UKLAPANJE I REZANJE UZORAKA ZA HISTOLOŠKU ANALIZU

1. 1
UKLAPANJE I REZANJE UZORAKA ZA HISTOLOŠKU ANALIZU
Za proučavanje mikroskopske građe tkiva i organa, uzorak je potrebno prethodno
pripremiti. Postupak obrade uzorka obuhvaća fiksaciju, uklapanje, rezanje uzorka i bojenje
dobivenih rezova. Fiksacija se provodi kako bi se spriječilo propadanje uzetog uzorka zbog
autolize i djelovanja mikroorganizama. Nakon fiksacije provodi se uklapanje, kako bi se tkivu
osigurala potrebna čvrstoća za rezanje. Rezanje predstavlja slijedeću fazu obrade uzorka.
Pomoću instrumenata – mikrotoma, uzorci se režu na rezove dovoljno tanke da kroz njih
mogu proći zrake svjetlosti, odnosno da se mogu proučavati svjetlosnim mikroskopom. Za
proučavanje detalja građe tkiva pomoću mikroskopa (histološku analizu) rezove je još
potrebno obojiti.
Tako pripremljen uzorak tkiva, prikladan za proučavanje mikroskopom naziva se
histološki preparat. Idealan histološki preparat trebao bi zadržati strukturu i molekularni
sastav kao u živom organizmu, no to je u praksi teško izvedivo. Tijekom pripremanja
preparata uzorak je podvrgnut nizu postupaka i različitim reagensima, pa pojedini sastojci
tkiva mogu biti uklonjeni (lipidne kapljice). Prilikom dehidriranja preparata tkivo se skvrči,
što može dovesti do pojave šupljina koje u živom tkivu ne postoje. Promjene u tkivu koje su
posljedica obrade tkiva i pripreme preparata nazivaju se artefakti. Te se promjene u tkivu
mogu svesti na najmanju moguću mjeru pažljivim rukovanjem uzorkom i pravilnim odabirom
reagensa. Kvaliteta histološkog preparata ovisi o svakoj fazi izrade, a svaki slijedeći postupak
ovisi o prethodnom. Stoga je prije fiksiranja potrebno odrediti koja metoda bojenja će biti
primijenjena, jer daljnji postupak i svojstva uzorka (vrsta tkiva, veličina, porijeklo) utječu na
izbor fiksativa i sve slijedeće korake u obradi uzorka.
Tkiva sisavaca (miša, štakora, zamorca, psa, mačke, primata) vode se i uklapaju na
sličan način kao i humana tkiva.
Prilikom uzimanja tkiva, tkivo se označi, kako bi se izbjegla zamjena tkiva tijekom
obrade uzorka. Takva greška može upropastiti cjelokupni prethodno provedeni pokus, čije bi
rezultate trebalo histološki analizirati, ili uzrokovati opasne zabune kada se tkivo priprema za
dijagnostičke svrhe. Najbolji način da se to izbjegne jest da se tkivo s oznakom stavi u kazete
ili košarice za vođenje tkiva i skupa premješta iz jednog reagensa u drugi.
Nakon fiksiranja, a prije uklapanja u parafin ili plastičnu smolu, tkivo se ispire od
fiksativa i dehidrira. S obzirom da fiksativi u rutinskoj histološkoj tehnici sadrže vodu (4 i 10
% puferirana izotonična otopina formaldehida), uzorak se ispire vodom. U slijedećoj fazi
obrade potrebno je dehidrirati uzorak (tkivo), jer navedeni mediji za uklapanje nisu topivi u
vodi. Dehidriranje se provodi premještanjem uzoraka u alkohol sve veće koncentracije
(uzlazni niz alkohola). Osjetljiva tkiva (embrionalno tkivo) počinju se dehidrirati 50%
mješavinom alkohola i vode, što vrijedi i za velike uzorke. Većina uzoraka tkiva može se
početi dehidrirati 70% alkoholom. Kada se uzorak fiksira u alkoholnim fiksativima ili
fiksativima s pikrinskom kiselinom (Bouinov fiksativ), tkivo se izravno prebacuje u alkohole.
