BOJENJE I ANALIZA HISTOLOŠKIH PREPARATA

1. BOJENJE I ANALIZA HISTOLOŠKIH PREPARATA
Uvod u bojenje histoloških preparata
Histološki preparati poznati su u znanosti i medicini po svojim raznovrsnim, a često i
privlačnim bojama. Naravno, primarni cilj bojenja histoloških preparata nije estetske prirode, već
potreba za isticanjem različitih strukturnih pojedinosti stanica i tkiva. S obzirom da je gotovo svako
tkivo nakon rezanja na preparate debljine svega nekoliko mikrometara bezbojno, u većini slučajeva
nije moguće razlikovati pojedinosti na preparatu bez bojenja.
Bojenje histološkog preparata počiva na različitim fizikalno-kemijskim interakcijama boje,
otapala i tkivnih sastojaka, a te su interakcije raznolike, ovisno o tkivu i metodi bojenja. U njih
spadaju: elektrostatske veze, Van der Waalsove veze, vodikove veze, kovalentne veze itd.
Zadržavanje boje u tkivu uvelike ovisi o afinitetu boje prema pojedinim sastojcima tkiva, odnosno o
afinitetu boje prema otapalu. Ključna je i selektivnost boje prema sastojcima tkiva, zbog koje se
različite strukture različito boje. Osim toga, krajnji rezultat ovisit će i o postupcima s preparatom
nakon bojenja (npr. neke tvari mogu se otopiti u alkoholu i drugim organskim otapalima tijekom
dehidracije preparata). Mnoge boje u histologiji su zapravo neutralne soli s kiselim ili bazičnim
radikalima. Zato u velikom broju slučajeva afinitet boje za pojedine sastojke tkiva počiva na
interakcijama kiselina i baza. Anioni kiselih boja imaju visok afinitet za bazične sastojke tkiva kao što
su citoplazma ili proteini u kiselom okruženju, dok kationi bazičnih boja boje kisele sastojke tkiva, kao
što su područja bogata nukleinskim kiselinama (jezgra, ribosomi, hrapava endoplazmatska mrežica) ili
sulfatiranim glikozaminoglikanima. Tkivo koje se boji bazičnom bojom naziva se bazofilnim, a ono
koje se boji kiselom bojom acidofilnim. Pojedine boje imaju afinitet za točno određene tkivne
sastojke, npr. prirodna boja dobivena iz nekih vrsta lišaja, orcein, specifično se veže za elastična
vlakna i boji ih nijansama tamno smeđe boje.
Posebna vrsta međudjelovanja tkiva i boje je metakromazija. Primjer metakromazije je
bojenje zrnaca u mastocitima pri kojem zbog visokog afiniteta kiselih radikala u zrncima prema
bazičnim anilinskim bojama (npr. toluidin) dolazi do nakupina boje koje imaju drugačiju boju nego
boja u monomernom obliku (crveno-ljubičasto umjesto plavo). Slično se može dogoditi i u matriksu
hrskavice i tkivu bogatom mucinima gdje također ima puno negativno nabijenih molekula.
U transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji preparati se ne boje klasičnim bojama, nego se
kontrastiraju atomima teških metala (osmij, tungsten, olovo, krom itd.) koji snažno raspršuju
elektrone, za razliku od atoma koji čine biološka tkiva. Postoji pozitivno i negativno „bojenje“, ovisno
boji li se željena struktura ili njena okolina odnosno pozadina.
Hemalaun-eozin
Klasični primjer korištenja kisele i bazične boje u histologiji je bojenje tehnikom hemalaun-
eozin, u kojoj se koristi hemalaun (bazična, plavo-ljubičasta boja) i eozin (kisela, crveno-ružičasta

2. boja). Acidofilne, eozinom obojene tvorbe nazivaju se tradicionalno i eozinofilne. Hemalaun boji
kisele sastojke tkiva nijansama tamno plave i ljubičaste boje, npr. jezgru i hrapavu endoplazmatsku
mrežicu, a eozin boji bazične sastojke tkiva nijansama ružičaste i crvene boje vezivna vlakna i
citoplazmu stanice. Ako je citoplazma bogata hrapavom endoplazmatskom mrežicom i slobodnim
ribosomima, obojit će se nijansama ljubičaste boje zbog velike količine RNA. Općenito, bojenje
hemalaun-eozinom daje vrlo dobar opći pregled strukture tkiva i stoga je najčešće korištena metoda
bojenja u klasičnoj histologiji. U literaturi se može naći i naziv hematoksilin-eozin. Hematoksilin je
spoj koji sam po sebi ne boji tkivo, već ga je potrebno oksidirati u hematein, koji zapravo boji tkivo te
ga stabilizirati nekim mordanom (stabilizatorom boje), a ovisno o korištenom mordanu,
hematoksiline se može podijeliti u više skupina. Ukoliko se kao mordan koristi kalijev alaun, dobiva se
hemalaun, najčešće korišten spoj hematoksilina u svijetu. Još neke metode koje počivaju na kiselo-
baznom međudjelovanju su bojenje po Papanicolauu i po Romanowskom.
