SlideShare a Scribd company logo

Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

•
•
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

Download luận án tiến sĩ ngành hóa hữu cơ với đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài lá kim: Pinus dalatensis, pinus kesiya và podocarpus neriifolius ở việt nam, cho các bạn tham khảo Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

Education
1 of 146
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN HOÀNG SA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS, PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2017
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… NGUYỄN HOÀNG SA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS, PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hoá hữu cơ Mã số: 62 44 01 14 Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trịnh Thị Thủy Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Thanh Tâm Hà Nội – 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Toàn bộ trích dẫn trong luận án đều chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận án Nguyễn Hoàng Sa
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, lãnh đạo Viện Hóa học, bộ phận đào tạo Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khánh Hòa, trưởng Khoa cùng cán bộ của Khoa Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TSKH. Trần Văn Sung đã có những định hướng xây dựng nền móng ban đầu cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Hoàng Sa
i MỤC LỤC MỤC LỤC.............................................................................................................................i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .........................................................iv DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG.......................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................viii PHỤ LỤC ............................................................................................................................ix MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................................3 1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu ..........................................................................3 1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis)........................................................................3 1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya)...............................................................................3 1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius)..................................................4 1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus...............................5 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus .............................................5 1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus ................................................................6 1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus .............................................................14 1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus ...................................................................17 1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus......................................................................19 1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Thông ba lá.................................20 1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus................................................................................................................................20 1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau ................................................................21 1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư...............................................22 1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................................24 1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa .................................................................................26 1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác.............................................27 1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Podocarpus. ....................................................................................................................28 1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius).......................................................................................................................39 Chương 2. THỰC NGHIỆM............................................................................................42
ii 2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học...........................................................42 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu...........................................................................42 2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật........42 2.4. Phương pháp xác định cấu trúc.............................................................................43 2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học..........................................................43 2.6. Hóa chất và thiết bị ...............................................................................................46 2.7. Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu..................47 2.8. Phân lập chất từ các chiết xuất..............................................................................48 2.8.1. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt.................48 2.8.2. Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt......................49 2.8.3. Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt .......................49 2.8.4. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt..................50 2.8.5. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá...................51 2.8.6. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài............52 2.9. Dữ kiện phổ của các chất tách được .....................................................................60 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................70 3.1. Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis) .................................70 3.1.1. Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol ...................................................................70 3.1.2. Hỗn hợp TT2 .................................................................................................71 3.1.3. Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid ........................................................73 3.1.4. Chất TT4: Lambertianic acid........................................................................75 3.1.5. Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid.................77 3.1.6. Chất TT6: Isopimaric acid.............................................................................78 3.1.7. Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one ................................................79 3.1.8. Chất TF1: Pinocembrin..................................................................................81 3.1.9. Chất TF2: Chrysin .........................................................................................82 3.1.10. Chất TF3: Pinostrobin....................................................................................83 3.1.11. Chất TF4: (+) Catechin..................................................................................84 3.1.12. Chất TF5: Kaempferol...................................................................................85
