Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/garmentspace https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. ĐOÀN
THỊ
NHUNG
SINH
HỌC
THỰC
NGHIỆM
2021
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Đoàn Thị Nhung
NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN DI TRUYỀN GIỮA
NGƯỜI VIỆT CỔ - THUỘC GIAI ĐOẠN HẬU THỜI KỲ
ĐỒ ĐÁ MỚI – VỚI NGƯỜI VIỆT HIỆN ĐẠI BẰNG PHÂN
TÍCH TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN TY THỂ
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC
Hà Nội - 2021

2. BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Đoàn Thị Nhung
NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN DI TRUYỀN GIỮA
NGƯỜI VIỆT CỔ - THUỘC GIAI ĐOẠN HẬU THỜI KỲ
ĐỒ ĐÁ MỚI – VỚI NGƯỜI VIỆT HIỆN ĐẠI BẰNG PHÂN
TÍCH TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN TY THỂ
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC
Hà Nội - 2021

3. BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Đoàn Thị Nhung
NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN DI TRUYỀN GIỮA
NGƯỜI VIỆT CỔ - THUỘC GIAI ĐOẠN HẬU THỜI KỲ
ĐỒ ĐÁ MỚI – VỚI NGƯỜI VIỆT HIỆN ĐẠI BẰNG PHÂN
TÍCH TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN TY THỂ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH
SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS Chu Hoàng Hà
Hà Nội - 2021

4. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình
nghiên cứu của tôi cùng nhóm nghiên cứu dưới sự góp ý của người hướng
dẫn. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu
nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn
toàn chịu trách nhiệm.
Học viên cao học

5. ii
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn đến thầy hướng dẫn PGS.TS Chu
Hoàng Hà, nếu không có sự hỗ trợ tận tình trong suốt quá trình tôi sẽ không
thể hoàn thành được luận văn này. Tôi xin cảm ơn các nhân viên và lãnh đạo
Trung tâm Giám định ADN và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
đã giúp đỡ tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong mọi bước tiến
hành luận văn. Bên cạnh đó, tôi cũng xin được cảm ơn Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam và các thành viên trong đề tài “Nghiên cứu giải
trình tự gen các mẫu xương khảo cổ tại Việt Nam nhằm cung cấp thông tin di
truyền cho nghiên cứu đa dạng sinh học người và khảo cổ học”, mã số đề tài:
DL0000.08/20-22 giúp tôi đạt được những kết quả trong luận văn này.
Không thể thiếu được lời cảm ơn đến ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo,
các phòng chức năng của Học viện Khoa học và Công nghệ để luận văn được
hoàn thành.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn khi nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ
từ gia đình và bạn bè trong suốt quá trình làm luận văn.

6. iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT..................................... v
DANH MỤC BẢNG........................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................vii
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài....................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu................................................................................. 1
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................. 1
4. Cơ sở khoa học và tính thực tiễn............................................................... 1
5. Những đóng góp của luận văn .................................................................. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 3
1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới.......................................................... 3
1.1.1. Lịch sử loài người qua các nghiên cứu di truyền khảo cổ học ....... 3
1.1.2. Loài người tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam qua nghiên cứu
di truyền khảo cổ....................................................................................... 5
1.1.3. Các chỉ thị di truyền sử dụng trong nghiên cứu mẫu xương khảo cổ
................................................................................................................... 6
1.1.4. Ứng dụng công nghệ giải trình tự gen trong nghiên cứu các mẫu
khảo cổ ....................................................................................................10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............18
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................18
2.1.1. Người Việt cổ sinh sống trong giai đoạn hậu thời kỳ đồ đá mới..18
2.1.2. Người Việt hiện đại.......................................................................18
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................18
2.2.1. Tách chiết DNA ty thể và giải trình tự bằng hệ thống máy Ion
S5™ (Thermo Fisher Scientific).............................................................18
2.2.2. Phân tích đánh giá chất lượng giải trình tự của hệ thống Ion S5™
bằng phần mềm FastQC..........................................................................21
2.2.3. Map các đoạn đọc (reads) với hệ gen tham chiếu và lọc chất lượng
bằng phần mềm bwa, samtools ...............................................................21

7. iv
2.2.4. Ước tính các mẫu bị tổn thương (deamination) và chỉnh lại các file
BAM bằng phần mềm mapDamage........................................................21
2.2.5. Gọi các biến thể (variants) và tạo ra VCF (Variant Call Format) 22
2.2.6. Tạo file consensus và kiểm tra nhiễm với Schmutzi ....................22
2.2.7. Xác định nhóm haplogroup bằng HaploGrep2.............................23
2.2.8. Dựng cây phát sinh chủng loại thông qua phần mềm MEGA......23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................24
3.1. Kết quả tách chiết DNA ty thể và giải trình tự bằng hệ thống máy Ion
S5™ (Thermo Fisher Scientific).................................................................24
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA ty thể......................................................24
3.2. Phân tích đánh giá chất lượng giải trình tự của hệ thống Ion S5™ bằng
phần mềm FastQC.......................................................................................32
3.3. Map các đoạn đọc (reads) với hệ gen tham chiếu và lọc chất lượng
bằng phần mềm bwa, samtools ...................................................................35
3.4. Ước tính các mẫu bị tổn thương (deamination) và chỉnh lại các file
BAM bằng phần mềm mapDamage............................................................37
3.5. Gọi các biến thể (variants) và tạo ra VCF (Variant Call Format) .......39
3.6. Tạo file consensus và kiểm tra nhiễm với Schmutzi ...........................41
3.7. Xác định nhóm haplogroup bằng HaploGrep2 ....................................43
3.8. Dựng cây phát sinh chủng loại thông qua phần mềm MEGA.............45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................58
1. KẾT LUẬN ........................................................................................58
2. KIẾN NGHỊ........................................................................................58
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ...............................................59
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................60

8. v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
STT Tên viết tắt Tên đầy đủ
1 DNA Deoxyribonucleic acid
2 mtDNA Mitochondiral DNA
3 H. sapiens Homo sapiens
4 H. erectus Homo erectus
5 H. floresiensis Homo floresiensis
6 NST Nhiễm sắc thể
7 NRY Non-recombining portion of the Y chromosome
8 Autosomal STRs Autosomal short tandem repeats
9 SNPs Single nucleotide polymorphisms
10 PCR Polymerase chain reaction
11 GWAS Genome-wide association study
12 AMHs Anatomically modern Homo sapiens
13 TCN Trước công nguyên
14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
15 AFDIL Armed Forces DNA Identification Laboratory
16 rCRS revised Cambridge Reference Sequence
17 USA United States of America
18 HV1 Hypervariable segment 1
19 VCF Variant Call Format
20 BCF Binary variant call format
21 RSRS Reconstructed Sapiens Reference Sequence

9. vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Một số loại chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu lịch sử loài người
........................................................................................................................... 7
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra nồng độ DNA đầu vào sử dụng bộ Quantifiler
Trio kit (ThermoFisher, USA) ........................................................................30
Bảng 3.2: Kết quả định lượng thư viện sau chuẩn bị bằng Ion Library Taqman
Quantification kit (ThermoFisher, USA)........................................................30
Bảng 3.3: Chất lượng mỗi trình tự thu được của CCNM24WG và
CCNM55WG ..................................................................................................34
Bảng 3.4: Thông tin các mẫu được lựa chọn để xây dựng cây phát sinh loài 45
Bảng 3.5: Thông tin các mẫu thuộc hai nhánh xanh dương và đỏ..................53

10. vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Mô hình mtDNA ở người.................................................................12
Hình 2.1: Quy trình làm việc của Schmutzi ( Renaud G et al., 2015)............22
Hình 3.1: Mẫu xương đùi – K1A06................................................................24
Hình 3.2: Mẫu xương K1B07 .........................................................................24
Hình 3.3: Mẫu 6 xương dài - K1B05 ..............................................................25
Hình 3.4: Mẫu xương dài và các mảnh xương nhỏ K1B10A .........................25
Hình 3.5: Mẫu xương K1B08 .........................................................................26
Hình 3.6: Mẫu xương gãy nát K1B10............................................................26
Hình 3.7: Các mẫu xương sau khi nghiền mịn................................................27
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi miniset PS1 và PS2 trên
gel agarose 2%. ...............................................................................................28
Hình 3.9: Các thông số của quá trình giải trình tự..........................................31
Hình 3.10: Chất lượng trình tự của mẫu xương cổ thứ nhất (CCNM24WG).32
Hình 3.11: Chất lượng trình tự của mẫu xương cổ thứ hai (CCNM55WG)...32
Hình 3.12: File đầu ra thu được từ samtools...................................................36
Hình 3.13: Thông tin tổn thương DNA cổ đại của mẫu CCNM24WG được tạo
ra bởi mapDamage 2.0 ....................................................................................37
Hình 3.14: Thông tin tổn thương DNA cổ đại của mẫu CCNM55WG được tạo
ra bởi mapDamage 2.0 ....................................................................................38
Hình 3.15: Một phần file vcf đầu ra................................................................40
Hình 3.16: Kết quả chạy schmutzi..................................................................42
Hình 3.17: Cây phát sinh chủng loại của người Việt cổ và người cổ thuộc một
số nước trong cùng giai đoạn ..........................................................................51
Hình 3.18: Cây phát sinh chủng loại của người Việt cổ, người cổ thuộc một số
nước trong cùng giai đoạn và người Việt hiện đại..........................................55

11. 1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cho đến thời điểm hiện tại, các mẫu xương người khảo cổ chỉ được
nghiên cứu về mặt khảo cổ học mà chưa có một nghiên cứu di truyền nào
được tiến hành tại Việt Nam. Con người đã đến định cư tại vùng đất Việt
Nam từ lâu đời, dựa trên một số dấu vết của những Homo sp. thì dấu vết của
những con người đầu tiên tại Việt Nam đã có từ khoảng nửa triệu năm trước –
nửa cuối giai đoạn Pleistocene. Tuy nhiên, sự hạn chế của các bằng chứng
khảo cổ học và đặc biệt là các nghiên cứu di truyền chứng minh lịch sử của
con người sinh sống tại Việt Nam chưa thể đưa ra những kết luận chắc chắn.
Nghiên cứu về quá trình tiến hóa của loài người cần tiến hành dựa trên cả các
bằng chứng lịch sử và nghiên cứu về mã di truyền. Thông tin di truyền thu
thập được từ những bộ hài cốt có thể cung cấp bằng chứng về chủng người,
nguồn gốc, sự pha trộn của các nền văn hóa trong quá khứ đến hiện đại, từ lối
sống của một quần thế, hay là xác định nguyên nhân dẫn đến cái chết của
người đó [1, 2].
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tách chiết được DNA ty thể (mtDNA) từ mẫu người Việt
cổ. Ước đoán được mối liên hệ di truyền giữa người Việt cổ hậu thời kỳ đồ đá
mới với người Việt hiện đại cũng như người Việt cổ và một số người cổ thuộc
một số nước trong khu vực Đông Nam Á.
3. Nội dung nghiên cứu
Tách chiết mtDNA từ mẫu xương cổ đại
Giải trình tự mẫu mtDNA thu được
Đánh giá chất lượng của trình tự mtDNA thu được
Xây dựng cây phân loại theo haplogoup để sa sánh các mẫu của người
Việt cổ với người Việt hiện đại cũng như người Việt cổ và một số người cổ
khác trong cùng thời đại trong một số nước khu vực Đông Nam Á.
4. Cơ sở khoa học và tính thực tiễn
DNA cổ đại (aDNA) là vật liệu di truyền thu được từ các mẫu vật cổ
đại và không giống như DNA hiện đại, trải qua quá trình phân mảnh và các

12. 2
tổn thương sau khi chết chủ yếu do các yếu tố môi trường gây ra [3]. Các
nghiên cứu DNA cổ đại, được thực hiện trong 30 năm qua, đã xác nhận rằng
trong khi duy trì các quy trình thích hợp, chúng ta có thể khôi phục vật liệu di
truyền từ các mẫu vật cổ đại. Cho đến gần đây, phần lớn các nghiên cứu về
aDNA của con người chủ yếu tập trung vào DNA ti thể (mtDNA) nhờ thực tế
là mtDNA hiện diện trong tế bào với số lượng bản sao cao hơn bộ gen nhân,
và do đó nó thường là dấu hiệu di truyền duy nhất có thể thu hồi từ các mẫu
bảo quản kém. Do di truyền từ mẹ, tỷ lệ đột biến cao, không có sự tái tổ hợp
và sự biến động ở cấp độ quần thể, nó là một công cụ hữu ích để tái tạo lại các
sự kiện nhân khẩu học trong quá khứ [4].
5. Những đóng góp của luận văn
Bước đầu tối ưu quy trình tách chiết mtDNA từ mẫu xương có tuổi vài
nghìn năm cũng như những mẫu vật có chất lượng rất kém.
Bước đầu cung cấp thêm các bằng chứng phân tử về sự tồn tại của
người Việt cổ đại cũng như mối quan hệ di truyền của người Việt cổ và người
Việt hiện đại cũng như người Việt cổ với người cổ thuộc một số nước Đông
Nam Á trong cùng thời đại, nền văn hoá.

13. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.1.1. Lịch sử loài người qua các nghiên cứu di truyền khảo cổ
học
Homo sapiens là loài duy nhất còn tồn tại thuộc chi Homo, có kiểu hình
như người hiện đại đang sinh sống trên Trái Đất hiện nay. Tuy nhiên, trước
khi sự có mặt của tổ tiên gần nhất của loài người hiện đại đơn độc thì trên
Trái Đất đã từng tồn tại những người anh em của H. sapiens khác cùng sinh
sống. Những người anh em này có hình thái giải phẫu về tỉ lệ kích thước bộ
não trên kích thước cơ thể gần tương tự với loài người và sự xuất hiện của
công cụ lao động [5]. Dựa trên bằng chứng khảo cổ thì loài người hiện đại đã
tiến hóa từ loài người tối cổ từ khoảng hai triệu năm trở về trước. Trọng tâm
của các cuộc tranh luận về nguồn gốc của loài người hiện đại Homo sapiens
đó là mô hình, vị trí và thời điểm mà loài người biến đổi từ loài người có hộp
sọ lớn thành cấu trúc giải phẫu của người hiện đại. Một số ý kiến đưa ra dựa
trên mô hình sự thay thế của người Châu Phi từ thời điểm những tổ tiên Homo
sapiens đầu tiên hình thành như một loài mới ở Châu Phi từ khoảng 150 đến
200 nghìn năm về trước, sau đó dần chiếm lĩnh các vùng đất trong thế giới cổ
đại, và thay thế các nhóm người khác, trong đó có người Neanderthals. Một
số ý kiến khác thì chấp nhận mô hình tiến hóa đa vùng miền – multiregion
evolution, sự dịch chuyển từ người cổ đại sang hình thái người hiện đại đã
diễn ra trong một làn sóng bành trướng của loài người hiện đại khoảng hai
triệu năm trở về trước. Cũng dựa trên mô hình đó nhưng quá trình diễn biến
có các dạng khác nhau như sự biến chuyển về hình thái diễn ra đầu tiên ở
Châu Phi và sau đó lan rộng ra toàn bộ thế giới cổ đại thông qua hình thức di
nhập gen; trong khi đó, một số ý kiến khác thì cho rằng hình thái người hiện
đại xuất hiện từ nhiều thời điểm khác nhau, tại nhiều địa điểm khác nhau.
Cho đến năm 1997, việc tách chiết thành công mtDNA từ một mẫu vật
Neanderthals thu thập được trong hang Feldhofer tại Đức đã đánh dấu bước
ngoặt trong nghiên cứu nguồn gốc loài người, khi mà có thể khai thác thông
tin di truyền của các mẫu người khảo cổ chứ không chỉ dựa trên các bằng
chứng truyền thống. Trên cơ sở đó các nhà khoa học cũng đã tách chiết thành
công mtDNA của người Neanderthals ở một số hang động khác, cung cấp

14. 4
thêm bằng chứng gen về người Neanderthals. Các nghiên cứu này đã chỉ ra sự
khác biệt trong trình tự mtDNA của người Neandertals với người hiện đại và
đề xuất rằng các bằng chứng này ủng hộ mô hình thay thế bởi người Châu
Phi, ít nhất là mô hình này đã xảy ra ở Châu Âu [6].
Người Neanderthals sinh sống rộng khắp Châu Âu và khu vực Tây Á
trong khoảng thời gian ít nhất là 10000 năm, tuy nhiên lại không có bằng
chứng khảo cổ nào công nhận có sự giao phối hoặc tương tác nào giữa người
Neanderthals và loài H. sapiens. Tuy nhiên, đến năm 2010, hệ gen đầu tiên
của người Neanderthals được giải mã đã thay đổi hoàn toàn suy nghĩ của các
nhà di truyền học và khảo cổ học. Green và cộng sự đã giải thành công hệ gen
của người Neanderthals với 1.3x coverage sau khi tập hợp các bộ số liệu thu
được từ các mẫu xương khai quật được ở hang Vinija ở Croatia. Hệ gen của
các nhóm người không phải người Phi như người Pháp, Trung Quốc và Papua
New Guinean cho thấy sự tương đồng nhiều hơn 4% với hệ gen này so với hệ
gen của người gốc Phi (San và Yoruba) [7]. Sự giải thích hợp lý nhất cho
quan sát này đó là người Neanderthals và những tổ tiên của loài người hiện
đại đã có hoạt động giao phối với nhau tại khu vực Trung Đông, cũng chính
nơi 2 chủng người giao thoa với nhau. Kết luận trên sau đó cũng được ủng hộ
bởi các nghiên cứu từ những hệ gen hoàn thiện hơn của người Neanderthals
và các hệ gen của người hiện đại. Cho đến thời điểm hiện tại thì toàn bộ các
hệ gen của người Neanderthals thu được đều có sự tương đồng cao hơn với
người không phải gốc Phi so với người gốc Phi. Năm 2014, một hệ gen thu
được từ mẫu hóa thạch có độ tuổi 45000 năm ở vùng Siberia có chứa mẫu
Neanderthals mang hệ gen dài hơn so với người hiện đại ngày nay [8].
Cũng trong năm 2010, các nhà khoa học đã công bố một hệ gen thu
được từ một mẫu xương ngón tay nhỏ tìm thấy được ở hang động Denisova ở
vùng trung nam Siberia. Từ hình thái của chiếc xương cho thấy đây có thể là
của một người hiện đại hoặc là một người Neanderthal nhưng cũng có thể là
một loài người nào đó. Tuy nhiên, sau khi trình tự hệ gen được khai thác, câu
chuyện đã xảy ra theo hướng hoàn toàn khác: mẫu vật đó là người chị em với
nhóm Neanderthals trước khi có sự xuất hiện của người hiện đại – Denisovan
[9]. Sự xuất hiện của một nhóm loài người khác, người Denisovan là nằm
ngoài dự đoán của các nhà khảo cổ học. Người Denisovan đã trở thành một
trong những nhóm người tối cổ đầu tiên được giải mã hệ gen đầy đủ trong khi

15. 5
mà những mẫu hóa thạch còn tồn tại rất hạn chế, gây khó khăn cho phân tích
giải phẫu. Sự hiện diện của người Denisovan cũng là bằng chứng cho thấy
khả năng có những anh em khác của H. sapiens có thể tồn tại đâu đó trên Trái
Đất mà chưa được tìm ra.
1.1.2. Loài người tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam qua
nghiên cứu di truyền khảo cổ
Tại khu vực Châu Á, có rất nhiều bằng chứng cho thấy có ít nhất 2 làn
sóng di dân lớn là căn nguyên của sự đa dạng về sắc tộc ngày nay. Làn sóng
thứ nhất hình thành nên các nhóm người ở Châu Úc, Papuan và các tổ tiên
khác ở Nam Á; sau đó pha trộn với làn sóng thứ hai. Tuy nhiên, chi tiết về sự
có mặt của những cư dân định cư đầu tiên tại đây vẫn chưa được làm sáng tỏ.
Hệ gen đầu tiên có được từ một cá thể thuộc nền văn minh Mal’ta-
Buret’ ở phía nam trung tâm Siberia đã sống cách đây khoảng 24 nghìn năm.
Thông tin di truyền từ mẫu vật cho thấy sự pha trộn mạnh mẽ giữa người
thuộc phía tây lục địa Á-Âu với người Châu Mỹ bản địa nhưng yếu hơn với
người Đông Á và Siberian. Điều này cho thấy có sự khác biệt rất lớn về chủng
người giữa các vùng địa lý ở giai đoạn tiền Palaeolithic so với ngày nay. Hệ
gen thứ hai chính là hệ gen của người Denisovan với sự tương đồng cân bằng
giữa người Tây Âu, Đông Á và Châu Úc. Từ số liệu của 14 cá thể có độ tuổi
khoảng 36 – 38 nghìn năm tại Nga cho thấy sự liên kết với người Tây Âu
nhưng không gần gũi với người Đông Á [10]. Cho đến thời điểm hiện tại, thì
khu vực Châu Á đã ghi nhận đến bốn loài người khác nhau cùng sinh sống tại
khu vực này, cho thấy sự đa dạng và phức tạp của khu vực. Người H. erectus
có họ hàng gần gũi với người Châu Phi đã đến đây từ những ngày đầu của
lịch sử loài người và rất có thể sinh trưởng và tồn tại ở Đông Nam Á cho đến
thời kỳ cuối của Pleitocence, thời điểm xuất hiện của loài người hiện đại.
Khoảng một triệu năm trước, những người H. erectus đã đến hòn đảo Flores,
nơi sinh ra loài người khác H. floresiensis.
Lịch sử cận đại tại khu vực Đông Nam Á, cụ thể là tại Việt Nam qua
các nghiên cứu về thông tin di truyền còn rất nhiều khoảng trống chưa được
khám phá. Số lượng nghiên cứu còn ít, số hệ gen thu được cũng còn nhiều
hạn chế. Nghiên cứu về quá trình tiến hóa của loài người cần tiến hành dựa
trên cả các bằng chứng lịch sử và nghiên cứu thống kê. Trong một nghiên cứu
năm 2018 của McColl và cộng sự, giải trình tự genome của các mẫu hài cốt

16. 6
thu thập được thuộc giai đoạn Đông Sơn (Núi Nấp, 2378 đến 2041 năm trước)
cho thấy sự tương đồng cao với nhóm Dai, Amis và Kradai tại Thái Lan hiện
tại nhưng có sự pha trộn vốn gen của nhóm nam Trung Quốc. Trong khi đó,
những mẫu thu thập được từ giai đoạn sớm hơn, khoảng cuối thời đại đồ đá
mới đến đầu thời đại đồ đồng (Hòn Hai Cô Tiên – Quảng Ninh và di tích Mái
Đá Điều – Thanh Hóa, khoảng 4000 năm trước) lại không có sự pha trộn với
nhóm gen nam Trung Quốc. Trong một nghiên cứu khác gồm các mẫu có
niên đại khoảng 4080-3695 năm từ di chỉ khảo cổ Mán Bạc – Ninh Bình,
cũng là nơi phát hiện những ông tổ nghề gốm Bát Tràng đầu tiên, cũng cho
thấy sự gần gũi về di truyền với người Nam Á hiện đại. Những thông tin thu
thập được tối đa từ những bộ hài cốt có thể cung cấp bằng chứng về chủng
người, lối sống của họ, cũng có thể tìm kiếm nguyên nhân dẫn đến cái chết,
ảnh hưởng của điều kiện tự nhiên thời điểm đó qua các mẫu vi sinh vật thu
được qua vết phân và những câu chuyện xung quanh khi người đó còn sống.
Các mẫu hài cốt có tuổi thọ lên đến hàng nghìn năm cũng là thách thức cho
quá trình nghiên cứu khai thác thông tin từ hệ gen của họ, khi mà hầu hết mẫu
đã bị phân hủy. Có thể thấy ứng dụng của công nghệ giải trình tự đã và đang
cung cấp những bằng chứng rất có giá trị để tái hiện bức tranh về lịch sử của
loài người nói chung và loài người tại Việt Nam nói riêng.
1.1.3. Các chỉ thị di truyền sử dụng trong nghiên cứu mẫu xương
khảo cổ
Các nghiên cứu khoa học về lịch sử loài người sử dụng các chỉ thị di
truyền rất đa dạng (bảng 1). Một trong số chỉ thị đầu tiên được sử dụng đó là
các nhóm máu ABO và các đồng phân protein. Mặc dù nghiên cứu về đa dạng
của loài người trở nên phổ biến từ nửa thế kỷ trước, phân tích dựa trên DNA
thu hút được sự chú ý và được phát triển bởi giới khoa học và đến năm 1987
thì cây mtDNA đầu tiên đã được mô tả với gốc là người châu Phi. Đã có rất
nhiều nghiên cứu khác nhau về mtDNA và di truyền theo dòng mẹ liên tiếp
được tiến hành nhằm trả lời các câu hỏi về lịch sử và khảo cổ học. Ngay sau
đó, hướng nghiên cứu trên vùng không trao đổi chéo trên nhiễm sắc thể
(NST) Y – non-recombining portion of the Y chromosome (NRY) cũng tham
gia vào dòng chảy đó của khoa học và cung cấp cách tiếp cận từ di truyền
theo dòng cha. Mặc dù các nghiên cứu di truyền đơn dòng trên đều rất quý giá
và thu hút, cũng như đã có hàng chục nghìn ty thể và NRY đã được phân tích