Iz Bouinovog fiksativa u 70%, a iz alkoholnih fiksativa u 100% alkohol. Ako se uzorak
priprema za analizu elektronskim mikroskopom, nakon fiksacije u glutaraldehidu provodi se

2. 2
postfiksacija u osmijevom tetraoksidu. Dehidriranje se provodi s alkoholima (ili acetonom) od
nižih koncentracija (5 %) i nastavlja prema 100 % alkoholu, ali s manjim rasponom
koncentracija (10 %, 20 %, 30 %, itd.).
Kada se iz uzorka ukloni voda, premješta se u otapalo za uklapajući medij. Za
uklapanje u parafin obično se koristi ksilol, i takvi uzorci su nakon obrade prikladni za analizu
svjetlosnim mikroskopom. Uzorak se iz alkohola premješta u ksilol. Kada ksilol zamjeni
alkohol u tkivu, ono postane prozirno, stoga se ovaj proces naziva prosvjetljavanje.
Za uklapanje u plastične smole upotrebljava se otapalo za određenu vrstu smole, kao
npr. propilen oksid. Uzorci uklopljeni u plastične smole pripremaju se za analizu elektronskim
mikroskopom, a u nekim slučajevima mogu se analizirati i svjetlosnim mikroskopom
(polutanki rezovi).
Uklapanje uzoraka
Uklapanje uzoraka obuhvaća prožimanje uzorka medijem za uklapanje i oblikovanje
blokova. Parafin je najčešće korišten medij za uklapanje u svjetlosnoj mikroskopiji. To je
mješavina lančastih ugljikovodika u obliku čvrste, bjelkaste mase bez mirisa, a nabavlja se u
obliku listića ili zrnaca. Kemijski je inertan. Talište mu je između 45-60 °C (obično se koristi
parafin s talištem između 56-58°C). U tekućem obliku parafin ulazi u šupljine u uzorku, a
kada se hladi brzo se skrutne. Omogućuje dobivanje kvalitetnih rezova i prikladan je za
većinu rutinskih i specijalnih bojenja, uključujući i imunohistokemijsku metodu. U nastavku
će biti opisan postupak uklapanja u parafin i rezanje parafinskog bloka.
U parafinskom postupku, prožimanje se odvija u termostatu na temperaturi tališta
parafina. U tri posude u termostatu nasipa se tekući parafin. Volumen parafina u posudi treba
biti 25-30 puta veći od volumena uzorka. U prvu posudu stavi se uzorak i svaka dva sata
uzorak se prenosi u slijedeću posudu. Tijekom prožimanja, parafin zamijeni ksilol i ispuni
šupljine u tkivu. Ako tkivo nije dobro dehidrirano i infiltrirano ksilolom, ili nije u potpunosti
prožeto parafinom prilikom rezanja se kida i mrvi.
Oblikovanje blokova vrši se izvan termostata. Uzorak se iz posljednje posude s
parafinom u termostatu premješta u kalup ispunjen tekućim parafinom. Ukoliko se radi ručno
mogu se koristiti različiti kalupi za oblikovanje blokova. L-kalupi koji se sastoje od dva
metalna dijela u obliku slova L, čijim se slaganjem mogu oblikovati manji i veći kalupi,
ovisno o veličini uzorka. Kalup za oblikovanje blokova treba biti toliko velik da oko tkiva
ostane dovoljna količina medija za uklapanje koja će tkivu dati potporu za vrijeme rezanja.