iii 3.1.13. Chất TF7: Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyrano- side...............................................................................................................................86 3.1.14. Chất TP1: Dihydropinosylvin........................................................................89 3.1.15. Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether ...............................................89 3.1.16. Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene .....................................................90 3.1.17. Hỗn hợp TP5..................................................................................................90 3.1.18. Chất TP6: Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside).......................................92 3.1.19. Chất TL1: (+) Lariciresinol ...........................................................................94 3.1.20. Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside ............................................95 3.1.21. Chất TS1: β-Sitosterol....................................................................................97 3.1.22. Chất TS2: Daucosterol...................................................................................98 3.2. Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya).........................................99 3.2.1. Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid......................................99 3.2.2. Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside........................101 3.2.3. Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside..................................................102 3.2.4. Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -β- D-glucopyranoside.....................................................................................................103 3.2.5. Chất TL2: Cedrusin .....................................................................................105 3.3. Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius)................105 3.3.1. Chất TT7: Totarol........................................................................................105 3.3.2. Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid.........................................................106 3.3.3. Chất TT9: Inumakiol D ...............................................................................107 3.3.4. Chất TT10: Macrophyllic acid.....................................................................108 3.4. Hoạt tính sinh học của một số chất sạch.............................................................111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................................................116 DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ......................................................119 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................120
iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột thường GFC Gel filtration chromatography Sắc ký lọc Gel TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phương pháp phổ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều 1 H- 1 H DEPT Distortionless Enhancement by Polarisa- tion Transfer Phổ DEPT ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spec- trometry Phổ khối ion hóa phun mù điện tử HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ioniza- tion - Mass Spectrometry Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet m: multiplet brs: broad singlet brd: broad doublet dd: doublet of doublets ddd: doublet of doublet of doublets td: triplet of doublets dt: doublet of triplets HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY Các dòng tế bào 9-KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô họng ở người 26-L5 Murine colon carcinoma Ung thư ruột kết ở chuột A-431 Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người A-549 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người
v Bel-7402 Human hepatoma Ung thư gan ở người DU-145 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người HeLa HeLa cell line Tế bào ung thư Hela Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người HT-1080 Human fibrosarcoma bào ung thư biểu mô liên kết di căn ở người KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người L-929 Mouse fibroblast Ung thư biểu mô liên kết sợi ở chuột LNCaP Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người LU Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú ở người NCI-H292 Human lung mucoepidermoid Ung thư biểu mô phổi ở người OCI-AML Acute Myeloid Leukemia cells Tế bào ung thư bạch cầu myeloid cấp tính P-388 Lymphocytic leukemia Ung thư máu lympho (Ung thư bạch cầu) PC-3 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người SK-LU-1 Human Caucasian Lung adenocarcinoma Ung thư phổi ở người SK-N-SH Human neuroblastoma cell line U nguyên bào thần kinh ở người SMMC- 7721 Human hepatocarcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan ở người T-47D Human ductal breast epithelial tumor Ung thư vú ở người U-397 Human leukemic monocyte lymphoma Ung thư máu ở người Các viết tắt khác COX-2 Cyclooxygenase-2 Enzym cyclooxygenase-2 CTPT Công thức phân tử EBV Epstein-Barr Virus Virus Epstein-Barr ED50 Effective Dose Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử
vi FIV Feline immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở động vật họ mèo HSV Herpes simplex virus Virus Herpes simplex HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở người IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử LD50 Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% thú thử MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MMTV Mouse mammary tumour virus Chủng virus gây ung thư vú ở chuột OD Optical Density Mật độ quang ROS Reactive oxygen species Những phần tử hoạt động chứa Oxygen mp Melting point Điểm nóng chảy n-BuOH n-Butanol Ac Acetoxyl CDCl3 Chloroform deuteri (d) Bz Benzoyl DCM Dichloromethane OMe Methoxy DMSO Dimethylsulfoxide Ph Phenyl EtOAc Ethyl acetate Et Ethyl EtOH Ethanol Me Methyl MeOH Methanol Glc Glucose CD3OD Methanol deuteri (d4) TMS Tetramethylsilane Xyl Xylose C Carbon bậc 4 Rf Retardation factor (retention factor) dm Dung môi
vii DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus.........8 Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus.......................9 Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus...14 Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus................16 Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus.....................18 Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus ..................19 Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus ............................33 Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus neriifolius) ..........................................................................................................................40 Bảng 3.1. Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol ...................................................70 Bảng 3.2. Số liệu gán phổ 1 HNMR và 13 CNMR của TT2a và TT2b ..................................72 Bảng 3.3. Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid.........................................74 Bảng 3.4. Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid.........................................................76 Bảng 3.5. Số liệu phổ của chất TT5 và 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid ............................................................................................................................................78 Bảng 3.6. Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430............................................................81 Bảng 3.7. Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside ............................................................................................................................................87 Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-D- glucopyranoside..................................................................................................................93 Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432.............................................97 Bảng 3.10. Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O ...................................100 Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L- rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside.........................................................................104 Bảng 3.12. So sánh số liệu phổ 13 C-NMR của TT7, TT8 và TT9.....................................108 Bảng 3.13. Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8).....................111 Bảng 3.14. Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2 của một số chất sạch ......................................................................................................................112