Neke druge metode bojenja
Iako se u nekim metodama koriste samo jedna ili dvije boje postoje i trikromne, tetrakromne
i pentakromne metode bojanja, kod kojih se koristi tri, četiri odnosno pet različitih boja. Često se
koriste kad je potrebno dodatno razlučiti pojedine sastojke tkiva koji se nekom standardnom
metodom ne razlikuju od okolnog tkiva. Neke od poznatijih metoda s tri i više boja su: trikromno
bojenje po Malloryju, trikromno bojenje po Massonu, tetrakromno bojenje po MacNealu i
pentakromno bojenje metodom Movat-Russel. Prednosti metoda s više od dvije boje su što neke od
njih različito boje mišićno i vezivno tkivo, koja se u standardnoj tehnici hemalaun-eozin pretežno boje
eozinom ružičastim i crvenim nijansama ili ističu različite vrste vezivnih vlakana i druge sastojke
međustanične tvari koje bi se inače slično bojile. Za prikazivanje kolagenih vlakana i analizu njihove
količine i organizacije može se koristiti pikrosirijus bojenje u kombinaciji s polarizacijskim
mikroskopom.
Postoji i cijeli niz histokemijskih metoda koje se temelje na kemijskim reakcijama boje i
sastojaka tkiva. Ove metode omogućuju određivanje smještaja ili prisutnosti određene vrste
molekula u tkivu. Ovdje spadaju metode za otkrivanje prisutnosti polisaharida i oligosaharida, lipida,
različitih enzima, iona i tako dalje. Neke od poznatijih metoda su PAS-reakcija za određivanje
polisaharida i nekih srodnih molekula (reakcija u kojoj se koriste perjodna kiselina i Schiffov reagens,
engl. periodic acid-Shiff reaction), berlinsko modrilo za dokazivanje depozita željeza u tkivima i Oil red
O za bojenje lipida na smrznutim rezovima.
U histokemijske metode spadaju i imunohistokemija i imunofluorescencija, u kojima se
koriste protutijela u kombinaciji s različitim biljezima, kao što su enzimi i fluorescirajuće molekule. U
histologiji se mogu koristiti i fluorescentne boje. Njima obojeni preparati promatraju se na
fluorescencijskom mikroskopu, na kojem je često izvor svjetlosti ultraljubičasta lampa. Fluorescentna
boja, obasjana UV-svjetlom, emitira svjetlost određene boje u vidljivom spektru.

3. Posebne vrste bojenja
Impregnacija je specifična metoda u histologiji kod koje dolazi do odlaganja teških metala
(srebro, zlato) na strukture koje ih reduciraju iz otopina njihovih soli. Impregnacija i nije pravo
bojenje, jer nikakva boja ne ulazi u navedene strukture, nego ih oblažu čestice teških metala i čine ih
neprozirnima, ali najčešće se radi jednostavnosti ubraja u metode bojenja. Impregnacijom se dobro
prikazuju tijela neurona i njihovi stanični nastavci, glija stanice i retikulinska vlakna.
Za prikaz sustava cjevčica ili kanalića u tkivu, kao što je mreža krvnih žila, može se pripremiti
injekcijski preparat. Postoje razne metode i mogućnosti izvođenja ove tehnike, no bit metode je
uštrcavanje boje ili kontrastnog sredstva u sustav žila ili kanalića koji želimo prikazati prije fiksacije
tkiva. Nakon pripreme rezova, tkivo se po potrebi može obojiti dodatnim kontrastnim bojama.
Preparat kosti može se ručno ili strojno izbrusiti u vrlo tanak izbrusak kosti te potopiti u boju
koja tada prodire u sustav šupljina i kanala kosti te ih čini vidljivima.