17. 7
cặn kẽ, nhưng điều quan trọng là các nghiên cứu đó bị giới hạn ở những bức
tranh nhỏ từ tổng thể thông tin có thể có từ hệ gen của loài người. Thực tế là,
để kiểm định được các giả thuyết về các mô hình thì cần thiết phải dựa trên
phân tích thống kê của cùng lúc nhiều locus khác nhau.
Bảng 1. Một số loại chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu lịch sử loài
người
Chỉ thị
Ứng dụng và ưu
điểm
Giới hạn
mtDNA
Không có hiện
tượng trao đổi chéo làm
thay đổi cấu trúc khi dựng
cây phát sinh chủng loại -
Có khả năng phân biệt các
quần thể tốt hơn
autosomal DNA - Chi phí
thấp - Số bản copy trong
một tế bào lớn vì vậy có
thể sử dụng được ở các
mẫu cổ đại, đã bị phân hủy
mạnh
Thông tin di
truyền chỉ trên dòng mẹ
nên bị giới hạn về
thông tin khi nghiên
cứu diễn biến di truyền
của quần thể; Chịu ảnh
hưởng lớn bởi chọn lọc
tự nhiên; Tốc độ đột
biến không có tính ổn
định mà có tính biến
đổi cao;
NRY
Không có hiện
tượng trao đổi chéo làm
thay đổi cấu trúc khi dựng
cây phát sinh chủng loại -
Có khả năng phân biệt các
quần thể tốt hơn
autosomal DNA - Chi phí
thấp - Số bản copy trong
một tế bào lớn vì vậy có
thể sử dụng được ở các
mẫu cổ đại, đã bị phân hủy
mạnh
Thông tin di
truyền chỉ trên dòng
cha nên bị giới hạn về
thông tin khi nghiên
cứu diễn biến di truyền
của quần thể; Chịu ảnh
hưởng lớn bởi chọn lọc
tự nhiên; Tốc độ đột
biến không có tính ổn
định, có tính biến đổi
cao; Có thể dẫn đến sai
số do nghiên cứu trên
những điểm SNPs đặc

18. 8
trưng
Autosomal STRs
Có thể nghiên cứu
hàng trăm các STR độc
lập cùng lúc trên nhiều cá
thể do đó làm giảm sai số
ngẫu nhiên; Thông tin hữu
ích cho nghiên cứu các sự
kiện di nhập quần thể cũng
như có thể là chỉ thị để
phân biệt các quần thể
tương đồng cao
Không áp dụng
được cho nghiên cứu
các sự kiện di nhập gen
theo thời gian; - tốc độ
đột biến có sai số lớn
SN
Ps
Micr
oarrays
Có thể nghiên cứu
cùng lúc hàng trăm đến
hàng nghìn SNP trong
cùng 1 thí nghiệm; Chỉ thị
hữu hiệu cho nghiên cứu
cấu trúc quần thể
Tính chính xác
phụ thuộc vào phương
pháp nghiên cứu;
Không hiệu quả đối với
các quần thể có sự đa
dạng cao
Seco
nd
generation
sequencing
Khai thác số liệu
trình tự lớn, có thể bao
phủ được toàn bộ các vùng
gen mà phương pháp
Sanger gặp hạn chế; Đầu
vào lớn nhưng không cần
phải qua bước khuếch đại
gen (PCR); Giá thành trên
mỗi base rẻ
Sai số lớn hơn so
với Sanger; Có thể có
trường hợp kết quả bị
định hướng bởi các
trình tự được ưu tiên
đọc trong quá trình giải
trình tự; Các đoạn đọc
ngắn trở thành trở ngại
khi nghiên cứu các
điểm đa dạng
Thir
d
generation
sequencing
Có thể đọc đoạn dài
(>10kb); Một số phương
pháp có thể đọc trình tự
từng tế bào; Các đoạn đọc
dài dễ dàng thực hiện các
bước lắp ráp sau đọc trình
Giá thành trên
mỗi base cao hơn so
với NGS thế hệ 2; Đòi
hỏi các công cụ phân
tích tin sinh chuyên
biệt

19. 9
tự mà không cần trình tự
tham chiếu
Vào đầu những năm 2000, các cách tiếp cận mới cho nghiên cứu đa
dạng di truyền loài người xuất hiện, đó là dựa trên các short tandem repeat
(STR), một loại chỉ thị nằm rải rác trên toàn bộ hệ gen. Với sự phát triển của
công nghệ lai DNA hybridization array, công nghệ ban đầu được sử dụng cho
xây dựng bản đồ các allele bệnh trong các nghiên cứu GWAS, giờ đây được
sử dụng để nghiên cứu hàng trăm nghìn SNPs. Mặc dù có khả năng phân tích
cấu trúc quần thể loài người ở mức độ phân giải lớn hơn cả ở trên một vùng
hay trên nhiều vùng khác nhau trên genome, thì chỉ thị đó bị giới hạn khi áp
dụng vào nghiên cứu quá trình tiến hóa dưới tác động của các dạng đa dạng di
truyền khác nhau. Những giới hạn đó bắt nguồn từ việc thiết kế arrays, khi mà
chỉ một số lượng nhất định các chỉ thị SNP được thiết kế cho một kích thước
cá thể giới hạn và từ một số quần thể nhất định, do đó có thể dẫn đến sự thiếu
sót khi áp dụng cho nghiên cứu các quần thể trên toàn thế giới.
Công nghệ giải trình tự đoạn ngắn thế hệ mới đã vượt qua nhiều giới
hạn của công nghệ cũ. Việc thu thập các đoạn DNA từ khắp nơi trong hệ gen
cho phép tăng khả năng nghiên cứu quá trình di nhập gen. Tuy nhiên, công
nghệ này phải đối mặt với các thách thức về mặt phân tích và kiểm định chất
lượng. Cụ thể, thế hệ giải trình tự thứ 2 bị lỗi đọc nhiều hơn so với giải trình
tự Sanger, và các phương pháp nhằm giải mã toàn bộ thông tin lịch sử của hệ
gen vẫn còn đang được phát triển.
Ty thể là các bào quan nằm ngoài nhân tế bào và mang hệ gen riêng,
độc lập với hệ gen trong nhân tế bào. Hệ gen ty thể là dạng tròn, mạch đơn, có
kích thước khoảng 16.5 kb, có số lượng copy lớn gấp hàng trăm lần hệ gen
nhân, chỉ được di truyền từ mẹ sang con [11]. Sự thay đổi trình tự xảy ra trên
hệ gen ty thể là do quá trình đột biến, không phải kết quả của quá trình trao
đổi chéo. Đột biến trên hệ gen ty thể có tốc độ đột biến cao, thường là đột
biến dạng trung tính và phát sinh gần như cùng thời điểm với việc sự dịch
chuyển địa điểm địa lý của con người. Những đột biến đó tạo thành các
haplogroup, có tính phân biệt vùng miền cao. Do đó, mtDNA cũng là chỉ thị
tốt cho truy xuất nguồn gốc do khả năng phân biệt theo địa lý và sự khác biệt
giữa các quần thể rõ ràng. Từ những ưu điểm trên, mtDNA được sử dụng

20. 10
rộng rãi trong các nghiên cứu về lịch sử tiến hóa, di truyền quần thể, di truyền
y sinh, di truyền tiến hóa hay khoa học hình sự [12].
Lĩnh vực nghiên cứu dựa trên mtDNA bắt đầu từ năm 1987 có ảnh
hưởng lớn đến các cuộc bàn luận về nguồn gốc con người, khi mà mtDNA có
thể giải quyết những giới hạn của các bằng chứng hóa thạch. Báo cáo về cây
phát sinh chủng loại dựng từ tất cả trình tự mtDNA của con người với gốc là
tổ tiên châu Phi, người đã sống tại đó khoảng 200.000 năm trước, đã củng cố
mạnh mẽ hơn mô hình RAO và khởi sinh ra cuộc tranh luận cho 2 thập kỷ sau
đó. MtDNA có nguồn gốc từ châu Phi tại thời điểm hiện tại nằm cùng một
nhánh như được mô tả trong báo cáo trên, và có sự đa dạng lớn hơn giữa nội
tại các mtDNA của châu Phi hơn là nhóm khác. Mặt khác, nghiên cứu dựa
trên NRY hay các loci trên nhiễm sắc thể thường cũng đồng tình với mô hình
này. MtDNA của người cổ ở nhiều vùng địa lý rộng lớn đã được tách chiết và
giải trình tự cho thấy sự khác biệt rõ ràng về mặt di truyền giữa người hiện đại
và người Neaderthals [10].
Nghiên cứu sử dụng chỉ thị mtDNA ở đối tượng mẫu xương khảo cổ
được sử dụng khá rộng rãi. Năm 2012, nhóm tác giả Fu và cộng sự đã công
bố về thông tin di truyền, trong đó có từ hệ gen ty thể của mẫu xương người
khoảng 40.000 năm tuổi ở động Tianyuan, Trung Quốc, cho thấy mẫu vật này
thuộc quần thể người cổ đại mà là tổ tiên của rất nhiều nhóm người hiện đại ở
Châu Á và Châu Mỹ sau này.
1.1.4. Ứng dụng công nghệ giải trình tự gen trong nghiên cứu các
mẫu khảo cổ
Giải trình tự toàn bộ hệ gen các nhóm người đã tuyệt chủng
Năm 2010, một nhóm các nhà khoa học đã tách chiết thành công DNA
từ xương răng và công bố các genome lắp ráp đầu tiên của hai nhóm thuộc chi
Homo đã tuyệt chủng: người Neanderthals và một nhóm chưa được biết tới
trước đó, gọi là Denisova (lấy theo tên hang động thuộc dãy Altai của Nga).
Có 2 phát hiện lớn đó là: genome của người Neandethals và Denisovan có sự
gần gũi lớn hơn so với nhóm Homo sapien hiện đại – AMHs; và tất cả non-
African chia sẻ khoảng 1-4% nguồn gen của người Neanderthals, người địa
trung hải – Melanesians có khoảng 3,5% genome giống với nhóm Denisovan.

21. 11
Sử dụng kết hợp phương pháp phân tích D-statistic và LD, một nghiên
cứu đã chứng mình rằng nhiều vùng gen của người Đông Á tiếp nhận nguồn
gen từ người Neanderthals hơn người European. Tương tự nghiên cứu đó, quá
trình DNA của người Denisovan đi vào hệ gen của các quân thể người châu Á
là rất phức tạp. Khoảng cách địa lý từ hang động Denisova đến Đông Nam Á
là rất xa, nhưng có khả năng là một giống loài Denisovan tổ tiên nào đó đã
vượt qua khoảng cách đó.
Nghiên cứu làn sóng di cư ở Đông Nam Á
Đông Nam Á là nơi có sự đa dạng về di truyền và ngôn ngữ của loài
người, nhưng các chi tiết về sự di chuyển dân cư trong quá khứ trong khu vực
không được biết đến nhiều. Nghiên cứu của Lipson và cộng sự 2018 báo cáo
dữ liệu DNA cổ đại trên toàn bộ bộ gen của mười tám cá thể Đông Nam Á
trải dài từ thời kỳ đồ đá mới đến thời đại đồ sắt (4100–1700 năm trước).
Những người nông dân đầu tiên từ Mán Bạc ở Việt Nam thể hiện sự pha trộn
giữa Đông Á (miền nam Trung Quốc) và đặc điểm tổ tiên phân biệt sâu sắc ở
Đông Á (săn bắn hái lượm) của những người nói tiếng Nam Á
(Austroasiatic), với tổ tiên tương tự ở xa về phía nam như Indonesia, cung cấp
bằng chứng cho sự lan rộng ban đầu của Ngôn ngữ Nam Á. Vào thời kỳ đồ
đồng, theo mô hình song song với châu Âu, các địa điểm ở Việt Nam và
Myanmar cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với các nhóm đa số ngày nay, phản ánh
lượng người di cư bổ sung đáng kể.
Mặt khác, nghiên cứu của [13] cho thấy rằng các bộ gen ban đầu trong
bối cảnh săn bắn hái lượm của người Hoabinhian ở Lào và Malaysia có mối
quan hệ di truyền với những người Onge săn bắn hái lượm từ quần đảo
Andaman (Ấn Độ), trong khi nông dân Đông Nam Á thời kỳ đồ đá mới, có sự
di truyền của tổ tiên Đông Á riêng biệt liên quan đến các quần thể nói tiếng
Nam Á ngày nay. Hơn nữa, cũng xác định hai sự kiện di cư tiếp theo, phù hợp
với sự mở rộng của những người nói các ngôn ngữ Nam đảo vào vùng đảo
Đông Nam Á và sự mở rộng của người Đông Á vào miền Bắc Việt Nam.