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3)......3 Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá...............................4 Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài ...............................4 Hình 2.1. Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất.........................47 Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt........................................................................................................................54 Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt........................................................................................................................55 Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt........................................................................................................................56 Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt........................................................................................................................57 Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá .........................................................................................................................58 Hình 2.7. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài...................................................................................................................59 Hình 3.1. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b ................................73 Hình 3.2. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4 .................................................76 Hình 3.3. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6 ...............................79 Hình 3.4. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6 .................................................94 Hình 3.5. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1 ...............................95 Hình 3.6. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11 .............................................100 Hình 3.7. TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10. ............109 Hình 3.8. Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1........................................................................................113 Hình 3.9. Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1. ...............................114 Hình 3.10. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi được xử lí. (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác nhau .......................................................................................................................115
ix PHỤ LỤC Phụ lục 1 Các phổ của hợp chất TT1 PL1 Phụ lục 2 Các phổ của hỗn hợp TT2 PL5 Phụ lục 3 Các phổ của hợp chất TT3 PL13 Phụ lục 4 Các phổ của hợp chất TT4 PL17 Phụ lục 5 Các phổ của hợp chất TT5 PL24 Phụ lục 6 Các phổ của hợp chất TT6 PL28 Phụ lục 7 Các phổ của hợp chất TT12 PL38 Phụ lục 8 Các phổ của hợp chất TF1 PL41 Phụ lục 9 Các phổ của hợp chất TF2 PL45 Phụ lục 10 Các phổ của hợp chất TF3 PL48 Phụ lục 11 Các phổ của hợp chất TF4 PL51 Phụ lục 12 Các phổ của hợp chất TF5 PL53 Phụ lục 13 Các phổ của hợp chất TF7 PL56 Phụ lục 14 Các phổ của hợp chất TP1 PL60 Phụ lục 15 Các phổ của hợp chất TP2 PL64 Phụ lục 16 Các phổ của hợp chất TP3 PL67 Phụ lục 17 Các phổ của hỗn hợp TP5 PL69 Phụ lục 18 Các phổ của hợp chất TP6 PL74 Phụ lục 19 Các phổ của hợp chất TL1 PL80 Phụ lục 20 Các phổ của hợp chất TL3 PL89 Phụ lục 21 Các phổ của hợp chất TS1 PL94 Phụ lục 22 Các phổ của hợp chất TS2 PL97 Phụ lục 23 Các phổ của hợp chất TT11 PL101 Phụ lục 24 Các phổ của hợp chất TF6 PL108 Phụ lục 25 Các phổ của hợp chất TP4 PL113 Phụ lục 26 Các phổ của hợp chất TP7 PL117 Phụ lục 27 Các phổ của hợp chất TL2 PL122 Phụ lục 28 Các phổ của hợp chất TT7 PL126 Phụ lục 29 Các phổ của hợp chất TT8 PL130 Phụ lục 30 Các phổ của hợp chất TT9 PL135 Phụ lục 31 Các phổ của hợp chất TT10 PL147 Phụ lục 32 Các biểu đồ biểu thị kết quả thử hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào OCI-AML của TF3 PL155 Phụ lục 33 Kết quả phân tích protein bằng Western plot của hỗn hợp TT2 với các tế bào OCI-AML PL155
1 MỞ ĐẦU Ngày nay, đi đôi với sự phát triển nhanh chóng về mọi mặt của xã hội loài người là nhiều vấn đề nghiêm trọng mà cả thế giới đang phải đối mặt. Trong tám mục tiêu thiên niên kỷ mà nhân loại cố gắng đạt được trong thế kỷ 21 (gọi tắt là MDGs từ tiếng Anh: Millennium Development Goals), thì vấn đề có liên quan tới sức khỏe của con người là một trong số mục tiêu được đặt lên hàng đầu. Rõ ràng, biến đổi khí hậu đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu cùng với sự ô nhiễm ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng và vấn đề thực phẩm bẩn đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng tiêu cực đến sức khỏe của con người nói riêng và sự sống của toàn thể sinh vật trên trái đất nói chung. Cụ thể là, gần đây nhân loại luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các loại ung thư, các loại bệnh viêm nhiễm, các loại cúm virus, bệnh do virus Ebola, các biến chứng do nhiễm virus Zika, tim mạch, đái tháo đường, vv... Việc tìm ra phương pháp hiệu quả để điều trị các bệnh này là vấn đề vô cùng khó khăn, nó đặt ra nhiều thách thức lớn cho các nhà khoa học. Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Và như thế, người ta có thể sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới. Việt Nam là nước có khí hậu và địa hình rất đa dạng, gồm có bốn miền khí hậu chủ yếu: khí hậu phía Bắc, phía Nam, Trung và nam Trung bộ, khí hậu Biển Đông. Việt nam với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi. Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên và khí hậu như trên đã tạo ra thảm thực vật có đa dạng sinh học cao. Theo những nghiên cứu mới đây ở Việt Nam có hơn 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm, hơn 2000 loài tảo, 537 loài vi tảo, 667 loài rong biển và 15 loài cỏ biển, trong đó nhiều loài được dùng làm thuốc [1]. Trong thảm thực vật phong phú và đa dạng ấy, các loài cây lá kim là những cây rừng quan trọng cả về sinh thái, kinh tế, thương mại và văn hóa. Ngoài nguồn cung cấp gỗ, tinh dầu thông còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, công
2 nghiệp chất béo, vv...), một số loài Thông còn được dùng là vị thuốc dân tộc. Thông còn là môi trường của nhiều loài nấm nội kí sinh, Taxol® (paclitaxel) là thuốc chống ung thư được cho là tốt nhất hiện nay được phát hiện từ loài thông đỏ ở châu Âu. Cũng như các chi khác trong bộ Thông (Pinales), nhiều loài trong chi Pinus L. (Pinaceae) và chi Podocarpus L'Hér. ex Pers. (Podocarpaceae) từ lâu đã gắn bó với đời sống hằng ngày của người dân và cũng được sử dụng trong y học cổ truyền để trị nhiều loại bệnh khác nhau. Trong khi đó, tính tới thời điểm này (2017) tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của trên một trăm loài Pinus và khoảng tám mươi loài Podocarpus nhưng vẫn còn có nhiều loài trong hai chi này hầu như chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu. Trong đó, loài Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) là một loài gần như đặc hữu của Việt Nam và chưa được nghiên cứu về mặt hóa học; Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) và loài Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên cứu nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài này là rất cần thiết, nhằm góp phần tạo cơ sở để hướng đến nghiên cứu khai thác và sử dụng sau này. Chính vì lý do trên, mục tiêu của các nghiên cứu trong luận án này là: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài lá kim: Thông đà lạt (P. dalatensis), Thông ba lá (P. kesiya) và Thông tre lá dài (P. neriifolius) 2. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch tách ra từ các loài trên để tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng vào cuộc sống.
