Bojenje mikroskopskih preparata

1. Laboratorijske tehnike za 2.razred –laboratorijsko-
sanitarni smjer
Violeta Novaković, profesor

2.  Mikroskopski preparati se boje radi boljeg uočavanja
strukture i detalja posmatranog preparata
 U tu svrhu se koriste:
1. PRIRODNE BOJE (ekstrakti biljaka i životinja)
2. VJEŠTAČKE BOJE :
a. kisele: fuksin, eozin, eritrozin –njima se boji citoplazma
b. bazne: metil-plavo,gencian-violet...-njima se boji jedro
c. fluorohromi-:auramin,rivanol, korifosfin,fluoresceini-
koriste se kod fluorescentne mikroskopije
Za bojenje preparata se koriste 1%-3% rastvori boje .
Prosto bojenje je u slučaju korištenja samo jedne boje a
složeno kada se koristi više boja

3. Bojenje nativnih preparata- vitalno bojenje
 Pri izradi preparata, a prije pokrivanja pokrovnicom,
materijalu se doda kap blagog rastvora neke
odgovarajuće boje.
 Rastvor mora biti takav da ne uzrokuje narušavanje
struktura ćelija.
 Rijetko je u upotrebi jer vrijeme mikroskopiranja
kratko zbog sušenja posmatranog materijala.

4. Bojenje trajnih preparata
 Koristi se za mikod bojenja preparata za svetlosne i
fluorescentne mikroskope
 Bojenju trajnih preparata prethodi priprema istih, koja
obuhvata:
 1. pripremu razmaza-omčastom ezom se u tankom
sloju nanosi materijal na predmetnicu.Ona mora
prethodno da se očisti i flambira
 2.sušenje
 3. fiksiranje

5. Priprema razmaza
 Omčastom ezom se u tankom sloju nanosi
materijal(urin, likvor, gnoj...) na predmetnicu.
 Predmetno staklo mora prethodno da se očisti i
flambira i označi brojem
 Za pravljenje premaza krvi, materijal se uzima
direktno iz prsta pacijenta, gdje se sa kapi krvi dodirne
predmetnica a drugim staklom pod uglom od
45°uzorak razvuče u što tanjem sloju.

6. Sušenje i fiksiranje
 Najbolje je da se sušenje obavi na sobnoj temperaturi
 Kada je sušenje gotovo, cijela površina preparata ima
mat boju
 Fiksiranje se može vršiti:
a. toplotom – provlačenjem kroz plamen
b. hemijskim sredstvima (metanolom, etanolom,
acetonom...)- obavezno se primjenjuje za pravljenje
preparata za fluorescentno mikroskopiranje

7. Bojenje preparata
 BOJENJE METILENSKO-PLAVIM –najčešće prosto bojenje
u bakteriologiji
Preko fiksiranog razmaza, postavljenog na stativ za bojenje
prelije se 1% rastvor ove boje. Boja stoji oko 5 min. nakon
čega se preparat ispira, suši i miroskopira.
 BOJENJE PO GRAMU-najčešće složeno bojenje u
bakteriologiji
pripremljen i fiksiran razmaz prelije se prvo bojom
gencijan-violet, pusti da djeluje 2 minuta nakon čega se
ispire vodom, prelijeva Lugolovim rastvorom a zatim pa
96% etanolom i ponovo vodom. Na kraju se prelije bojom
karbol-fuksin,koja stoji pola min. Nakon toga se preparat
ispira vodom, suši i mikroskopira.

8. Bojenje krvnih premaza po metodi Gimsa
 Pripremljen preparat se fiksira u metanolu oko 5 min.
Suv se prelijeva rastvorom Gims boje(mješavina azura,
eozina i metil-plavog), koja stoji oko pola sata, nakon
čega se ispira vodom dok ne postane crven, suši i
mikroskopira
 Mikroskopiranje ovakvih preparata se vrši svjetlosnim
mikroskopom, i to imerzionim objektivom za čije
korištenje je neophodno kedrovo ulje

9. Bojenje preparata fluorohromima- metod
imunofluorescencije
 Nakon pripreme i fiksiranja razmaza materijala,
preparat se potapa u aceton 10 min.,ispire vodom i
osuši. Na razmaz se nanese kap konjugata
(fluorohrom sa antitijelom koje se veže za gonokokus)i
ostavi u vlažnoj komori pola sata na 37°C. Nakon toga
preparat se tri puta ispire u odgovarajućem puferu i
osuši pa uz dodavanje kapljice 15% glicerola prije
pokrivanja pokrovnicom, mikroskopira i to isključivo
fluorescentnim mikroskopom u tamnoj prostoriji

10. Bojenje trajnih histoloških preparata-
hematoksilineozni metod
 Radi se poslije deparafinacije ksilolom i etanolom, te
ispiranja vodom
 Bojenje se izvodi prvo hematoksilolom 5-10 min.
 Nakon ispiranja vodom koristi se eozin 3 min. Slijedi
ponovno ispiranje vodom pa dehidratacija
 Dehidratacija se vrši potapanjem preparata u etanol
rastućih koncentracija od 70% do 96% po 3 min. I napokon
u 100% etanol 10.min
 Nakon toga dehidratacija se nastavlja karboksiksilolom 10
min.
 Bojenje se vršu u kivetama a ne prelevanjem preparata

11. Pitanja za utvrđivanje:
1. Koje vrste boja se koriste za bojenje mikroskopskih
preparata?
2. Šta su fluorohromi?
3. Kako se nazivaju bojenja za bojenje nativnih
preparata?
4. Kako se pravi krvni razmaz?
5. Šta je prosto a šta složeno bojenje?

12.  Mikroskopiranje trajnih histoloških preparata vrši se
običnim svjetlosnim mikroskopom.
 Na preparat se stavlja kanada-balzam, pokrije
pokrovnicom i mikroskopira sa podignutim
kondenzorom i maksimalno otvorenom dijafragmom.
 Da bi preparati bili trajni, treba ih poslije čišćenja
prekriti pokrovnicom čije ivice pomoću staklenog
štapića premazati 2% rastvorom pleksiglasa u
hloroformu i čuvati na suvom i tamnom mjestu.

13. Očekivani ishodi učenja:
 Savladavanje tehnike pripreme razmaza
mikroskopskih preparata
 Savladavanje tehnike sušenja i fiksiranja
mikroskopskih preparata
 Savladavanje tehnike bojenja mikroskopskih preparata
 Poznavanje tehnike mikroskopiranja upotrebom
različitih tipova svjetlosnih mikroskopa (sa svijetlim
poljem, tamnim poljem i faznokontrastno
mikroskopiranje..)i različitih tipova mikroskopskih
preparata