22. 12
1.1.5. Phân tích hệ gen ty thể trong nghiên cứu các mẫu khảo cổ
Cấu trúc hệ gen ty thể
Ty thể có hệ gen riêng, mtDNA nằm trong chất nền ty thể. Đối với các
tế bào động vật, mỗi bào quan thường chứa một số bản sao giống hệt nhau
của mtDNA [14–17].
Hình 1.1 Mô hình mtDNA ở người
Ty thể đóng một vai trò quan trọng trong cung cấp năng lượng tế bào.
Các bào quan chứa bộ gen của riêng chúng, độc lập với hệ gen nhân, với mã
di truyền đã được sửa đổi. Bộ gen ty thể của động vật có vú chỉ được di
truyền qua dòng mẹ. mtDNA của con người là một phân tử mạch kép, hình
tròn có kích thước 16569 bp và chứa 37 gen mã hóa cho hai rRNA, 22 tRNA
và 13 polypeptide. Các polypeptit mã hóa mtDNA đều là các tiểu đơn vị của
phức hợp enzym của hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa. Các cơ chế cơ bản
của sự biểu hiện gen ty thể đã được tìm ra. Các trình tự mtDNA tác động cis
đã được phân loại bởi so sánh trình tự, nghiên cứu lập bản đồ và phân tích đột
biến cả trong phòng thí nghiệm và ở những bệnh nhân có đột biến mtDNA.
Việc xác định đặc tính của các yếu tố chuyển đổi đã được chứng minh là khó
hơn nhưng một số enzym quan trọng tham gia vào quá trình sao chép
mtDNA, phiên mã và tổng hợp protein hiện đã được xác định về mặt hóa sinh
và một số đã được nhân bản.
Các phân tích cấu trúc và sinh hóa cho thấy rằng sự sao chép mtDNA
sảy ra bằng cách dịch chuyển sợi DNA. Trong mô hình này, sự sao chép
mtDNA của sợi dẫn trước (leading strand), bắt đầu tại một vị trí cụ thể được

23. 13
gọi là OH trong vùng kiểm soát không mã hóa được gọi là D-loop. Khi sự sao
chép của sợi dẫn đầu đã đạt đến khoảng 2/3 bộ gen, nguồn gốc của sự sao
chép (OL) trên sợi trễ (lagging strand) sẽ lộ ra, cho phép sự tổng hợp sợi trễ
xảy ra theo hướng ngược lại.
Vùng không mã hóa chính (NCR) của mtDNA người trải dài khoảng
1,1 kb giữa các gen mt-tRNA của phenylalanin và proline. NCR chứa các chất
xúc tác HSP và LSP để phiên mã các sợi nặng và sợi nhẹ, cũng như nguồn
gốc của sự sao chép sợi nặng, OH. Một phần lớn của NCR thường kết hợp sợi
DNA thẳng thứ ba dài khoảng 650 nucleotide, tạo thành cấu trúc vòng D ổn
định. Sợi bổ sung này được gọi là DNA 7S, dựa trên các đặc tính lắng đọng
của nó. Thuật ngữ 'NCR' và 'D-loop' thường được sử dụng thay thế cho nhau
trong tài liệu, mặc dù điều này chỉ mang tính tương đối vì vùng D-loop không
kéo dài toàn bộ NCR và chỉ một tỷ lệ phân tử mtDNA chứa D-loop tại bất kỳ
thời điểm nào. Vùng D-loop kéo dài từ xung quanh OH (ở đầu 5′ của DNA
7S) đến trình tự liên kết kết thúc (TAS) gần với gen tRNAPro (ở đầu 3′ của
DNA 7S) [18]. Cấu trúc D-loop ổn định dường như là một đặc điểm của nhiều
mtDNA ở động vật, kể từ đó đã được quan sát thấy ở các loài khác bao gồm
người, thỏ, bò và cóc có móng - Xenopus [19–22]. Tỷ lệ phân tử mtDNA có
chứa D-loop tại bất kỳ thời điểm nhất định nào dao động từ khoảng 10%
trong tế bào người được nuôi cấy, lên đến khoảng 90% trong tế bào trứng
Xenopus [20, 21, 23]. Sự hình thành và ổn định của D-loop phụ thuộc vào các
yếu tố trình tự trong NCR, và do đó, các sinh vật được đề cập ở trên giữ lại
một cấu trúc NCR tương tự. Thay vào đó, mtDNA của những sinh vật này
chứa vùng kiểm soát ‘giàu A + T’, bao gồm khoảng 95% dư lượng adenine và
thymine [24, 25].
Được tìm thấy trong vùng D-loop là ba vùng siêu biến (HV1, HV2 và
HV3), là những vùng không mã hoá chính của phân tử [26]. Những vùng này
có tính đa hình cao ở người, do đó có mức độ phân biệt cao giữa các cá thể
với nhau. Phân tích các vùng này thường cung cấp thông tin quan trọng về sự
đa dạng di truyền và nguồn gốc của quần thể. Việc đánh giá các biến thể
mtDNA đặc hiệu thông qua giải trình tự HV1 và HV2 trong vùng kiểm soát
mtDNA đã trở nên phổ biến trong thập kỷ qua [27]. Sự kết hợp của cả HV1
và HV2 rất hữu ích cho các mục đích pháp y [28]. Vì vậy, điều quan trọng đối
với mọi quốc gia là phải có cơ sở dữ liệu về các biến thể mtDNA của họ.

24. 14
Nghiên cứu mtDNA trong khảo cổ
Vì tinh trùng thiếu ty thể nên tất cả mtDNA đều được di truyền từ mẹ.
Với mọi thế hệ, các bà mẹ truyền mtDNA của họ cho con trai và con gái của
mình. Rất hiếm có cơ hội xảy ra đột biến trong mtDNA, chẳng hạn như thay
đổi nucleotide (ví dụ: “T” cho “C”). Những đột biến này chỉ ảnh hưởng đến
một phần tổng thể của mtDNA, một phần thay đổi trong số ∼16.500
nucleotide. Tuy nhiên, các đột biến tích lũy theo thời gian, truyền từ mẹ sang
con gái trong dòng mẹ. Do đó, một đột biến trong mtDNA của tổ tiên họ
ngoại tồn tại trong tất cả con cháu, đánh dấu một cách hiệu quả dòng dõi mẹ.
Sự kế thừa tương đối đơn giản này của mtDNA và tích lũy các đột biến dọc
theo dòng mẹ cung cấp một khuôn khổ đơn giản để đặt câu hỏi về lịch sử của
dòng mẹ liên kết di vật cổ đại với con người hiện nay. Có lẽ ví dụ nổi tiếng
nhất là mtDNA cổ đại từ một mẫu vật của người Neanderthal ở châu Âu được
phát hiện cách đây 150 năm. Các nhà nghiên cứu tại Viện Max Planck đã cố
gắng tách chiết mtDNA từ mẫu này, một bước đột phá kỹ thuật vào thời điểm
đó [29]. Hơn nữa, dữ liệu từ mẫu đơn này có tiềm năng thay đổi hiểu biết của
chúng ta về lịch sử loài người. Nếu phụ nữ Neanderthal đóng góp vào vốn gen
người, thì mtDNA kiểu Neanderthal sẽ tồn tại trong một số mẫu người. Tuy
nhiên, trình tự mtDNA của người Neanderthal này không mang các biến thể
đánh dấu các dòng dõi đã biết của con người và do đó, nằm ngoài sự đa dạng
mtDNA của con người. Có thể hoặc không có sự kết hợp gen của người
Neanderthal với tổ tiên của người hiện đại hoặc nếu có, mtDNA của những
người Neanderthal đó không được đại diện trong vốn gen người hiện nay.
Ngày nay, chúng ta biết rằng lời giải thích thứ hai là đúng, nhờ vào trình tự
toàn bộ bộ gen từ nhiều người Neanderthal [30–32]. Trên thực tế, mtDNA của
người Neanderthal có thể đã được xâm nhập từ chính một hominin châu Phi
không xác định [33]. Tuy nhiên, dựa trên những tiến bộ kỹ thuật từ nhóm
Max Planck và những người khác, việc tách chiết và giải trình tự mtDNA cổ
đại từ các mẫu từ các khu vực địa lý và thời kỳ khác nhau đã trở nên tương
đối phổ biến. Nghiên cứu mtDNA cổ đại đã cung cấp một bước tiến đáng kể
trong việc bổ sung cho hồ sơ khảo cổ học. Nói chung, những nghiên cứu này
đo tần số của các dấu hiệu di truyền ty thể cụ thể trong các môi trường khảo
cổ nhất định và so sánh chúng với các tần số được ghi lại trong các quần thể
khảo cổ học và còn tồn tại khác. Kết quả của những nghiên cứu này cho thấy

25. 15
rằng các tập hợp những điểm dị biệt giữa những sinh vật đồng loại liên tục
xác định sự biến đổi di truyền của con người mà không có biên giới cứng rõ
ràng; bốn tần số alen của các biến thể mtDNA thay đổi dần dần theo thời gian
và địa lý, được định hình bởi dòng gen liên tục giữa các quần thể lân cận [34,
35]. Dữ liệu mtDNA cổ đại đã cung cấp một chiều thời gian cho quan sát này
vì rõ ràng rằng sự biến đổi mtDNA cũng mang tính khí hậu theo thời gian,
thay đổi thông qua sự trôi dạt và dòng gen. Nó tiếp tục khẳng định sự hiểu
biết đã có từ nhiều thập kỷ trong lĩnh vực này rằng các phạm trù xã hội truyền
thống, ví dụ: dân tộc, quốc tịch, chủng tộc, không có ý nghĩa về mặt di truyền
[36]. Liên quan nhiều hơn đến các câu hỏi khảo cổ học, phân tích mtDNA
cũng đã ghi lại sự di chuyển của con người và sự mở rộng dân số về mặt địa
lý. Ví dụ, một thành công quan trọng của phương pháp này là quan sát thấy
rằng một tập hợp con của các biến thể mtDNA tiến hóa ở châu Á đã được
chuyển đến châu Mỹ [37].
1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Đông Nam Á là một trong những khu vực địa lý có lịch sử hình thành
và phát triển của loài người rất đa dạng và phức tạp. Dựa trên bằng chứng
khảo cổ, con người đã xuất hiện tại khu vực này từ hơn một triệu năm trước.
Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á, là quốc gia đa sắc tộc và cũng là
mái nhà chung của 5 nhóm ngữ hệ lớn nhất khu vực là ngữ hệ Nam Á, Nam
Đảo, Thái – Kadai, Mông - Dao và Hán – Tạng. Quốc gia này nằm tại vị trí
địa lý đặc biệt, phía bắc giáp Trung Quốc, phía tây giáp Lào, phía nam giáp
Campuchia và phía đông có đường biển trải dài từ Bắc vào Nam, cũng là cửa
ngõ nối Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, do đó có sự giao thoa về văn hóa
và sắc tộc mạnh mẽ. Con người đã đến định cư tại vùng đất Việt Nam từ lâu
đời, dựa trên một số dấu vết của những Homo sp. thì dấu vết của những con
người đầu tiên tại Việt Nam đã có từ khoảng nửa triệu năm trước – nửa cuối
giai đoạn Pleistocene. Đây cũng là nơi ghi nhận sự hình thành của những xã
hội loài người nguyên thủy đầu tiên, cũng là một trong số địa điểm khởi sinh
nền nông nghiệp trồng lúa nước. Ngày nay, Việt Nam cũng là mái nhà chung
của 54 dân tộc anh em, tạo ra một quần xã người đa dạng và phức tạp. Nghiên
cứu thông tin di truyền dựa trên chỉ thị SNPs của các nhóm dân tộc lớn hiện
sinh sống tại Việt Nam cũng cho thấy sự pha trộn vốn gen giữa các nhóm dân
tộc, đặc biệt là các nhóm thuộc ngữ hệ Nam Á, Hán – Tạng, Mông – Dao và