3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu 1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré), tên đồng nghĩa: Pinus wallichiana A.B. Jacks. [2] thuộc họ Thông (Pinaceae). Đây là một loài thông năm lá gần đặc hữu của Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở Đà Lạt và một số vùng lân cận, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở Quảng Nam, Quảng Bình và biên giới Việt-Lào. Cây mọc trong rừng rậm, trên núi trung bình, ở độ cao 1500-2000 m. Cây gỗ to, cao đến hơn 30 m và đường kính thân 0.6-0.8 m [2]. Gỗ không bị mối mọt, được sử dụng trong xây dựng, làm đồ gỗ gia dụng và mỹ nghệ. Đến nay, chưa có công bố nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thành phần hóa học và hoa ̣t tính sinh học của loài này. Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3) (Tiêu bản số VNMN.B000005006 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST) 1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) Thôngbalá(Pinus kesiya Royle ex Gordon; tên đồng nghĩa: Pinus langbianensis A. Chev., Pinus insularis var. khasyana (Griff.) Silba, Pinus yunnanensis Franch.)là một loài lá kim thuộc họ Thông (Pinaceae). Trên thế giới, cây phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam và Philippines. Ở Việt Nam, thông ba lá lần đầu được phát hiện ởcao nguyên Langbiang, đó là loài có diện tích lớn nhất trong số các loài thông ở Việt Nam, phân bố ở Hà Giang, Sơn La, Gia Lai, Kon Tum,... nhưng nhiều nhất (90% diện tích) là trên cao
4 nguyên Langbiang. Lá cây hình kim, thường đính ba lá kim trên một đầu cành ngắn, thường có màu xanh ngọc, mỗi lá kim thường dài 20-25 cm. Đầu cành ngắn đính lá thường có độ dài 1.5 cm, đính cách vòng xoắn ốc trên cành lớn [3]. Cây thường được trồng để lấy gỗ phục vụ cho công nghiệp giấy, ngành xây dựng và mỹ nghệ. Đến nay, chỉ mới có vài công bố về thành phần hóa học và hoạt tính của tinh dầu từ loài này. Gần đây (năm 2013 và 2014), có một vài công bố nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của loài này ở Trung Quốc [4, 5]. Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá (Tiêu bản số VNMN.B000005007 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST) 1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius D. Don) Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài (Tiêu bản số VNMN.B0000050013 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST) Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) là một loài thực vật họ Thông tre
5 (Podocarpaceae). Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng nguyên sinh các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, ĐakLak, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang, Nghệ An, Hà Tĩnh, Yên Bái, Tuyên Quang... và mọc ở độ cao 2300 m ở Vườn quốc gia Bì Đúp - Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng. Cây gỗ cao 20–25 m, đường kính có thể tới 50 cm, thân thẳng, tròn. Vỏ xám nâu, mỏng, nhẵn. Cành lá mọc vòng, màu xanh non hoặc xanh vàng. Lá mọc cách, hình mác dài, đầu nhọn dần, dài 7–15 cm, rộng 0.9–1.9 cm, đầu và đuôi nhọn, đầu mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh vàng. Gân chính nổi ở giữa rõ cả 2 mặt, mép lá cong xuống phía dưới. Cuống lá dài 0.3–0.5 cm, phía dưới có rãnh. Nón đực dạng bông không cuống, thường 3 bông mọc chụm ở nách lá gần đầu cành, khi non hình trứng, khi già hình trụ dài 2–5 cm. Nón cái mọc lẻ ở nách lá, chỉ có một lá noãn phát triển mang một noãn, các lá noãn khác hợp thành đế. Nón hình trứng dài 1.2–1.6 cm, đường kính 0.8–12 cm, đế mập to gần bằng nón, có cuống dài 0.5-1 cm. Có 2 lá bắc sớm rụng, dài 1,5 cm, rộng 1 cm. Hạt hình trứng, dài 1,2–1.6 cm, rộng 1.1 cm, dưới có đế mập, đường kính gần bằng đường kính hạt, quả màu tím [6]. 1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus Về thành phần hóa học thì hầu hết các loài lá kim đều có chứa tinh dầu. Bên cạnh đó, theo thống kê trên thế giới đến nay đã có trên 450 hợp chất được phân lập từ trên một trăm loài thuộc chi Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpenoid, phổ biến nhất là diterpene có khung carbon rất đa dạng như: cembrane pimarane, labdane và abietane; triterpene khung seratane và lanostane, lignan, steroid, các phenol, flavonoid và flavonoid glycoside [7]. 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus Hầu hết các loài trong chi Pinus đều có tinh dầu, có rất nhiều nghiên cứu trong vòng 40 năm trở lại đây chỉ ra rằng thành phần chính của có trong dầu thông của nhiều loài thuộc chi Pinus có chứa chủ yếu là các hợp chất terpenoid như: sesquiterpenoid và monoterpe- noid; trong đó thường hay gặp với hàm lượng cao là các chất α-pinene (1) và β-pinene (2), camphene (3), α-myrcene (4), β-myrcene (5) α-terpineol (6), limonene (7) và α-terpinene (8) [8, 9, 10, 11, 12]; các sesquiterpenoid thường thấy nhất là longifolene (9), caryo- phyllene (10) và germacrene D (11) [10, 11]. Ngoài ra, theo một nghiên cứu gần đây vào