Odabir metode bojenja
Na odabir metode utječu razni čimbenici. S obzirom da postoje na stotine različitih metoda i
njihovih modifikacija, potrebno je određeno iskustvo i temeljno poznavanje principa bojenja tkiva u
histologiji. Potrebno je razumjeti i koji mehanizam stoji iza bojenja tkiva određenom tehnikom, kao i
osobitosti tkiva koje želimo bojati. Ponekad je samo jedna boja dovoljna za prikaz željenih detalja,
npr. toluidinsko modrilo kod brze patološke dijagnostike nekih maligniteta na smrznutim rezovima.
Standardno bojenje u histologiji je metoda hemalaun-eozin i nju se često koristi, kako u
patohistološkoj dijagnostici, tako i radi općeg prikaza strukture tkiva, zbog dobrog kontrasta između
jezgre i citoplazme te odličnog prikaza vezivnih vlakana. Kad se želi istaknuti pojedine komponente
tkiva, potrebno je potražiti specifičnu metodu (kao što je orcein za elastična vlakna ili Kultschitzkyjeva
modifikacija Weigert-Pal metode za prikaz mijeliniziranih živčanih vlakana).
Često je i priprema koja prethodi bojenju važna ukoliko nam je cilj obojiti pojedine sastojke
tkiva. Npr. u tkivu koje je prošlo kroz organska otapala koja otapaju lipide (kao što je ksilol ili neka od
njegovih alternativa u parafinskom postupku) nema smisla pokušati koristiti neku od metoda za
prikazivanje lipida (Oil red O ili Sudan –crnilo). Slično tome, koštano tkivo se prije bojenja u mnogim
slučajevima podvrgava postupku dekalcinacije, prilikom kojeg se anorganski dio ukloni iz tkiva.
Međutim, ukoliko je planirano koristiti neku metodu za detekciju kalcija u tkivu, kao što je metoda po
von Kossi, bojati se mora nedekalcinirana kost. Osim toga, na mogućnost bojenja ponekad utječe i
vrsta fiksativa te medija za uklapanje tkiva. Navedeni primjeri ističu važnu činjenicu da je prije
istraživanja koje uključuje neke histološke metode obavezno isplanirati koje će se metode koristiti, jer
to može izravno utjecati na pripremu preparata i odabir metode bojenja. Dobro je koristiti uhodane i
standardizirane protokole i odgovarajuće kontrole te se savjetovati s osobama koje imaju iskustva s
željenim metodama. Na kraju, potrebno je obratiti pažnju na nabavu kvalitetnih reagensa i adekvatno
skladištenje.

4. Analiza histoloških preparata
Morfološka analiza
Histološki preparat uvijek je dobro analizirati od manjeg prema većem povećanju, a dobro ga
je prije mikroskopiranja promotriti i makroskopski kako bi se uočile neke osnovne informacije o tkivu
(homogenost ili heterogenost bojenja, oblik, struktura, opći raspored tkiva ili nejednolikosti njegove
građe, specifične strukture, prevladavajuća boja, veći artefakti i sl.). Mikroskopiranje se najčešće vrši
pri povećanjima od 40, 100 i 400 puta, mada po potrebi povećanja mogu biti manja (pregledna), a i
veća (npr. kod korištenja imerzijskog ulja i odgovarajućeg objektiva). Na manjim povećanjima obično
se identificira tkivo (ako već nije poznato) te se analiziraju osnovne strukturne pojedinosti i specifične
tvorbe na preparatu. Dobro je na malom povećanju pregledati cijeli preparat i tako se upoznati s njim
te identificirati područja koja želimo detaljnije istražiti, što činimo na većim povećanjima. Prilikom
mikroskopiranja prikupljamo podatke o vrsti, obliku, prostornom rasporedu i međusobnim odnosima
stanica i međustanične tvari te njihovoj količini, posebnim prostorima i šupljinama itd. Analiziramo
vrstu i intenzitet bojenja i njihovo značenje ovisno o korištenoj metodi.
U svjetlosnoj mikroskopiji, većina preparata je debljine od 3 do 10 mikrometara, što u praksi
daje dvodimenzionalan prikaz struktura koje inače imaju trodimenzionalan raspored. To treba uzeti u
obzir pri analizi preparata, a utječe i na izgled pojedinih sastojaka tkiva, ovisno o njihovoj veličini i
prostornom rasporedu. Smjer u kojem je tkivo prerezano može jako utjecati na interpretaciju
preparata, jer pojedine strukture vrlo različito izgledaju na poprečnom, uzdužnom i kosom presjeku
(npr. mišićna vlakna, krvne žile, odvodni kanalići žlijezda itd.). Zato osoba koja mikroskopira treba
imati predznanje o građi tkiva koje promatra.