Kod pripreme L-kalupa, metalne dijelove se slaže na metalnu ili staklenu ploču, a kada se
parafin ohladi jednostavno se uklanjaju. Ukoliko se koriste stakleni kalupi, prethodno ih se
namaže glicerinom. Postupak se provodi tako da se u kalup nasipa tekući parafin, a zatim se
uzorak pincetom smjesti u sredinu kalupa. Pri tome tkivo orijentira, a blok označi. Pravilno
orijentirati uzorak znači reznu plohu okrenuti prema dnu kalupa i postaviti je paralelno s
podlogom, kako bi se prilikom rezanja dobio rez odabranog dijela uzorka, a rez zahvatio
cijelu površinu. Nepravilna orijentacija uzorka može otežati mikroskopsku analizu uzorka.

3. 3
Cijeli postupak treba provesti brzo kako bi se izbjeglo hlađenje parafina u kalupu i parafina u
uzorku, jer se tada stvori sloj skrutnutog parafina oko uzorka. Zbog toga se tkivo ne poveže
dobro s parafinom u kalupu i prilikom rezanja uzorak se odvaja od ostalog parafina. Nakon
što se smjesti u kalup, oznaka pod kojom je do tada vođen se učvrsti na parafinski blok.
Parafinski blokovi se tada stave na hlađenje. Što se parafin brže hladi, kristali parafina koji pri
tome nastaju su manji.
Većina laboratorija u današnje vrijeme ima u manjem ili većem opsegu automatiziranu
obradu uzoraka. Automatski tkivni procesori programirani su tako da uzorke u kazetama
prenose iz jednog reagensa u drugi tijekom 24 sata, i u njima se tkivo može provesti od
fiksacije do prožimanja parafinom. Za oblikovanje blokova postoje aparati u kojima se tekući
parafin izlijeva u kalupe, no orijentiranje uzoraka rade djelatnici u laboratoriju. Rezanje se i
dalje provodi ručno. Bojenje također može biti automatizirano.
Osim parafina postoje i drugi mediji za uklapanje. Oni se primjenjuju kada reagensi u
parafinskom postupku uklanjaju ili oštećuju sastojke tkiva koji se namjeravaju proučavati
(lipidi), toplina potrebna za uklapanje u parafin utječe na tkivo ili enzime, medij za uklapanje
nije dovoljno čvrst za tkivo ili su potrebni tanji rezovi nego što se mogu dobiti rezanjem
parafinskog bloka. U tom slučaju primjenjuju se sintetske smole. Nekada se za uklapanje
tvrdih tkiva kao što su maternica i kost, ili posebnih preparata (oko) koristio celloidin jer daje
bolju potporu tkivima. Osim toga za uklapanje u celloidin nije potrebno zagrijavanje.
Nedostatci cellodina (duže vrijeme potrebno za izradu preparata, teško dobivanje rezova
tanjih od 10µm) i prilagođavanje svojstava parafina dodavanjem različitih aditiva doveli su do
toga da se danas celloidin rijetko koristi. Osim navedenih medija koji nisu topivi u vodi,
postoje i mediji topivi u vodi (npr. carbovax, želatina, agar).
Smrznuti rezovi
Drugačiji način pripreme preparata, kojim se može izbjeći utjecaj reagensa i topline na
uzorak je izrada smrznutih rezova. Kod ove metode uzorak se brzo zamrzava, i tako se
istovremeno fiksira i stvrdne. Smrznuti uzorci režu se pomoću kriostata, rezovi se montiraju
na predmetno staklo i dalje obrađuju. Pogodna je za brzo dobivanje rezova i različita
histokemijska istraživanja.
Uklapanje uzoraka za analizu transmisijskim elektronskim mikroskopom
Za proučavanje ultrastrukture stanica i tkiva koristi se elektronski mikroskop. Kod
transmisijskog elektronskog mikroskopa, elektroni prolaze kroz uzorak, pa su rezovi mnogo
tanji nego za svjetlosnu mikroskopiju. Zato se upotrebljavaju posebna sredstva za uklapanje.