26. 16
Thái – Kadai. Mặt khác, nhóm Nam Đảo lại có sự phân tách rõ ràng với các
nhóm còn lại. Ngoài ra, các nghiên cứu sử dụng chỉ thị STR cũng cho thấy sự
đa dạng trên [38–42].
Cho đến thời điểm hiện tại, các mẫu xương người khảo cổ chỉ được
nghiên cứu về mặt khảo cổ học mà chưa có một nghiên cứu di truyền nào
được tiến hành tại Việt Nam. Các mẫu khảo cổ có niên đại lớn, có mẫu thuộc
văn hóa Hòa Bình có niên đại khoảng 23.000 năm tuổi, hay những mẫu thu
được của ngôi mộ thời Đông Sơn (sau thời kỳ đồ đá mới đến thời kỳ đồ
Đồng) ở Sơn La. Bộ hài cốt trong ngôi mộ còn nguyên vị trí, còn nguyên hình
thái hộp sọ, xương còn màu trắng. Tuy nhiên, các bằng chứng chứng minh
lịch sử của con người sinh sống tại Việt Nam lại hạn chế về cả số lượng các
bản ghi chép, đến các bằng chứng khảo cổ học và đặc biệt là các nghiên cứu
di truyền, từ đó dẫn đến nhiều tranh cãi. Đơn cử như trường hợp các mẫu
xương thu được tại làng Động Xá, huyện Kim Động, tỉnh Hưng Yên. Năm
2004, hoạt động đào kênh mương phục vụ nước tưới tiêu cho nông nghiệp của
người dân địa phương đã tình cờ phát hiện được một khối lượng rất lớn các di
chỉ khảo cổ với khoảng 100 ngôi mộ cổ, đặc biệt có một mộ thuyền được xác
định là cổ nhất Đông Nam Á với bộ hài cốt được phủ vải liệm và mai táng với
cùng nhiều cổ vật khác, trong đó có trống đồng - đặc trưng của văn hóa Đông
Sơn. Dựa trên xác định đặc điểm các hoa văn trang trí có trên các cổ vật, cùng
với quá trình xác định tuổi bằng đồng vị phóng xạ 14C cho thấy, các di tích
có độ tuổi khoảng 2.100 năm tuổi (khoảng năm 60 – 70 TCN), thuộc nền văn
hóa Đông Sơn. Từ hình thái xương của các bộ hài cốt có sự tương đồng lớn
với các bộ hài cốt là người Thái – Kadai cổ phát hiện được ở Quảng Tây,
Trung Quốc. Nếu thực sự, bộ hài cốt trong ngôi mộ thuyền có mối tương quan
với Thái – Kadai thì sẽ là một bằng chứng rất quan trọng đối với lịch sử của
nhóm Thái – Kadai tại Việt Nam. Mặc dù vậy, cho đến thời điểm hiện tại
chưa có nghiên cứu nào về mối liên hệ giữa những bộ hài cốt tại Động Xá và
nhóm Thái – Kadai hiện đại, cụ thể là nhóm sinh sống tại Việt Nam về mặt di
truyền. Hiện trạng này cũng gặp ở các mẫu khảo cổ khác như mẫu xương
trong mộ thuyền được mai táng ở hang đá vôi tại xã Nà Lồi, huyện Vân Đồn,
tỉnh Sơn La; hay mẫu xương phát hiện được tại di tích Bãi Cọc trong chiến
thắng lẫy lừng “trận Bạch Đằng”. Những mẫu vật trên được lưu trữ dải dác tại
Viện Khảo cổ học Việt Nam và Trung tâm Tiền sử Đông Nam Á. Những mẫu

27. 17
đề cập ở trên đều khác với các mẫu đã được tiến hành bởi các nhóm nghiên
cứu nước ngoài đã công bố. Trong đó, phải đề cập đến nghiên cứu của nhóm
tác giả [43] cho thấy, các mẫu hài cốt thu thập được thuộc giai đoạn Đông Sơn
(Núi Nấp, 2378 đến 2041 năm trước) có sự tương đồng cao với nhóm Dai, Amis
và Kradai tại Thái Lan hiện tại nhưng có sự pha trộn vốn gen của nhóm nam
Trung Quốc. Trong khi đó, những mẫu thu thập được từ giai đoạn sớm hơn
(Hoabinhian), khoảng cuối thời đại đồ đá mới đến đầu thời đại đồ đồng (Hòn Hai
Cô Tiên – Quảng Ninh và di tích Mái Đá Điều – Thanh Hóa, khoảng 4000 năm
trước) lại không có sự pha trộn với nhóm gen nam Trung Quốc. Các kết quả trên
cũng tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của nhóm [44] sau đó, đó là các
mẫu có niên đại khoảng 4080-3695 năm từ di chỉ khảo cổ Mán Bạc – Ninh Bình,
cũng là nơi phát hiện những ông tổ nghề gốm Bát Tràng đầu tiên, cũng cho thấy
sự gần gũi về di truyền với người Mlabri, Campuchia hiện đại và nhóm nam
Trung Quốc.

28. 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Người Việt cổ sinh sống trong giai đoạn hậu thời kỳ đồ đá
mới
Mẫu xương khảo cổ được cung cấp bởi Viện khảo cổ và Trung tâm
Tiền sử Đông Nam Á được sử dụng để tách chiết DNA ty thể. Ngoài ra, luận
văn có sử dụng các trình tự mtDNA của người Việt cổ thuộc giai đoạn hậu
thời kỳ đồ đá mới của các nghiên cứu đã được công bố trước đó [44].
2.1.2. Người Việt hiện đại
Các trình tự toàn bộ mtDNA của người Việt hiện đại (bao gồm một số
dân tộc) đại được đăng trên GenBank [45].
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết mtDNA và giải trình tự bằng hệ thống máy Ion
S5™ (Thermo Fisher Scientific)
Tách chiết mtDNA
Mẫu xương khảo cổ (răng và xương) được nghiền thành bột, bổ sung
700 µl EDTA 0.5M (pH 8.3) và ủ 37 độ C trong 24-48h. Thêm 20 µl
Proteinase K, ủ ở 56 độ C trong 3h. Ly tâm 6000 rpm trong 4 phút, chuyển
200 µl dịch nổi sang ống EZ1 đựng mẫu. Tách chiết mtDNA bằng bộ kit
chuyên dụng EZ1 DNA Investigator Kit tự động với máy EZ1 advanced XL
[46]. Các mẫu tham chiếu được tách chiết bằng Chelex® [47].
Giải trình tự Sanger
Giải trình tự Sanger được thực hiện trên thiết bị 3500xL Genetic
Analyzer sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems, TX, USA). Đối với các mẫu xương, cặp mini-primer được phát
triển bởi Phòng thí nghiệm Nhận dạng DNA của Lực lượng Vũ trang
(AFDIL) được sử dụng để giải trình tự hai vùng overlapping ở HV1 (vùng
PS1: F15989 5’-CCCAAAGCTAAGATTCTAAT 3’, R16251 5’-
GGAGTTGCAGTTGATGT 3’, và vùng PS2: F16190 5’-
CCCCATGCTTACAAGCAAGT 3’, R16410 5’-

29. 19
GAGGATGGTGGTCAAGGGAC 3’) [48]. Đối với mẫu đối chứng, chỉ có
mồi F15989 và R16410 được sử dụng. Dữ liệu thu được từ giải trình tự
Sanger được phân tích thông qua phần mềm Sequencher v5.4.6 (GeneCodes,
MI, USA). Sự thay đổi của các base so với trình tự tham chiếu đã có sửa đổi
của Cambridge (rCRS) [26] được lưu trữ lại.
Định lượng DNA
Định lượng mtDNA được tiến hành bởi in-house qPCR sử dụng các
mồi đặc hiệu cho đoạn 170 bp ở vùng HV1 và đầu dò huỳnh quang TaqMan.
Trình tự oligonucleotide lần lượt là: mồi xuôi F15989 5’-
CCCAAAGCTAAGATTCTAAT-3’, mồi ngược R16158 5’-
TACTACAGGTGGTCAAGTAT-3’, và đầu dò tự thiết kế 5’- FAM
CCCATCAACAACCGCTATGTATT-MGB- 3’. Phản ứng khuếch đại qPCR
được thực hiện với tổng 20 µl phản ứng bao gồm 1X Go Taq Probe qPCR
Master Mix (Promega, WI, USA), 500 nM mỗi mồi, 250 nM mẫu dò, và 2 µl
DNA đã được tách chiết. Chu kỳ gia nhiệt được bắt đầu bởi 1 chu kỳ 95°C
trong 2 phút, sau đó là 40 chu kỳ 95°C trong 15 s, và một chu kỳ nhiệt cuối
cùng 60°C trong 1 phút. Dịch pha loãng 10 lần của 443 base pairs (bp) tinh
sạch của sản phẩm PCR thuộc vùng HV1 (từ 0.006 pg đến 60 pg, xấp xỉ
6.58×104 to 6.58×108 bản sao) được sử dụng để dựng đường chuẩn. Hai mẫu
đối chứng không có mạch khuôn cũng được thêm vào thí nghiệm.
Chuẩn bị thư viện và giải trình tự
Chuẩn bị thư viện của các mẫu được thực hiện sử dụng Precision ID
mtDNA Control Region Panel và Precision ID Library Kit 2.0 (Thermo Fisher
Scientific, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cho mỗi mẫu giải
trình tự, hai PCR gộp mẫu được tiến hành để khuếch đại toàn bộ CR (control
region) của DNA ty thể. Phương pháp “two-in-one” được áp dụng cho các
mẫu xương sử dụng 6 μl DNA được tách chiết như mạch khuôn cho khuếch
đại. Hai phản ứng multiplex PCR được thực hiện với một thể tích 20 μl theo
sau đó là pooling nửa thể tích của cả pools để xây dựng thư viện. Trong khi,
phương pháp tiết kiệm (“conservative” method) được sử dụng cho các mẫu
tham chiếu đối chứng, khi tổng 10 μl của sản phẩm PCR đã khuếch đại từ 0.1
ng DNA đầu vào trong giếng thứ nhất và lượng như nhau của sản phẩm PCR
trong giếng thứ hai được kết hợp với nhau. Các thư viện đã được gộp được

30. 20
phân hủy một phần các đoạn mồi bằng enzyme FUPA và sau đó được nối với
các adapter và các barcode đặc trưng. Tinh sạch các thư viện với 1.5x
AMPure XP beads (Beckman Coulter, CA, USA). Mỗi thư viện được định
lượng hai lần sử dụng Quantifiler Trio kit và Ion Library TaqMan
Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific, TX, USA) trên hệ thống 7500
Real-Time PCR và chuẩn hóa về nồng độ cuối cùng là 30 pM. Các thư viện
của 6 mẫu xương và mẫu đối chứng âm được phân bố vào hai chip Ion520 và
giải trình tự trên hệ thống Ion S5™.

31. 21
2.2.2. Phân tích đánh giá chất lượng giải trình tự của hệ thống
Ion S5™ bằng phần mềm FastQC
Trình tự thu được sau khi giải trình tự được đưa vào phần mềm FastQC
[49] để loại bỏ các trình tự chất lượng thấp (QC < 30) và kiểm tra xem mồi
còn có mặt trong các trình tự hay không.
2.2.3. Map các đoạn đọc (reads) với hệ gen tham chiếu và lọc
chất lượng bằng phần mềm bwa, samtools
Bwa aln tìm tọa độ (suffix array) SA của các đoạn đọc đầu vào. Các
thông số được sử dụng bao gồm -l 1000 vô hiệu hóa các seed để sử dụng cho
các đoạn đọc ty thể cổ (aDNA). Bwa samse tạo các căn chỉnh (agliment) ở
định dạng SAM cho các đoạn đọc single – end (đầu ra của bước giải trình tự
chỉ xuất một dạng đoạn đọc với một chiều duy nhất). samtools hiển thị đầu ra
trước đó dưới dạng tệp BAM (b), đầu vào là SAM (S) và bao gồm tiêu đề -
header (h). Sau đó, samtools lọc ra những lần đọc chưa được sắp xếp và chất
lượng thấp. -q hiển thị kết quả đầu ra trước đó dưới dạng tệp BAM (b) và bao
gồm tiêu đề (h), nhưng bỏ qua căn chỉnh với MAPQ nhỏ hơn 30 (-q 30) và
căn chỉnh có đánh dấu 4 (phân đoạn 0x4 không được ánh xạ). Tiếp đó, loại bỏ
các bản sao PCR tiềm năng: nếu nhiều cặp đọc có tọa độ bên ngoài giống hệt
nhau, chỉ giữ lại cặp có chất lượng ánh xạ cao nhất. Loại bỏ bản sao cho các
đoạn đọc single - end.
2.2.4. Ước tính các mẫu bị tổn thương (deamination) và chỉnh lại
các file BAM bằng phần mềm mapDamage
Sử dụng mapDamage [50] để ước tính các tổn thương của các mẫu
DNA cổ. Đồng thời, sử dụng --rescale để chỉnh lại chất lượng ánh xạ trong
khi tính các tổn thương. Điều này quan trọng đối với các lệnh gọi kiểu gen
sau này. Hơn nữa, vì một số mẫu sẽ không có nhiều lượt đọc (ví dụ: khoảng
trống hoặc mẫu có hàm lượng nội sinh thấp) nên cần tạo một ngưỡng ra. Điều
này đảm bảo rằng các mẫu có quá ít lần đọc để chỉnh vẫn có thể được xử lý
trong bước tiếp theo bằng cách sao chép tệp .bam chưa được chỉnh vào quy
trình tiếp theo.