Prilikom fiksacije, uklapanja, rezanja i bojenja zbog različitih razloga mogu nastati oštećenja i
deformacije preparata koje se nazivaju artefakti. Primjeri artefakata su skupljanje i razdvajanje tkiva
zbog dehidracije, otapanje masnih kapljica i mijelinskih ovojnica u ksilolu, razderotine tkiva zbog
neravnina mikrotomske oštrice, nejednolika debljina i obojenost preparata zbog vibracija tijekom
rezanja, talog boje ili drugih kemikalija itd. Artefakti se u određenoj mjeri mogu izbjeći pažljivim i
stručnim radom, no ne mogu se u potpunosti eliminirati. Zato je važno pri interpretaciji preparata
voditi računa i o njima.
Kvantitativna analiza
U znanosti je često potrebno dobiti brojčane podatke koji se mogu statistički analizirati. Na
histološkom preparatima može se izmjeriti i kvantificirati niz vrijednosti. Kvanititativna analiza može
obuhvaćati mnogo različitih radnji, od jednostavnog brojanja stanica u vidnom polju pa sve do
složenih stereoloških mjerenja i izračuna. Za većinu mjerenja potrebno je načiniti sliku kamerom
spojenom na mikroskop te je pohraniti u digitalnom obliku. Ukoliko su nam potrebni podaci o duljini,
površini i volumenu, potrebna je kalibracija sustava koja će omogućiti da pri analizi digitalne slike
znamo odnos piksela i mjernih jedinica. Za dobivanje kvantitativnih podataka i njihovu analizu

5. razvijeni su mnogi računalni programi, od kojih se neki plaćaju, zatvorenog su koda i vlasništvo
kompanija koje proizvode mikroskope i kamere, dok su neki besplatni, otvorenog koda i dostupni
svima, a razvija ih zajednica znanstvenika i računalnih programera. Neki od osnovnih morfoloških
parametara su broj čestica, duljina, opseg i površina. Iz njih se mogu razni dobiti izvedeni parametri,
ovisno o potrebama istraživača. S obzirom da su slike histoloških preparata dvodimenzionalne, ne
možemo iz njih izravno dobiti trodimenzionalne podatke, no uz pomoć matematičkih formula iz
dvodimenzionalnih mjerenja mogu se izvoditi trodimenzionalni podaci. Znanost koja se bavi time
naziva se stereologija.
Moguće je prikupiti podatke o intenzitetu bojenja (npr. semikvantitativna analiza intenziteta
imunohistokemijskog bojenja), ručno ili automatsko izdvajanje pojedinih struktura na temelju boje i
oblika, razdvajanje slika na kanale, transformacija slike za jednostavniju analizu te 3D rekonstrukcija
serijskih rezova tkiva. Metode kvantitativne analize preparata u 21. stoljeću sve su brojnije, a njihove
mogućnosti sve su veće.

6. LITERATURA
1. Suvarna K, Layton C, Bancroft J. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques. 7th Ed.
Churchill Livingstone; 2012.
2. Culling CFA. Handbook of Histopathological and Histochemical Techniques. 3rd Ed. London:
Butterworth-Heinemann; 1974.
3. Durst-Živković B. Praktikum iz histologije. 4. prerađeno izd. Zagreb: Školska knjiga; 1998.
4. Junqueira LC, Carneiro J. Osnove histologije. 10. izd. Zagreb: Školska knjiga; 2005.
5. Bradbury S. Hewer's Textbook of Histology for Medical Students, 9th ed. London: William
Heinemann Medical Books; 1973.
6. Xia Y, Momot K. Biophysics and Biochemistry of Cartilage by NMR and MRI, London: Royal
Society of Chemistry; 2016.
7. Watt IM. The Principles and Practice of Electron Microscopy. 2nd. ed. Cambridge: Cambridge
University Press; 1997.
8. Bijelić N, Belovari T, Stolnik D, Lovrić I, Baus Lončar M. Histomorphometric Parameters of the
Growth Plate and Trabecular Bone in Wild-Type and Trefoil Factor Family 3 (Tff3)-Deficient Mice
Analyzed by Free and Open-Source Image Processing Software. Microsc Microanal. 2017;
23(4):818-825. doi: 10.1017/S1431927617000630.
9. Dykstra MJ. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. New York:
Plenum press; 1992.
Napomene
Svi preparati i njihove fotografije u ovom materijalu vlasništvo su Katedre za histologiju Medicinskog
fakulteta Osijek. Zahvaljujemo Danici Matić, med. lab. ing. i Ediju Rođaku, mag. biol. exp. na izradi
preparata.