Najčešće upotrebljavane smole za uklapanje su iz skupine epoxy smola (Epon i njene
zamjene). Većina epoksi smola je prozirno žućkaste boje. Kao i za svjetlosnu mikroskopiju, i
za elektronsku mikroskopiju uzorak se nakon fiksiranja dehidrira. Ako je dehidriranje
provedeno alkoholom, a uzorak se uklapa u plastične smole, prije uklapanja se uroni u otapalo

4. 4
za smolu, propilen oksid. Prožimanje tkiva vrši se tako da se koncentracija otapala za smolu
postupno smanjuje, a koncentracija medija za uklapanje povećava. Kada se oblikuju blokovi,
u kapsule za uklapanje ili u kalupe se stavi medij za uklapanje i uzorak te ostavi da se smola
polimerizira. Epon se polimerizira pomoću topline. Polimerizacija pomoću topline provodi se
zagrijavanjem medija za uklapanje s uzorkom (u kalupu) na temperaturu između 35-60 °C.
Neke smole mogu se osim toplinom, polimerizirati i UV zračenjem.
Rezanje uzoraka
Slijedeći postupak u izradi histološkog preparata je rezanje. Za analizu svjetlosnim
mikroskopom, uzorci se mogu izrezati na rezove debljine od 1 – 10 µm (1 µm je 10-6
m)
pomoću posebnih aparata – mikrotoma. Debljina reza je različita za različite vrste tkiva
(žljezdano tkivo se obične reže na tanje, a mozak na deblje rezove).
Rezanje uzoraka uklopljenih u parafin
Kod rotacijskog mikrotoma blok s uzorkom se učvrsti na pomični držač, a nož se
učvrsti na držač koji je nepomičan. Blok se namjesti tako da je paralelan s nožem, nož se
približi uzorku i napravi se nekoliko tankih rezova kako bi se uklonio parafin na površini.
Okretanjem ručice držač s tkivom se pomiče od gore prema dolje, pa blok s uzorkom klizi
preko noža i tako se odreže rez. Kada nosač završi kretanje, odnosno ručica napravi puni krug
nosač s tkivom se automatski pomiče prema nožu za toliko mikrometara koliko je namještena
debljina reza. Rotacijski mikrotomi prikladni su za rezanje tkiva uklopljenih u parafin,
pogotovo mekih tkiva te za serijske rezove. Klizni mikrotom ima pokretan držač noža, a blok
s tkivom je učvršćen na držač koji nije pomičan. Povlačenjem ručice nož klizi preko bloka s
uzorkom i pri tom se odreže rez određene debljine. Klizni mikrotomi prikladni su za rezanje i
mekih i tvrdih tkiva (bez obzira jesu li uklopljena u parafin ili celoidin) te za rezanje većih
uzoraka (kao što je oko).
Prilikom rezanja parafinskog bloka pomoću rotacijskog mikrotoma, blok klizi preko
oštrice noža i pri tom se odreže rez koji ostane na nožu. Vlažnim kistovima može se svaki
pojedinačni rez skinuti s noža i prenijeti na tamnu podlogu ili može se nastaviti rezati blok.
Tada se parafin na rubu prethodnog reza zalijepi s parafinom na rubu slijedećeg reza pa se
formiraju parafinske trakice. Kada se izrađuju serijski rezovi, svi se rezovi prikupe i pravilno,
slijedom rezanja, slože na tamnu podlogu.
Dobiveni rezovi promatrani golim oko izgledaju kao bjelkasti poluprozirni listići. U
slijedećim fazama obrade uzorka radi se na tamnoj podlozi kako bi se uzorci jasnije vidjeli.
Zbog pritiska prilikom rezanja parafin se nabere i zato se nakon rezanja dobiveni rezovi
ravnaju.