32. 22
2.2.5. Gọi các biến thể (variants) và tạo ra VCF (Variant Call Format)
Ở bước này sử dụng samtools [51] và bcftools [51] để tạo ra các lần gọi
kiểu gen. Theo mặc định, quá trình này được cho là dành cho các sinh vật
lưỡng bội vì vậy để sử dụng nó với mtDNA, chúng ta cần chỉ định rằng
ploidy = 1 bằng cách sử dụng một tệp văn bản có chứa tên tệp và ploidy. Sử
dụng samtools mpileup để tạo tệp vcf từ tệp bam và chế độ xem bcftools để
cài đặt thêm và lọc tệp VCF/BCF. Sau đó chạy samtools với các tùy chọn sau:
-f đầu vào tham chiếu được lập chỉ mục, -u tính toán khả năng kiểu gen và
xuất chúng ở định dạng gọi nhị phân (BCF) không được nén, - C 50 Hệ số hạ
cấp chất lượng ánh xạ cho các lần đọc chứa quá nhiều không khớp, 50 là giá
trị được khuyến nghị cho các căn chỉnh BWA. Đầu ra cuối cùng ở giai đoạn
này là hai tệp VCF, một tệp được lọc cho độ bao phủ của các đoạn đọc lớn 1x
và tệp còn lại thì không. Các tệp VCF được tạo ra có thể được sử dụng làm
đầu vào cho mtDNA haplotyping trong Haplogrep.
2.2.6. Tạo file consensus và kiểm tra nhiễm với Schmutzi
Quy trình làm việc của Schmutzi [52]: Ước tính nhiễm ban đầu được
tính toán bằng cách điều chỉnh ở một đầu của trình tự bị hủy và so sánh chúng
với tỷ lệ hủy của tất cả các đoạn trong tập dữ liệu (contDeam). Bước này
được cung cấp để gọi một consensous (là thứ tự được tính toán của các
nucleotit được tìm thấy ở mỗi vị trí theo sắp xếp trình tự) nội sinh
(endoCaller). Tiếp theo, việc gọi consensous được sử dụng để ước tính lại sự
nhiễm ty thể (mtCont). Tỷ lệ hủy và phân bố chiều dài đoạn được đo cho các
đoạn hỗ trợ bộ gen ty thể nội sinh và nhiễm (splitEndo). Thông tin từ mtCont
và splitEndo được sử dụng làm đầu vào để gọi lại consensous nội sinh
(endoCaller). Chu trình này được lặp lại cho đến khi đạt được tỷ lệ nhiễm ổn
định hoặc tìm ra nhiễm.
Hình 2.1: Quy trình làm việc của Schmutzi ( Renaud G et al., 2015)

33. 23
2.2.7. Xác định nhóm haplogroup bằng HaploGrep2
Các tệp VCF được tạo ra bởi samtools ở bước trước đó được sử dụng
làm đầu vào cho việc phân loại haplogroup (một nhóm của các alleles trong
mỗi sinh vật được di truyền cùng nhau từ một bố mẹ) của mtDNA trong
Haplogrep2 [53]. Bản thân việc phân loại haplogroup dựa trên mức độ phát
sinh loài được tính toán trước tương ứng với sự xuất hiện trên mỗi vị trí trong
Phylotree và phản ánh tính ổn định đột biến của một biến thể. Đầu ra của
HaploGrep2 bao gồm: báo cáo các haplogroup bao gồm vị trí, tên haplogroup,
điểm chất lượng, các đa hình, các thay đổi axit amin tương ứng.
2.2.8. Dựng cây phát sinh chủng loại thông qua phần mềm
MEGA
Dựa vào các haplogroup đã được xác định trước đó, xác định các mẫu
ty thể thuộc cùng haplogroup để xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng
MEGA [54].

34. 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết mtDNA và giải trình tự bằng hệ thống
máy Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific)
3.1.1. Kết quả tách chiết mtDNA
Các mẫu xương khảo cổ được cung cấp bởi Viện khảo cổ và Trung tâm
Tiền sử Đông Nam Á có tuổi được xác định dựa trên đồng vị cacbon 14 cách
ngày nay khoảng 6400 năm, thuộc nền văn hóa Đa Bút, hậu thời kỳ đồ đá mới
(late neolithic).
Mẫu số 1: ký hiệu K1A06
Loại mẫu: 01 xương dài (Xương đùi)
Màu sắc: có màu nâu
Chất lượng mẫu: còn cứng rắn
Hình 3.1: Mẫu xương đùi – K1A06
Mẫu số 2: ký hiệu K1B07
Loại mẫu: 04 mảnh
Màu sắc: có màu nâu
Chất lượng mẫu: còn cứng rắn tuy nhiên 2 đầu xương đã bị gãy, trong
quá trình phục chế đã dùng thạch cao để bịt lại 2 đầu bị gãy
Hình 3.2: Mẫu xương K1B07

35. 25
Mẫu số 3: ký hiệu K1B05
Loại mẫu: 06 xương dài
Màu sắc: có màu nâu
Chất lượng mẫu: Còn cứng rắn tuy nhiên đầu xương đã bị gãy, trong
quá trình phục chế đã dùng thạch cao để bịt lại 2 đầu bị gãy
Hình 3.3: Mẫu 6 xương dài - K1B05
Mẫu số 4: ký hiệu K1B10A
Loại mẫu: 02 xương dài và các mảnh xương nhỏ
Màu sắc: có màu nâu
Chất lượng mẫu: Còn cứng rắn tuy nhiên các xương đã bị gãy nát
nhiều, trong quá trình phục chế đã dùng thạch cao để bịt lại 2 đầu bị gãy
Hình 3.4: Mẫu xương dài và các mảnh xương nhỏ K1B10A

36. 26
Mẫu số 5: ký hiệu K1B08
Loại mẫu: 03 xương dài và nhiều mảnh xương nhỏ
Màu sắc: có màu nâu
Chất lượng mẫu: các xương dài còn cứng rắn tuy nhiên đầu xương đã bị
gãy, trong quá trình phục chế đã dùng thạch cao để bịt lại đầu bị gãy. Các
mảnh xương nhỏ đã bị gãy nát, chất lượng kém.
Hình 3.5: Mẫu xương K1B08
Mẫu số 6: ký hiệu K1B10
Loại mẫu: nhiều mảnh xương đã gãy nát
Màu sắc: có màu nâu
Chất lượng mẫu: Còn cứng rắn tuy nhiên đầu xương đã bị gãy, trong
quá trình phục chế đã dùng thạch cao để bịt lại đầu bị gãy.
Hình 3.6: Mẫu xương gãy nát K1B10
Mẫu vật sau khi được làm sạch, làm khô ở nhiệt độ 56℃ trong vòng 2-
3 giờ sẽ được chuyển sang bước xử lí tiền tách chiết. Ở bước này, mẫu sẽ
được nghiền thành dạng bột mịn chia ra thành các ống nhỏ mỗi ống khoảng
200mg bột để xử lí bước tách chiết sau này.

37. 27
Hình 3.7: Các mẫu xương sau khi nghiền mịn
Trước khi giải trình tự Sanger các mẫu tách chiết được điện di sản
phẩm PCR với cặp mồi miniset PS1 và PS2 trên gel agarose 2% để kiểm tra
hiệu quả của quá trình tách chiết.
- +
- +
- +
M
M
M M
PS1
PS2
A B

38. 28
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi miniset PS1 và PS2 trên
gel agarose 2%.
- +
- +
M
M
M
M
PS1
PS2
PS1
PS1
PS2
PS2
C D
E F

39. 29
A, B, C, D, E, F lần lượt là các kết quả điện di mtDNA được tách chiết từ
mẫu xương K1B10A, K1B07, K1A06, K1B05, K1B08, K1B10. (+): mẫu đối
chứng dương, (-): mẫu đối chứng âm, M: 100 bp DNA marker, PS (PCR
primer sets): các cặp mồi sử dụng trong PCR.
Hình ảnh điện di sản phẩm mtDNA đã được tinh sạch cho thấy khả
năng tách chiết chiết DNA từ mẫu xương cổ rất kém. Chỉ có 2 mẫu hiện band
của DNA tương ứng với PS1 (263bp: mồi xuôi bắt đầu từ mucleotide ở vị trí
15989, mồi ngược bắt đầu từ nucleotide ở vị trí 16251) và PS2 (271bp: mồi
xuôi bắt đầu từ mucleotide ở vị trí 15, mồi ngược bắt đầu từ nucleotide ở vị trí
285) của vùng HV1 (342bp: kéo dài từ nucleotide ở vị trí 16024 đến
nucleotide ở vị trí 16365) đó là mẫu xương K1A06 và mẫu xương K1B05.
Đây cũng là hai mẫu có chất lượng tốt nhất. Hai mẫu này được lựa chọn để
tiếp tục giải trình tự Sanger. Phân tích trình tự Sanger thu được trên phần
mềm Sequencher giúp giảm thiểu các heteroplasmy trên trình tự thuộc vùng
HV1. Việc này giúp gia tăng độ chính xác khi đối chiếu lại với trình tự toàn
bộ hệ gen ty thể giải trình tự bằng máy giải trình tự thế hệ mới Ion S5™.
Nguyên tắc chung của tách chiết DNA từ bột xương thường bao gồm
các bước sau đây: Ủ trong đệm ly giải để phá vỡ cấu trúc mô và tế bào về mặt
hóa học, tiếp theo là bước ủ trong dung dịch đệm liên kết muối nồng độ cao
hỗ trợ liên kết DNA với silica. DNA sau đó được rửa bằng dung dịch gốc
etanol để giảm thiểu sự mang chất ức chế và rửa giải trong dung dịch đệm
muối nồng độ thấp. Phương pháp của Loreille [55] và Dabney [56] là các
phương pháp thường được sử dụng để tách chiết mtDNA trong các mẫu cổ
đại [57]. Trong những năm gần đây phương pháp của Dabney [56] thường
được lựa chọn để sử dụng với các mẫu có tuổi rất cao [58–60]. Kết quả so
sánh cho thấy, theo phương pháp Dabney [56] với 50 mg mẫu cho lượng
DNA được tách chiết là cao nhất với các mẫu xương có tuổi khác nhau, đặc
biệt là mẫu 2000 năm tuổi (0.035 pg/mg). Hàm lượng mẫu 50mg cũng là
thông số được lựa chọn trong quy trình tách chiết của luận văn này. Kit
Qiagen EZ1 DNA cũng được lựa chọn để tách chiết mtDNA từ các mẫu bị
phá huỷ nặng theo thời gian, đó là mẫu từ xương của lính tham gia thế chiến
thứ II [61] và mẫu 750 năm tuổi [62]. Mẫu thế chiến thứ II có tuổi cách đây
không quá xa và không phát hiện tổn thương DNA, hiệu suất tách chiết DNA

40. 30
tốt, mẫu 750 tuổi, theo định lượng Quantifiler Trio DNA, lượng thấp DNA
thu được từ răng, trong khi hàm lượng DNA thu được từ xương đủ ngưỡng để
kit phát hiện (0.0523 ng/μl và 0.0407 ng/μl lần lượt với mẫu trưởng thành và
mẫu thiếu nhi).
Kiểm tra nồng độ DNA đầu vào sử dụng bộ Quantifiler Trio kit
(ThermoFisher, USA).
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra nồng độ DNA đầu vào sử dụng bộ Quantifiler Trio
kit (ThermoFisher, USA)
Well Sample
name
Sample
type
Quantity Quantity
Mean
(ng/µL)
M:F
Ratio
Mean
M:F
Ratio
Degradation
Index
Degradation
Index Mean
G5 Xuong
co 1
UnKnown 0,00 0,00 - - - -
G6 Xuong
co 2
UnKnown 0,00 0,00 - - - -
Kết quả cho thấy mẫu xương khảo cổ dưới ngưỡng định lượng của kit (0.005
ng/uL), do đó không hiện thông số với các chỉ số khi kiểm tra nồng độ DNA
đầu vào (Bảng 3.1). Sau đó, tiến hành định lượng thư viện sau chuẩn bị bằng
Ion Library Taqman Quantification kit, kết quả chi tiết tại bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả định lượng thư viện sau chuẩn bị bằng Ion Library Taqman
Quantification kit (ThermoFisher, USA)
Well Sample Name Quantity (pM) Target pM Stock(µL) H2O (µL)
F11 Xuong co 1
(Manual)
3612,040527 30 2 238,80
E11 Xuong co 2
(Manual)
3090,441162 30 2 204,03
Các thông số định lượng thư viện cho thấy thư viện đạt chất lượng để
tiến hành giải trình tự.