6 2014 về thành phần tinh dầu của loài P. nigra, người ta đã nhận thấy sự có mặt lượng lớn các nhóm chất oxygen–diterpene và sesquiterpene [13]. Trong một công bố vào năm 2015 của Zhouqi Li và các cộng sự, ngoài α-pinene (1) còn tìm thấy thêm hàm lượng β- caryophellen (12) tương đối cao trong tinh dầu ở sáu loài thuộc chi Pinus bản địa ở Trung Quốc [14]. 1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus Các triterpenoid được tìm thấy trong chi Pinus chủ yếu có khung seratane và lanostane. Trong một công bố vào năm 1991, từ vỏ loài thông trắng Trung Quốc P. armandii các nhà khoa học đã tách ra được các chất (13-22) có khung seratane [15]. Từ các loài thông trắng miền Tây ở Bắc Mỹ là P. monticola, và loài thông Luchu P. luchuensis đã tách được tám triterpenoid khung seratane (23-30) trong các công bố vào năm 1984, 1975 và 2001 [16, 17, 18]. Ngoài ra, các seratane triterpenoid kể trên cũng được tìm thấy từ các loài P. massoniana, P. taiwanensis, P. monticola và P. strobus [12]. Các lanostane triterpenoid được tìm thấy chủ yếu từ loài P. monticola và P. luchuensis. Cụ thể là, năm 1981, mười chất (31-40) đã được phân lập từ loài P. monticola [19]; năm 2000, có bốn chất mới (41-44) được xác định từ loài P. luchuensis [20]; năm 2010, hợp chất mới pinusyunnanol (45) được phân lập từ loài P. yunnanensis phân bố ở vùng Vân Nam, Trung Quốc [21]. Ngoài ra trước đó, trong một công bố khác, các chất (24S)-3β-methoxy-5α- lanost-9(11)-ene-24,25-diol (31), (32) và (5α,24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46), (3α,5α,24S)-lanost-9(11)-ene-3,24,25-triol (47) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [18]. Có thể nói diterpenoid là nhóm chất chính có trong chi Pinus. Cho đến nay, các diterpenoid chủ yếu được tách ra từ các loài thuộc chi này có thể chia thành ba nhóm với đặc trưng cấu trúc chứa các bộ khung pimarane, abietane và labdane. Các chất 48-58 thuộc nhóm có khung pimarane thường hay gặp ở loài P. massoniana và P. armandii. Cụ thể là sandaracopimaric acid (49), 2β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-oic acid (53), pimaric acid (54), pimara-8(14),15-dien-18-al (55), 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56) và ent-8,13-epoxylabd-14-en-19-oic acid (57) được tách ra từ loài P. massoniana [12, 22, 23]; từ loài P. armandii đã tách được isopimaric acid (48), isodextropimaric acid (51) cùng với 49 và 54 [12, 24]. Các chất isopimarol (50) và pimarol (52) có trong loài P. kesiya còn
7 manoyl oxide acid (58) đã được tìm thấy trong các loài P. sylvestris, P. nigra và P. pumila [12]. Cho đến nay, trong các loài Pinus thì các chất thuộc nhóm abietane (59-118) được tìm thấy với số lượng nhiều nhất so với các diterpenoid còn lại. Từ loài P. massoniana đã tách được hai mươi ba chất abietane diterpenoid đó là levopimaric acid (60), palustric acid (61), neoabietic acid (62), abietic acid (63), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 7α- hydroxydehydroabietan-18-oic acid (68), 7β- hydroxydehydroabietan-18- oic acid (69), abieta-6,8,11,13-tetraene-15,19-diol (70), 2β-hydroxydehydroabietic acid (72), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 7β-hydroxydehydroabiet-15-enoic acid (76), 13β-ethoxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (90), podocarp-8(14)-ene-7,13-dion-18-oic acid (92), 12α-hydroxydehyroabietic acid (98), abieta-7,13,15-trien-18-oic acid (99), 15- hydroxy-12-oxoabietic acid (100), 12β-methoxyabietic acid (103), 13-hydroxypodocarpa- 8,11,13-trien-18-oic acid (113), 12-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (114), 7β- hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (115), 7α-hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)- en-15-oic acid (116) và 13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (117) trong các công bố vào năm 1993 và 2010 [12, 22, 23]. Trong các năm 2010 và 2011, từ loài P. yunnanensis các nhà khoa học đã phân lập được dehydroabietane (64), 66, abieta-6,8,11,13-tetraene-15,18- diol (71), 73, abiesadine N (75), 15-hydroxy-7-oxodehydroabietic acid (79), 15,18- dihydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (80), 4,15-dihydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7- one (81), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), 4-hydroxy-19-norabieta-8,11,13- trien-7-one (83), abieta-8,11,13-triene-7a ,15,18-triol (84), methyl 7α ,15- dihydroxydehydroabietate (85), 7α,15-dihydroxypodocarp-8(14)-en-13-one (86), 12α,13β- dihydroxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (87), daturabietatriene (93), 18-norabieta- 8,11,13-triene-4,15-diol (94), abiesadine I (95), dehydroabietinol (96), 18-norabieta- 8,11,13-trien-4-ol (97), 12α -methoxyabietic acid (102), pinyunin A (104), pinyunin B (105), 113 và 117 [25, 26]. Ngoài ra, các hợp chất abietane diterpenoid cũng đã được tìm thấy từ các loài P. koraiensis, P. pumila, P. densiflora, P. strobus, P. taeda, P. kesiya, P. armandii, P. sylvestris, P. luchuensis, P. sibirica và P. banksiana trong các công bố khoa học từ năm 1970-2010 [12].