Ravnanje parafinskih rezova provodi se na površini tople vode u vodenoj kupelji ili
na grijaćoj ploči. Kada se rezovi ravnaju na površini tople vode u vodenoj kupelji, destilirana
voda se ugrije na temperaturu nekoliko stupnjeva nižu od tališta parafina. Rezovi se kistom

5. 5
prenesu na površinu vode. Pod utjecajem topline parafin se rasteže i rezovi se izravnaju.
Zatim se predmetno staklo pod kutom uroni u vodu ispod reza i rez se nježno povuče na
staklo. Ako se ravna parafinska trakica, prilikom stavljanja na staklo se rezovi razdvoje se i
svaki montira na jedno staklo. Prilikom ravnanja rezova na grijaćoj ploči, na predmetno staklo
stavi se voda i na površinu vode jedan rez ili nekoliko rezova u obliku parafinske trakice.
Nakon toga staklo s rezovima stavi se na grijaću ploču. Zagrijavanjem vode, zagrijava se i
parafin i rasteže se što dovodi do izravnanja rezova. Ako je potrebno može se histološkim
iglama ili kistom još dodatno izravnati, ali to je potrebno pažljivo uraditi kako bi se izbjeglo
kidanje reza. Nakon toga predmetno staklo s rezovima se skine s grijaće ploče. Izravnani
rezovi mogu se potom razdvojiti i montirati pojedinačno na predmetno staklo ili slagati redom
(serijski rezovi).
Montiranje rezova je postupak u kojem se izravnani rezovi smjeste na predmetno
staklo, pojedinačno ili u nizu. Postupak se provodi nakon ravnanja, dok na staklu još ima
vode, što omogućuje pomicanje reza po staklu. Smještaju se na sredinu predmetnog stakla, i
pri tome se mogu dodatno ispraviti i orijentirati. Nakon toga se višak vode obriše, a stakla s
rezovima se stave na grijaću ploču da se rezovi osuše i učvrste na površini stakla. Ovisno o
slijedećem postupku u izradi histološkog preparata odabiru se predmetna stakla na koja će se
montirati rezovi. Za različita histološka bojenja rezovi se montiraju na obična predmetna
stakla. Ukoliko će se provoditi imunohistokemijska metoda, rezovi se montiraju na adhezivna
stakla. Montiranje na adhezivna stakla se preporučuje za rezove dekalcinirane kosti, kako bi
se izbjeglo odvajanje rezova od predmetnog stakla u daljnjem postupku obrade uzorka. U
postupku rezanja uzorka i montiranja rezova bitno je oznaku, pod kojom je uzorak do tada
vođen, prepisati na predmetno staklo.
Serijski rezovi se izrađuju kada se analizira građa složenih trodimenzionalnih
struktura ili analiziraju uzorci u kojima komponente od kojih se sastoje nisu zastupljene u
cijelom uzorku. Histološka analiza jednog reza, uobičajene debljine 6 µm daje uvid u građu
ograničenog dijela uzorka koji je trodimenzionalan. Međutim, analizom svih rezova slijedom
rezanja montirani na staklo može se pratiti oblik strukture ili naći i proučiti određenu
strukturu u uzorku. Serijski rezovi pripremaju se tako da se cijeli uzorak izreže i svi rezovi
sačuvaju. Dobiveni rezovi, od prvog do posljednjeg se redom slože u obliku parafinskih
trakica na tamnu podlogu. Zatim se tim redom ravnaju i montiraju na staklo. Ako je rezova
puno, onda se prilikom obilježavanja stakla, uz oznaku pod kojom je uzorak vođen obavezno
upiše i redni broj stakla.
Deparafiniranje i rehidriranje
Nakon montiranja na staklo, parafinski rezovi se trebaju pripremiti za slijedeću fazu
obrade uzorka – bojenje. Iz reza se prvo ukloni parafin, a zatim se u tkivo vrati voda.