41. 31
3.1.2. Kết quả giải trình tự bằng hệ thống máy Ion S5™ (Thermo Fisher
Scientific)
Bảng báo cáo các thông số giải trình tự cho thấy tổng dung lượng dữ
liệu thu được: 147 Mbases. 1.4 triệu read. ISP loading 27% (hình 3.9). Với
thông số này cho thấy lần giải trình tự này chưa khai thác được hết dung
lượng của chip giải trình tự. Trong những lần giải trình tự sau này chúng tôi
đã giải quyết được khuyết điểm này. Tăng tỉ lệ Loading lên trên 90%.
Biểu đồ độ dài đoạn đọc cho thấy đoạn đọc phân bố chủ yếu từ 50-
150bp. Đoạn đọc trung bình là 86bp rất thích hợp với thiết kế của bộ kit.
Biểu đồ tín hiệu Flows cho thấy peak tín hiệu khoảng 68 (hình 3.9).
Hơi thấp so với các mẫu chuẩn là 85. Chứng tỏ chất lượng thư viện của các
mẫu xương lâu năm khá là kém.
Hình 3.9: Các thông số của quá trình giải trình tự

42. 32
3.2. Phân tích đánh giá chất lượng giải trình tự của hệ thống
Ion S5™ bằng phần mềm FastQC
Hình 3.10: Chất lượng trình tự của mẫu xương cổ thứ nhất (CCNM24WG)
Hình 3.11: Chất lượng trình tự của mẫu xương cổ thứ hai (CCNM55WG)

43. 33
Hai trình tự ty thể thu được sau giải trình tự với hệ thống Ion S5™ có
tên gọi là CCNM24WG và CCNM55WG. Các trình tự này được kiểm tra về
điểm chất lượng (QC), đã loại bỏ adapter hay chưa. Kết quả thu được từ phần
mềm FastQC cho thấy, cả hai trình tự này đều đã được loại bỏ adapter và có
chất lượng trình tự khá tốt (phần lớn QC > 20) (Hình 3.10 và Hình 3.11).
Điều này cho thấy chất lượng trình tự thu được sau giải trình tự có độ tin cậy
cao. Các thông tin chi tiết về chất lượng trình tự được trình bày trong bảng
3.3.

44. 34
Bảng 3.3: Chất lượng mỗi trình tự thu được của CCNM24WG và
CCNM55WG
Quality
Sequence name
CCNM24WG CCNM55WG
14 5 7
15 72 111
16 415 464
17 1250 1519
18 2668 2816
19 3991 4214
20 4923 5113
21 5253 5303
22 5447 5557
23 5985 6076
24 6868 6873
25 8085 8030
26 9802 9219
27 12052 10640
28 15522 12900
29 21406 16343
30 32707 24522
32 54534 41010
32 56821 38246
33 2384 1760
34 1 0

45. 35
3.3. Map các đoạn đọc (reads) với hệ gen tham chiếu và lọc
chất lượng bằng phần mềm bwa, samtools
Hệ gen tham chiếu được sử dụng là Reconstructed Sapiens Reference
Sequence (RSRS). Reconstructed Sapiens Reference Sequence - (RSRS) là
một trình tự mtDNA tham chiếu sử dụng cả việc lấy mẫu toàn cầu của mẫu
người hiện đại và mẫu từ người các bộ tộc cổ đại. Nó được giới thiệu vào đầu
năm 2012 (Behar et al., 2012) để thay thế cho rCRS (trình tự tham chiếu
Cambridge đã sửa đổi). Bởi vì nó dựa trên kiểu haplotype của tổ tiên chung
cho cả người hiện đại và các nhóm cổ đại như người Neanderthal.
Bwa aln lấy file trình tự tham chiếu (RSRS.fasta) và file ty thể thu được
sau giải trình tự (CCNM24WG.fastq và CCNM55WG.fastq) làm đầu vào.
bwa samse sử dụng CCNM24WG.aln.sai – đầu ra từ bwa aln để tạo ra SAM
file (aln.sam) từ alignments cho các đoạn đọc single-end. samtools hiển thị
đầu ra trước đó dưới dạng tệp BAM (CCNM24WG.aln.bam). "-q30" bỏ qua
các alignment với MAPQ nhỏ hơn 30 (mapping quality: mô tả tính duy nhất
của alignments, 0 = không phải duy nhất, > 10 có thể là duy nhất. Nếu xác
suất của một lần ánh xạ (map) đúng tăng lên 0,999, điểm MAPQ sẽ tăng lên
30), samtools view sẽ loại bỏ các đoạn đọc không map hoặc map tại vùng lặp
lại. Đầu ra cuối cùng là file
CCNM24WG.aln.mapped.Q30.bwa.sort.rmdup.bam

46. 36
Hình 3.12: File đầu ra thu được từ samtools

47. 37
3.4. Ước tính các mẫu bị tổn thương (deamination) và chỉnh
lại các file BAM bằng phần mềm mapDamage
Hình 3.13: Thông tin tổn thương DNA cổ đại của mẫu CCNM24WG được tạo
ra bởi mapDamage 2.0

48. 38
Hình 3.14: Thông tin tổn thương DNA cổ đại của mẫu CCNM55WG được tạo
ra bởi mapDamage 2.0
Bốn hình phía trên thể hiện tần số base trong và ngoài các đoạn đọc,
nơi mà các hộp màu xám không khép kín tương đương với một đoạn đọc. Hai
hình bên dưới thể hiện vị trí thay thế base đặc trưng từ đầu 5’ (trái) và đầu 3’
(phải) của một đoạn đọc. Đường màu đỏ tương ứng với thay thế C thành T,
đường màu xanh dương tương ứng với thay thế G thành A, các đường mờ còn
lại là các loại thay thế base khác.
Kết quả cho thấy hai mẫu DNA đều có tổn thương DNA, cụ thể là sự
khử amin và sự phân mảnh. Sự thay thế C thành T diễn ra đầu tiên đầu 5’, sự
thay thế G thành A diễn ra đầu tiên ở đầu 3’. Ở bước này tùy chọn - - rescale

49. 39
tạo ra file BAM đã được để chỉnh lại chất lượng ánh xạ trong khi tính các tổn
thương (CCNM24WG.uniq.rescaled.bam và
CCNM55WG.uniq.rescaled.bam). Các file này sẽ được sử dụng làm đầu vào
cho bước gọi biến thể và tạo consensous file.
3.5. Gọi các biến thể (variants) và tạo ra VCF (Variant Call
Format)
File BAM đã được rescaled với mapDamage được sử dụng làm đầu vào
cho việc gọi biến thể sử dụng samtools mpileup để tạo file vcf từ file bam và
bcftools view để thêm các cài đặt để tùy chỉnh và lọc file VCF. Đầu ra cuối
cùng ở giai đoạn này là hai tệp VCF, một tệp được lọc cho độ bao phủ của các
đoạn đọc lớn 1x và tệp còn lại thì không. Các tệp VCF được tạo ra có thể
được sử dụng làm đầu vào cho mtDNA haplotyping trong Haplogrep2.

50. 40
Hình 3.15: Một phần file vcf đầu ra

51. 41
3.6. Tạo file consensus và kiểm tra nhiễm với Schmutzi
Nhiệm vụ ước tính sự nhiễm của mtDNA của người hiện đại gắn liền
với vấn đề ước đoán hệ gen ti thể nội sinh. Ngược lại, chiến lược được sử
dụng để ước đoán bộ gen nội sinh phụ thuộc nhiều vào mức độ nhiễm của
mtDNA của người hiện đại. Nguyên tắc xác định ước tính nhiễm mtDNA của
người hiện đại bằng cách sử dụng tần số thay thế C thành T ở cuối các đoạn
đọc. Tỷ lệ kết hợp sai cho các mảnh nội sinh có thể thu được bằng cách sử
dụng quy trình điều hòa kép, nhờ đó các đoạn bị hủy ở đầu 5’ của chúng được
giữ lại và sự hủy ở đầu 3’ được đo và ngược lại. Ước tính nhiễm mtDNA của
người hiện đại sẽ dựa trên cơ sở mỗi phân mảnh thay vì mỗi base.
% contDeam.pl --lengthDeam [length] --library [library type] --out
[output prefix] [mt reference] [input bam file]
--lengthDeam [length]: chiều dài dạng số nguyên [length] là số lượng
các nucleotide sẽ được thuật toán xem xét khi ước tính mức độ nhiễm mtDNA
của người hiện đại. Độ dài này có thể thay đổi từ 20-40 đối với protocol sợi
đôi, từ 2 đến 5 đối với protocol sợi đơn có xử lý UDG.
--library [type]: loại protocol được dùng để chuẩn bị thư viện được sử
dụng để tính loại các dạng phân hủy. Hiện tại, có hai giá trị có thể có cho
[type], “single” theo quy trình Meyer et al. (2012), hoặc tương đương, và
“double” theo quy trình Meyer and Kircher (2010), hoặc tương đương.
Ước tính nhiễm mtDNA của người hiện đại sẽ được ghi vào một tệp có
tên là [output prefix].cont.est và hình dạng của phân phối xác suất sau đó sẽ
được vẽ biểu đồ cho tệp [output prefix].cont.pdf. Tỷ lệ thiệt hại sau khi phân
hủy đối với các mảnh nội sinh các phân đoạn sẽ được tạo cho 5 ’và 3’ được
ghi vào các tệp được gọi là [output prefix].endo.5p.prof và [output
prefix].endo.3p.prof tương ứng. Đầu ra của contDeam.pl sẽ được sử dụng làm
đầu vào cho endoCaller. Mô hình con này nhằm mục đích tạo ra trình tự của
bộ gen ty thể nội sinh có ước đoán trước về sự nhiễm mtDNA của người hiện
đại, tỷ lệ tổn thương sau khi phân hủy cũng như sự phân bố chiều dài đoạn
cho các mảnh nội sinh và các mảnh nhiễm một cách độc lập. Khi đã có được
bộ gen ti thể nội sinh, sự nhiễm mtDNA của người hiện đại có thể được ước
tính bằng cách sử dụng mtCont.
% mtCont -deam5p [output prefix].endo.5p.prof -deam3p [output
prefix].endo.3p.prof [output prefix].log [mt reference] [input bam file]

52. 42
[contaminant profile 1] [contaminant profile 2] ...
Trong đó [output prefix].log được tạo ra bởi endoCaller, cả hai file
.prof files đều thu được từ contDeam.pl. Các file [contaminant profile N] là
các tần số allele cho các nhóm con khác nhau được coi là nguồn nhiễm tiềm
ẩn. Các tần số alen cho một tập hợp các haplogroup của con người được cung
cấp cùng với gói phần mềm. Ước tính nhiễm mtDNA của người hiện đại do
mtCont cung cấp dựa trên mỗi nucleotide của các base. Để có được kết quả
chính xác, nên sử dụng lặp đi lặp lại endoCaller và mtCont cho đến khi có kết
quả ổn định.
Hình 3.16: Kết quả chạy schmutzi
Kết quả ước tính độ nhiễm mtDNA của người hiện đại của hai mẫu
xương cổ cho thấy mức độ nhiễm của hai trình tự CCNM24WG và
CCNM55WG lần lượt là 14% và 21%. Mức độ nhiễm này cần được giảm
xuống để cải thiện thêm chất lượng của các phân tích sau này.