8 Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus Khung Cấu trúc cơ bản Khung Cấu trúc cơ bản seratane pimarane lanostane abietane labdane Các hợp chất labdane diterpenoid (119-159) cũng thường có mặt trong thành phần hóa học của nhiều loài Pinus. Năm 1985, từ loài Thông đen P. nigra, Duane và cộng sự đã tách được: chất 120, labda-13(16),14-dien-8-ol (132), pinifolic acid (133), 4- epiimbricataloic acid (134), dimethyl pinifolate (147), methyl 15-methyl-15-oxolabd- 8(17)-en-18-oate (148), 4-Epiimbricataloate (149) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)- en-13-one (150) [27]. Năm 2002, các chất (E)-communic acid (119), (E)-15-norlabda- 8(17),12-diene-13,19-dioic acid (125), (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid (126) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-en-13-one (150) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [28]. Trong các năm 1991 và 2005, từ loài P. armandii các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được tám labdane, đó là (+)-isocupressic acid (140), demethyl pinusolide (145), 16-hydroxy-14-oxo-15-norlabd-8-en-19-oic acid (152), pinusolide (153), 16- hydroxylabda-8(17),13-diene-15,19-dioic acid butenolide (154), lambertianic acid (155), labda-8(17),13-dien-16,14-olid-18-oic acid (156) và 15-hydroxylabda-8(17),13-dien- 16,14-olid-18-oic acid (157) [24, 29]. Năm 2008, từ loài P. densiflora các nhà khoa học
9 Hàn Quốc đã tách ra được hai labdane là 4-epicommunic acid (120)và (E)-15-nor-14- oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) [30]. Năm 2010, từ loài P. massoniana đã tách được elliotinol (121), (E)-19-acetoxylabda-8(14),12,15-triene (122), 13-epimanool (128) và 8,14-dioxo-8,14-secoabiet-13(15)-en-18-oic acid (138) [23]. Trong các năm 2006, 2008 và 2010, từ loài P. sylvestris các nhà khoa học đã tách được chất 133, 134, 15-acetoxylabd- 8(17)-en-18-oic acid (135), 15-ethyl 18-methyl pinifolate (136), 18-acetoxylabd-8(17)-en- 15-oic acid (137), 15-norpinifolic acid (139), (13E)-18-hydroxylabda-8(17),13-dien-15-yl acetate (142), (13E)-18-acetoxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (143), (13E)-3β- hydroxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (144) và monomethyl pinifolate (146) [12, 31, 32]. Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid khung labdane cũng đã được tìm thấy ở các loài P. pumila, P. sibirica, P. koraiensis, P. radiata, P. strobus và P. banksiana [12]. Hợp chất (14S)-14,17-cyclolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (160) là một là một chất tương đối khác lạ với cấu trúc vòng C có bảy cạnh, đã được phân lập từ vỏ của loài P. strobus [33]. Chất isocembrol (161) và 18-norcembra-2,7,11-trien-4-one (162) là các macrocyclic diterpene có trong dầu-nhựa của loài P. koraiensis [12, 34]. Năm 2009, từ phần ethyl acetate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã tách được một diterpenoid glucoside mới là 9α,13α-epoxy-8β,14β-dihydroxy-abietic acid-18-O- β-D-glucopyranoside (163). Đặc biệt đây là lần đầu tiên hợp chất monoterpenoid glucoside được tìm thấy trong chi này đó là bornyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D- glucopyranoside (164) và bornyl 6-O-β-D-apiofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside (165) [35]. Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus
10
11
12
13
14 1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus Flavonoid cũng là một lớp chất tương đối phổ biến có trong các loài họ Thông nói chung và trong chi Pinus nói riêng. Chiếm đa số trong các chất 166-212 đã được tìm thấy từ các loài Pinus thì chủ yếu là dạng cấu trúc flavone, flavonol, flavanone, flavanonol và một số ít chất khác có cấu trúc flavan-3-ol. Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus Khung Cấu trúc cơ bản Khung Cấu trúc cơ bản flavone flavanone flavonol flavanonol flavan-3-ol Vào năm 1987, từ loài Thông trắng P. morrisonicola Đài Loan, Y.S. Cheng và các cộng sự đã phân lập được chrysin (166), tectochrysin (167), apigenin (168), pinocembrin (169), pinostrobin (170), pinobanksin (171), pinobanksin 3-acetate (172), strobochrysin (173), cryptochrysin (174), genkwanin (175), izalpinin (176), galangin (177), poriol (178), 3-acetoxy-5,7-dihydroxy-6-methylflavanone (179) và 3,5,7-Trihydroxy-6-methyl-fla- vanone (180) [36]. Từ loài Thông trắng P. armandii Trung Quốc, đã phân lập được các flavonoid 166-
15 172, catechin (190) và naringenin 4′,7-dimethyl ether (203) trong các công bố vào năm 1988 và 1991 [12, 29, 37]. Năm 1996, các nhà khoa học Thụy Điển đã phân lập được chất 190, catechin 3-β-D- glucopyranoside (191), 3′-O-methylcatechin (192), (2R,3R)-dihydroquercetin (193), (2R,3R)-dihydroquercetin 3′-O-β-D-glucopyranoside (194), (2R,3R)-dihydroquercetin 7- O-β-D-glucopyranoside (195), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranoside (202), proanthocy- anidin B1-B3 (208-210) và epicatechin-(4β→ 8)-epicatechin-(4β→ 8)-catechin từ loài Thông Scotland P. sylvestris [38]. Trong số đó các chất 209-211 là biflavone và duy nhất một triflavone là 212. Ngoài ra, cũng trong năm này các flavonoid là 6-methyltectochrysin (196), 6-methylpinostrobin (198) và 6-methylchrysin (199) cũng đã được phân lập từ loài P. strobus [39]. Từ loài Thông đuôi ngựa P. massoniana, đã phân lập được các chất 3′,5-dihydroxy- 4′-methoxyflavanone 7-O-𝛼-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (183), 3′,5- dihydroxy-4′-methoxyflavanone 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranoside (184), 