivate in varie cappe contenenti un siero bovino. Come parametro principale, le
cellule simili alle cellule epiteliali nei topi sono state coltivate (queste cellule reagiscono in maniera simile
alle cellule umane) e più tardi le cellule endoteliali umane sono state usate per ottenere risultati
quantitativamente rilevanti.
Nei test di potenziamento degli antiossidanti, alcune delle colture sono state esposte all’ASEA mentre altre
colture sono state esposte alla stessa quantità di una soluzione salina rafforzata con un fosfato inerte (PBS).
L’azione antiossidante delle cellule in ciascuna coltura è stata misurata con un kit, denominato Array
Design Stressgen Kit (No. 900-158 per attività GPx e No. 900-157 per l’attività SOD). I reagenti chimici
all’interno di questi kit misurano l’azione degli antiossidanti negli estratti di cellule per ridurre l’attività
antiossidante che avviene naturalmente quando vengono aggiunte sostanze chimiche biologiche ossidanti.
Poiché alcune molecole reattive nell’ASEA possono reagire ed interferire con alcuni agenti chimici in
questi kit, sono stati condotti diversi esperimenti preliminari per esaminare l’accuratezza dei risultati
raffrontati con standard conosciuti dell’attività antiossidante e sono state apportate le dovute modifiche.
Risultati dei test sull’attività antiossidante:
I primi risultati ottenuti hanno mostrato effetti significativi e ben definiti. Gli estratti di cellula esposti
all’ASEA hanno mostrato otto (8) volte l’efficienza antiossidante per il GPx rispetto agli estratti esposti al
PBS inerte. L’efficienza degli antiossidanti SOD è stata leggermente inferiore, con un aumento di circa 5
volte. È importante sottolineare che questa efficienza è stata evidente specialmente nelle concentrazioni più
basse di ASEA, testata fino al 2,5% della sua piena potenza. Aumentare la concentrazione di ASEA fino a
raggiungere elevate concentrazioni non ha incrementato notevolmente l’efficienza antiossidante; pertanto,
pare vi sia una soglia molto bassa di saturazione a basse concentrazioni di GPx. Dovranno essere svolte
ulteriori sperimentazioni a bassissime concentrazioni di ASEA per poter capire pienamente la dipendenza
dalla concentrazione.
È ragionevole dire che è stato osservato un aumento di almeno il 500% dell’efficienza complessiva
antiossidante durante questi test preliminari in vitro grazie all’esposizione all’ASEA.
*Il PNNL non appoggia in alcun modo l’ASEA. Esso ha solamente agito come laboratorio indipendente nell’eseguire e produrre i
risultati di questi test.

2. Rapporto per l’ASEA sui Risultati Sperimentali – Potenziamento degli Antiossidanti in Vitro
e Riduzione dello Stress Ossidativo.
Eseguito dal Pacific Northwest National Laboratory (PNNL)*
2009
Metodi sperimentali per la sovraregolazione degli antiossidanti:
In questi esperimenti, alcune cellule endoteliali umane in colture cellulari sono state esposte all’ASEA ed
altre solo ad una soluzione salina rafforzata con un fosfato inerte (PBS). L’analisi standard nota come
Western Blot (o immunofissazione) su tutte le cellule è stata condotta per determinare se l’esposizione
all’ASEA ha deattivato il nucleo provocando l’aumento della produzione di antiossidanti come il GPx. La
concentrazione dei fattori di trascrizione (messaggeri) nel nucleo che richiede la sovraregolazione degli
antiossidanti è stata anch’essa misurata nelle cellule endoteliali umane e paragonata a cellule che non sono
state esposte all’ASEA.
Il movimento dei fattori di trascrizione nel nucleo è visibile con taluni coloranti sotto un microscopio e
quindi offre un modo per vedere la richiesta della sovraregolazione degli antiossidanti senza gli ostacoli
presentati dall’uso di cellule endoteliali.
Dal momento che anche la produzione di antiossidanti può essere sovraregolata dall’esposizione delle
cellule a determinati livelli bassi di tossine infiammatorie, sono state condotte analisi per assicurarsi che
l’ASEA non sottoponeva le cellule ad un responso infiammatorio o tossico a basso livello.
Risultati della sovraregolazione degli antiossidanti
I risultati di queste analisi sono stati straordinari sotto diversi aspetti. Innanzitutto, c’è stata una vera
sovraregolazione della produzione di antiossidanti nelle cellule esposte all’ASEA. Questo effetto è stato
temporaneo, ed è durato solo circa 120 minuti, ma è stato chiaramente visibile. Il risultato più interessante,
tuttavia, è che l’esposizione all’ASEA a qualsiasi concentrazione non ha invocato il normale fattore di
trascrizione infiammatoria (NF-kappaB). La stimolazione della produzione di antiossidanti senza
stimolazione di un’infiammazione a basso livello è molto rara ed ha causato un certo interesse nella
comunità scientifica.
Le analisi che hanno misurato il movimento dei fattori di trascrizione sono stati test controllati, essi hanno
avuto “controlli positivi” che dimostravano che il test stava funzionando. Per esempio, una piccola quantità
di una tossina che notoriamente provoca un responso infiammatorio (movimento del fattore di trascrizione
NF-kappaB) è stata analizzata insieme all’ASEA, un responso positivo è stato registrato molto chiaramente
con la tossina e non è stato osservato alcun responso con l’ASEA. Con il fattore di trascrizione della
sovraregolazione antiossidante NRF2, il movimento positivo di questo fattore di trascrizione è stato
osservato sia nell’ASEA che nel controllo positivo. Centinaia di cellule sono state osservate per ottenere
questi risultati.
Questi risultati sono stati verificati tramite analisi western blot, ed hanno dimostrato responsi chiari
all’aumento di antiossidanti con l’esposizione all’ASEA relativa al controllo salino.
*Il PNNL non appoggia in alcun modo l’ASEA. Esso ha solamente agito come laboratorio indipendente
nell’eseguire e produrre i risultati di questi test.