53. 43
3.7. Xác định nhóm haplogroup bằng HaploGrep2
Với file vcf đầu vào, thu được kết quả đầu ra bao gồm:
SampleID – định danh của mẫu
Range – Các vị trí được sắp xếp theo trình tự / kiểu gen trên bộ gen ti
thể
Haplogroup – Haplogroup thu được
Cluster – nếu lần truy cập đầu tiên không rõ ràng, kết quả của cluster
được liệt kê trong cột này
Overall_Rank – điểm của haplogroup (từ 0.5 đến 1) trong khi 0.5 có
nghĩa là không có SNP nào được tìm thấy, và 1 có nghĩa là khớp tuyệt đối.
Not_found_Polys – false negatives – đột biến được mong đợi trong
haplogroup này nhưng không tìm thấy
Found_Polys – true positives – các đột biến được tìm thấy của các
haplogroup tìm được. Đột biến ngược (Backmutations) cũng được tính, được
ký hiệu bởi !
Remaining_Polys – Các biến thể không được sử dụng cho phân loại
haplogroup này – thể hiện: a) có thể là haplogroup mới, hoặc b) possible
sample admixture, hoặc đột biến giả (false positives). Được liệt kê ở đây là
hotspot mutations cũng như local private mutations (tìm thấy ở ít nhất một
haplogroup khác biệt) hoặc global private mutation (chưa biết trong phát sinh
loài hiện tại), cũng như đột biến không đồng nhất (heteroplasmic mutations)
hoặc tham chiếu các vị trí giống hệt nhau (thường là các trường hợp dữ liệu
dựa trên MicroArray).
AAC_Remaining – các biến thể còn lại trong cột trước đó được chọn -
và được đánh dấu như vậy nếu có liên quan đến thay đổi axit amin (Amino
Acid Change).
Input_Sample – thông tin được sử dụng để phân loại
Kết quả tại bảng 3.4 cho thấy haplogroup xác định được ở mtDNA của
hai mẫu xương cổ đều là M (CCNN24) và R (CCNN55). M là mtDNA
haplogroup phổ biến nhất ở châu Á [63], super-haplogroup M được phân bố
trên toàn châu Á, nơi mà nó chiếm đến 60% tất cả các dòng mẹ [64].
Ở Việt Nam, haplogroup M được tìm thấy với tần số 37% (52/139) đến
48% (20/42) trong các mẫu của người Việt và chiếm 32% (54/168) của mẫu

54. 44
người Chăm từ tỉnh Bình Thuận [65, 66]. Vẫn có những cuộc tranh luận xoay
quanh nguồn gốc địa lý của Haplogroup M và haplogroup N chị em của nó.
Cả hai nhánh này được cho rằng là những nhóm sống sót chính đã tiến hoá và
di cư ra khỏi châu Phi bởi vì tất cả các dòng bản địa được tìm thấy bên ngoài
Châu Phi đều thuộc nhóm haplogroup M hoặc haplogroup N. Các nhà khoa
học không chắc liệu những đột biến xác định nhóm gen M và N xảy ra ở Châu
Phi trước khi rời khỏi Châu Phi hay ở Châu Á sau khi rời khỏi Châu Phi. Việc
xác định nguồn gốc của haplogroup M còn phức tạp hơn do sự di cư ngược
dòng sớm (từ Châu Á sang Châu Phi) của những người mang gen M1 [67].
Haplogroup R là một haplogroup mtDNA phân bố rộng rãi của con
người. Haplogroup R có liên quan đến sự xuất hiện của Âu-Á sau khoảng
70.000 năm trước, và phân bố trong các quần thể hiện đại trên khắp thế giới
bên ngoài châu Phi cận Sahara [68]. Điều này phù hợp với sự xuất hiện trong
quá trình Di cư ven biển ra khỏi Đông Phi sang Tây, Nam và Đông Nam Á
[69]. Có ý kiến cho rằng dòng tộc ban đầu của các nhóm M, N và R dọc theo
tuyến đường ven biển trong khoảng thời gian khoảng 70.000 đến 60.000 năm
trước [70]. Haplogroup R có sự đa dạng và cổ xưa trong cộng đồng dân cư
bản địa Nam Á, các bộ lạc ở miền Tây và miền Nam Ấn Độ thể hiện sự đa
dạng cao hơn các khu vực khác [68]. Larruga et al. (2017) tìm thấy mtDNA
haplogroup R lan rộng đến Âu-Á và Úc từ một khu vực lõi dọc theo bờ biển
Đông Nam Á [68].

55. 45
3.8. Dựng cây phát sinh chủng loại thông qua phần mềm
MEGA
Dựa vào các haplogroup đã được xác định trước đó, xác định các mẫu
mà haplogroup cùng nhánh hoặc thuộc cùng nền văn hóa và quốc gia thu
mẫu, ngoài ra sử dụng thêm mẫu Neanderthal - Vindija_33_25
(FM865410.1), mẫu Denisova8 (KT780370.1), mẫu Denisova2
(KX663333.1), mẫu Denisovan (Homo sp. Altai) khác để so sánh mối liên hệ
giữa các mẫu người cổ của các quốc gia khác nhau thuộc cùng một nền văn
hóa và mối quan hệ giữa người Việt cổ và người Việt hiện đại. Thông tin chi
tiết của mẫu trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Thông tin các mẫu được lựa chọn để xây dựng cây phát sinh loài
STT Tên mẫu Quốc gia Nguồn Haplogroup
Tuổi
(cách
ngày này)
Nền văn
hóa
1 Altai Nga
Krause J et
al., 2010
>125000
2 Denisova2 Nga
Slon et al.,
2017
127000-
128000
3 Denisova8 Nga
Sawyer et
al., 2015
>50 000
4 Vindija_33_25
Croatia Briggs et
al., 2009
38000
5 RSRS
Behar et
al., 2012
6 I0627_N Việt Nam
Lipson et
al., 2018
M7b1 3630±35 Thời kỳ
đồ đá
7 I1135_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
H2a/R0/R 3445±20 Thời kỳ
đồ đá
8 I1137_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
M7b1a1/
M7b1a1+(16192)
3480±20 Thời kỳ
đồ đá
9 I2947_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
M7b1a1/H2a2a 3900-
3600
Thời kỳ
đồ đá
10 020808_B Việt Nam
McColl et
al., 2018
M7b1a1 2343
Thời kỳ
đồ đồng
11 020779_B Việt Nam
McColl et
al., 2018
M7c1b2b 2336
Thời kỳ
đồ đồng
12 CCNM24WG Việt Nam
IBT,
VAST
H2a2a1 6400
Hậu thời
kỳ đồ đá
13 CCNM55WG Việt Nam
IBT,
VAST
H2a2a1 6400
Hậu thời
kỳ đồ đá
14 019719_LN Việt Nam
McColl et
al., 2018
M7c2 -
Hậu thời
kỳ đồ đá
15 Ede112 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M21b -
Người
hiện đại
16 Ede102 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M71+151 -
Người
hiện đại
17 Thai249 Việt Nam Duong et M7c1a - Người

56. 46
al., 2018 hiện đại
18 Tay138 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M7b1a1a3 -
Người
hiện đại
19 Tay135 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M7b1a1d1 -
Người
hiện đại
20 Nung664 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M61 -
Người
hiện đại
21 Nung665 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M7b1a1 -
Người
hiện đại
22 Nung49 Việt Nam
Duong et
al., 2018
B4c2c -
Người
hiện đại
23 Kinh04 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M7c1c2 -
Người
hiện đại
24 I1859_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
M13b1/M13/M13b 3490±25 Thời kỳ
đồ đá
25 I10973_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
No call 3900-
3600
Thời kỳ
đồ đá
26 I2731_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
M74b 3430±20 Thời kỳ
đồ đá
27 I4458_B
Thái Lan Lipson et
al., 2018
M74b2 3200-
3000
Thời kỳ
đồ đồng
28 I4011_LN
Myanmar Lipson et
al., 2018
D4q 3200-
2700
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới - đầu
thời kỳ đồ
đồng
29 I4012_LN
Myanmar Lipson et
al., 2018
D4h1c 3200-
2700
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới - đầu
thời kỳ đồ
đồng
30 I8970_IA
Thái Lan Lipson et
al., 2018
M72a 2600-
2400
Đầu thời
kỳ đồ sắt
31 I2497_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
C7a2/ N/C5b 2100-
1900
Thời kỳ
đồ đồng
32 I2448_N
Việt Nam Lipson et
al., 2018
M8a2a/H2 2005±15 Thời kỳ
đồ đồng
33 017833_LN
Việt Nam
McColl et
al., 2018
M20
4291-
4006
Thời kỳ
hậu đồ đá
mới
34 018522_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
G2b1a 1789±25
Thời kỳ
đồ sắt
35 018530_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
G2b1a 1756±26
Thời kỳ
đồ sắt
36 018531_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
G2b1a 1687±24
Thời kỳ
đồ sắt
37 TH2A_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
G2b1a 1870±30
Thời kỳ
đồ sắt
38 019911_HG Malaysia
McColl et
al., 2018
M21b1a 3872±33
Văn hoá
Hoà Bình
39 019912_LN Malaysia
McColl et
al., 2018
M13c 2409±31
Hậu thời
kỳ đồ đá
40 020368_HG Lào
McColl et
al., 2018
M5 7040±38
Văn hoá
Hoà Bình
41 I8978_LN Thái Lan Lipson et F1f 3500- Hậu thời

57. 47
al., 2018 3200 kỳ đồ đá
mới
42 018521_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
F1f 1813
Thời kỳ
đồ sắt
43 019743_LN
Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1f -
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới
44 019744_LN
Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1 -
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới
45 019880_LN
Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1f -
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới
46 017661_LN Indonesia
McColl et
al., 2018
F1a1a 1917±25
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới – thời
kỳ đồ sắt
47 020364_LN Lào
McColl et
al., 2018
F1a1a1 3071
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới – thời
kỳ đồ
đồng
48 020778_LN Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1a1a1 2750
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới
49 TH6C_IG Thái Lan
McColl et
al., 2018
F1 -
Thời kỳ
đồ sắt
50 020777_LN Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1a1’4 2349
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới
51 020781_B Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1a 2340
Thời kỳ
đồ đồng
52 019533_Filipino Philipin
McColl et
al., 2018
F1a4a1 1829±26
Đồ gốm
đỏ - Nam
đảo
53 TH2B_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
F1c1a2 -
Thời kỳ
đồ sắt
54 TH2C_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
F1c1a2 -
Thời kỳ
đồ sắt
55 TH2D_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
F1 -
Thời kỳ
đồ sắt
56 020796_B Việt Nam
McColl et
al., 2018
F1e3 2303
Thời kỳ
đồ đồng
57 019554_historic Malaysia
McColl et
al., 2018
F3b1a+16093 505
58 019739_LN Việt Nam
McColl et
al., 2018
F4b 4381
Hậu thời
kỳ đồ đá
mới
59 019555_historic Malaysia
McColl et
al., 2018
B4b1a2 452
60 017727_HG Lào
McColl et
al., 2018
N9a6a 2378
Văn hoá
Hoà Bình
61 019898_HG Lào
McColl et
al., 2018
N9a6a -
Văn hoá
Hoà Bình
62 019525_HG Malaysia McColl et N9a6a 3551 Văn hoá

58. 48
al., 2018 Hoà Bình
63 018523_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
N8 1737
Thời kỳ
đồ sắt
64 019534_Filipino Philippines
McColl et
al., 2018
B5b1a 1925
Đồ gốm
đỏ - Nam
đảo
65 I8977_B Thái Lan
Lipson et
al., 2018
R/B5 3490±25
Thời kỳ
đồ đá
66 014703_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
B5a1d 1732
Thời kỳ
đồ sắt
67 018519_IA Thái Lan
McColl et
al., 2018
B5a1d 1815
Thời kỳ
đồ sắt
68 I0626_N Việt Nam
Lipson et
al., 2018
R/B5 3490±25
Thời kỳ
đồ đá
69 I1680_IA Campuchia
Lipson et
al., 2018
B5a1a/ R0/H27 1885±30
Thời kỳ
đồ sắt
70 I8974_B Thái Lan
Lipson et
al., 2018
R
3200-
3000
Thời kỳ
đồ đồng
71 019548_Ma548 Malaysia
McColl et
al., 2018
B5a1a 510
72 Thai250 Việt Nam
Duong et
al., 2018
C7
73 Nung47 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M74a
74 Ede736 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M71+151
75 Giarai100 Việt Nam
Duong et
al., 2018
M71+151
76 HMong194 Việt Nam
Duong et
al., 2018
F1a1a
77 HMong196 Việt Nam
Duong et
al., 2018
F1a1a
78 Kinh01 Việt Nam
Duong et
al., 2018
F1g
79 Dao50 Việt Nam
Duong et
al., 2018
F3a1
80 Lao91 Lào
Zang et al.,
2013
B5b1
81 Jarai04 Campuchia
Zang et al.,
2018
B5a1a

59. 49

60. 50

61. 51
Hình 3.17: Cây phát sinh chủng loại của người Việt cổ và người cổ thuộc một
số nước trong cùng giai đoạn
HG - hunter gather; EN - early Neolithic; N - Neolithic; LN - Late Neolithic;
B - Bronze age; IA – Iron age; Histo - historic (vài trăm năm)