4′,5-dihydroxyflavanone 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (185), luteolin (186), luteolin 7-O- β-glucopyranoside (187), quercetin (188), taxifolin (189) và pinocembrin (169) vào năm 2008 [40, 41]. Năm 2009 và 2010, từ phần ethyl ace- tate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã phân lập được các flavonoid glycoside đó là 4′,5,7,8-tetrahydroxy-3-methoxy-6-methylflavone 8-O-β-D-glucopyranoside (181), kaempferol 3-O-β-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182), quercetin 3-O-β-D-glucopyra- noside (197), 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol 3-O-β- D-glucopyranoside (201) [35, 42] Khi nghiên cứu về loài thông lá dẹt P. krempfii Việt Nam, H. Erdtman đã phân lập được bốn flavonoid từ thân gỗ đó là: chrysin (166), strobopinin (204), cryptostrobin (205), demethoxymatteucinol (206). Trong đó, các hợp chất C-methyl flavanoid như 205, 206 và 207 là các hợp chất có cấu trúc rất thú vị [43]. Vào năm 2013, nhóm các nhà khoa học Việt Nam khi nghiên cứu về hóa học rễ loài P. krempfii đã phân lập và xác định cấu trúc được sáu flavononoid đó là tectochrysin (167), pinostrobin (170), pinobanksin (171), galangin
16 (177), 205 và 206. Sàng lọc về hoạt tính sinh học bước đầu cho thấy các chất 171, 177, 206 có hoạt tính tương đối tốt với các dòng tế bào KB, Hep-G2, LU, MCF-7 [44]. Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus
17 1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus Các hợp chất lignan cũng thường được tách ra từ các loài Pinus. Trong đó có, hai benzodioxane là massonianoside E (212) được phân lập từ loài P. massoniana [12] và cupressoside A (213) được phân lập từ loài P. densiflora [42]. Mười một benzofuran neolignan (214-224) đã được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana, P. koraiensis và P. densiflora [12, 45]. Ba lignanolide chứa vòng γ-lactone được xem là các dibenzylbutyrolactone (225-227) đã được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana
18 và P. koraiensis [12]. Bảy tetrahydrofuran (228-234) đã được phân lập từ các loài P. massoniana và P. strobus [12, 39]. Tám oligomeric lignan (235-237) và (239-243) đã được phân lập từ các loài P. massoniana, P. yunnanensis, P. koraiensis và P. sylvestris [12]. Một diepoxylignan là pinoresinol (238); ba arylnaphthalene (244-246) và một dibenzocyclooctene là schizandrin (247) được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana, P. koraiensis và P. roxburghii [12]. Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus
19 1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus Có hai mươi bảy dẫn xuất của phenol và anisole (249-285) được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài thuộc chi Pinus như P. massoniana, P. strobus, P. taeda, P. armandii, P. sylvestris, P. densiflora, P. koraiensis và P. kesiya. Ngoài ra còn có một số loại chất khác như coumarin (286), các acid béo (287-291), các steroid (292-293) và (-) shikimic acid (294) [12, 5, 45]. Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus
20 1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Thông ba lá Năm 2013, từ quả của loài Thông ba lá, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được bốn hợp chất lignan đó là cedrusin (214), matairesinol (225), pinoresinol (238) và dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (248), cùng với một flavonoid là 4′,5,7- trihydroxyflavanonol-3′-O-β-D-glucopyranoside (207) và một phenol là 3,4- dihydroxybenzoic acid (271) [4]. Tiếp sau đó. vào năm 2014, cũng từ quả của loài này đã tách thêm được ba diterpenoid là 15-hydroxydehydroabietic acid (73), imbricatolic acid (158), junicedric acid (159) cùng với hai sterol là 292 và 293 [5]. 1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus
21 Diterpenoid là nhóm chất chủ yếu có trong các loài thuộc chi Thông (Pinus), tiếp đến là các hợp chất flavonoid, lignan và phenol cũng tương đối phổ biến. Trong chi này, các thành phần dầu dễ bay hơi và các phần rất phân cực như dịch chiết cồn, dịch nước chứa nhiều polyphenol và polysaccharide thể hiện nhiều hoạt tính mạnh mẽ nhất như chống oxi hóa, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng HIV, vv… nhiều chất sạch đã được sàng lọc hoạt tính và một số đã cho thấy được chúng là những hoạt chất tiềm năng. Những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính có thể mở ra cơ hội sử dụng các thành phần có hoạt tính từ các loài thuộc chi này để làm thuốc trị bệnh trên người, động vật và cả thực vật. Sau đây là một số thống kê đáng chú ý. 1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau Dịch chiết H2O từ lá của loài P. massoniana cho thấy khả năng làm tăng đáng kể ngưỡng chịu đau và giảm số lượng chuột bị cơn đau quằng quại ở mô hình gây phù tai chuột vào năm 1999 [12]. Khi cho chuột thử nghiệm uống hoặc tiêm qua màng bụng thì các nhà khoa học thấy rằng tinh dầu của loài P. pumila có khả năng ức chế hệ thống thần kinh trung ương và liều gây chết 50% đối tượng thử LD50 = 0,577 ± 0,056 mL/kg [12]. Chiết xuất H2O từ lá của loài P. armandii cũng biểu hiện tỉ lệ ức chế 50.8% tại liều lượng thử 100m g/kg ở mô hình gây phù nề cấp tính cho tai chuột bằng dầu [12]. Vào năm 2007, ở phép thử nghiệm in vivo trên mô hình gây quặn đau bằng acetic acid, mô hình gây đau bằng formalin và mô hình gây đau bằng đĩa nóng tại liều lượng thử tại liều lượng thử 100 mg/kg và 200 mg/kg; kết quả là chiết xuất ethanol từ phấn hoa loài P. densiflora đã tạo ra ức chế đáng kể (thể hiện qua thông số tỉ lệ giảm các cơn đau) ở cả ba mô hình trên khi so sánh với chất đối chiếu là aminopyrine. Thêm vào đó, khả năng kháng viêm của chiết xuất ethanol này cũng được thể hiện qua những thử nghiệm ở chuột trên các mô hình gây phù nề chân bằng carrageenan, bằng formalin và gây phù nề tai bằng arachidonic acid so sánh với chất đối chiếu là indomethacin [46]. Năm 2012, khi nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm và giảm đau của các chất có trong loài P. roxburghii, các nhà khoa học Ấn Độ đã thấy rằng chiết xuất ethanol phần lá của loài này thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể phù nề chân chuột trên mô hình gây phù bằng carrageenan, tại liều lượng thử 100 mg/kg, 300 mg/kg và 500 mg/kg trọng lượng chuột