Postupak uklanjanja parafina iz reza naziva se deparafiniranje. Provodi se uranjanjem
rezova u ksilol ili neko drugo otapalo za parafin. Zbog njegovog štetnog utjecaja, posljednjih
godina sve više se upotrebljavaju zamjene za ksilol. S obzirom da su boje koje se
upotrebljavaju tijekom obrade uzorka za histološku analizu, većinom vodene otopine složenih

6. 6
organskih spojeva, prije bojenja je u tkivo potrebno vratiti vodu. Taj se postupak naziva
rehidriranje. Provodi se nakon deparafiniranja, uranjanjem rezova u alkohole sve nižih
koncentracija (silazni niz alkohola; od 100 % do 70 % alkohola) sve do vode. Za analizu
svjetlosnim mikroskopom, uzorci se mogu obojiti različitim histološkim bojama. Izbor boje
ovisi o vrsti tkiva, o tome namjeravaju li se neki sastojci u tkivu istaknuti radi analize, te o
prethodnim postupcima u obradi uzorka.
Rezanje uzoraka uklopljenih u smolu
Uzorci uklopljeni u smolu, za analizu elektronskim mikroskopom, režu se
ultramikrotomom. To je posebna vrsta mikrotoma koji omogućuje rezanje tankih rezova. Za
rezanje se koriste stakleni ili dijamantni noževi. Prilikom rezanja blok s uzorkom klizi preko
noža, a odrezani rezovi se skupljaju na površini vode iza oštrice. Debljina polutankih rezova
kreće se između 0,1 – 2,5 µm, no većinom je između 0,5 - 2 µm. Odrezani rezovi se prenesu
na kap vode na staklu, osuše na grijaćoj ploči (na temperaturi 70 – 80 °C) i oboje toluidinskim
modrilom. Takvi rezovi (preparati) pogodni su za analizu tkiva svjetlosnim mikroskopom, za
dijagnostičke ili eksperimentalne svrhe, ocjenu kvalitete uzorka te pregledavanje uzorka radi
odabira područja koje će se podvrći daljnjem postupku. Izabrani dio uzorka se zatim reže na
još tanje rezove (ultratanki rezovi) pogodne za analizu elektronskim mikroskopom. Debljina
ultratankih rezova kreće se između 8 - 100 nm. Preporučena debljina ultratankih rezova je oko
80 nm (1 nm je 10-9
m).
Ultratanki rezovi koji se prikupe s površine vode iza oštrice noža, montiraju se na
mrežice. Mrežice su obično izrađene od bakra, no mogu biti napravljene i od drugih
materijala kao što su nikal ili zlato. Vanjski promjer mrežice je 3 mm. Uzorak otvora u
mrežici je vrlo raznolik, u obliku rešetke (mreže), šesterokuta kao na slici; ili u obliku
paralelnih pruga. U daljnjoj pripremi uzoraka za analizu elektronskim mikroskopom, rezovi
montirani na mrežice se kontrastiraju solima teških metala.
Literatura:
1. Buesa RJ, Peskhov MV. Histology without xylene. Ann Diagn Pathol. 2009; 13:246-56.
2. Culling CFA. Handbook of Histopathological and Histochemical Techniques. 3rd Ed.
London: Butterworth-Heinemann; 1974.
3. Durst-Živković B. Praktikum iz histologije. 5. prerađeno izd. Zagreb: Školska knjiga;
2007.
4. Hayat MA. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. 4th
Ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2000.
5. Junqueira LC, Carneiro J. Osnove histologije. 10. izd. Zagreb: Školska knjiga; 2005.
6. Prophet ED, Mills B, Arrington JB, Sobin LH. Laboratory Methods in Histotechnology.
Washington, D.C.: American Registry of Pathology; 1994.
7. Suvarna K, Layton C, Bancroft J. Bancroft's Theory and Practice of Histological
Techniques. 7th Ed. Churchill Livingstone; 2012.
8. Švob M. Histološke i histokemijske metode. Sarajevo: Svjetlost; 1974.