22 được thử nghiệm khi so sánh với tác nhân đối chiếu là indomethacin; hoạt tính kháng viêm của chiết xuất ethanol còn được thể hiện ở khả năng ức chế các u hạt cấy dưới da chuột (mô hình “cotton pellet granuloma”) khi so sánh với tác nhân đối chiếu là diclofenac sodium. Về hoạt tính giảm đau, cao chiết này cũng thể hiện được hiệu quả đáng kể qua hai mô hình thử nghiệm là mô hình gây đau bằng cách tiêm acetic acid (Acetic Acid Induced Writhing Test) và mô hình giảm đau trung ương theo phương pháp nhúng đuôi chuột (Tail Immersion Test) [47]. Cũng trong năm này, Ipek Suntar và cộng sự phát hiện khả năng chống viêm của tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [48]. Các diterpenoid pinyunin A (104), pinyunin B (105) và hợp chất lignan mới là 2- [2,3-dihydroxy-5-(3-hydroxypropyl)phenyl]-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propane- 1,3-diol (237) thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế COX-2 với tỉ lệ ức chế là 84.83, 83.71 và 88.25% tương ứng trong các phép thử nghiệm in vitro [25, 49]. Các flavonol kaempferol 3-O-𝛽-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182) và 6-methyl- tectochrysin (196) có hoạt tính ức chế đáng kể NO với nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50 lần lượt là 26,8 và 27,1 μg/mL, và còn ức chế ở mức độ vừa phải prostaglandin E2 (PGE2) khi IC50 là 56,2 và 24,8 μg/mL tương ứng [12]. 1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư Hoạt tính này được thể hiện nhiều ở phần cao chiết và tinh dầu, một số chất sạch được tách ra cũng thể hiện được khả năng kháng ung thư đáng quan tâm. Từ những năm 1987, các nhà khoa học Nhật Bản đã thấy rằng, chiết xuất nước nóng từ quả của loài P. parviflora (PCE) có tác dụng ức chế các khối u gây bụng báng (u cổ trướng-ascites tumor cells) trên chuột. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các polysaccharide có tính acid trong chiết xuất từ dịch chiết dung dịch NaOH có hoạt tính mạnh nhất [50]. Sau đó, vào năm 1992, Nagasawa và các cộng sự cũng đã công bố rằng, khi các con chuột đang cho con bú được tiêm tĩnh mạch hoặc uống PCE cùng với dehydrogenation polymer của ferulic acid (DHP- FA) thì thấy có tác dụng ngăn chặn đáng kể sự phát triển của chủng virus gây ung thư vú (mouse mammary tumour virus-MMTV) [51]. Năm 2006, các chiết xuất từ vỏ của loài P. maritima đã chứng tỏ khả năng ngăn ngừa
23 ung thư da trên chuột khi được thử nghiệm trên hai mô hình gây ung thư da bằng bức xạ cực tím (UVR) và mô hình UVR kết hợp với 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) [52]; chiết xuất từ vỏ của loài này cũng được chứng minh có nhiều hoạt tính tốt như tiêu diệt các tế bào ung thư, chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, trị tiểu đường,... và đã được đưa ra thị trường với tên thương phẩm là Pycnogenol® . Trong một công bố vào năm 2007, các nhà khoa học Trung Quốc đã chỉ ra rằng, các procyanidin có trong các chiết xuất từ vỏ của loài P. koraiensis thể hiện tác dụng ức chế sự tăng sinh trưởng cũng như sự biểu hiện của kháng nguyên liên quan đến sự tăng sinh tế bào (proliferating cell nuclear antigen-PCNA) và cả yếu tố hoại tử u α (TNF-α) ở ung thư cổ tử cung trên chuột [53]. Năm 2009, các nhà khoa học đã thấy rằng, các chiết xuất từ vỏ của loài P. pinea và P. sylvestris thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ kháng lại các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3, DU- 145, LNCaP) và ung thư tuyến vú (MCF-7) [54]. Vào năm 2010, một nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng, dịch chiết từ vỏ của loài P. massoniana không chỉ có tác dụng kích hoạt các caspase để cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên (apoptosis) ở các tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2) trong thử nghiệm in vitro mà còn ức chế sự tăng trưởng của các khối u được cấy ghép trên cơ thể chuột qua các phép thử in vivo [55]. Sau đó, vào năm 2012, khi nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của tinh dầu từ lá của loài P. densiflora, các nhà khoa học Hàn Quốc đã thấy rằng tinh dầu này cũng có khả năng cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên của các tế bào ung thư miệng ở người (YD-8) qua việc kích hoạt được các caspase và các phần tử hoạt động chứa oxygen (reactive oxygen species-ROS) [56]. Tiếp theo, năm 2013, một công bố khoa học đã cho thấy rằng polysaccharide từ các chiết xuất ethanol của quả khô loài P. koraiensis cho hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2), trong đó hai chiết xuất sử dụng dịch chiết là dung dịch ethanol 30% và 80% có hoạt tính mạnh nhất [57]. Mới đây, năm 2016, W. Natthida và các cộng sự đã thấy rằng chiết xuất ethanol-H2O (50:50) của cành nhỏ loài thông ba lá P. kesiya khi kết hợp với melphalan theo một tỉ lệ thích hợp cho thấy khả năng gây độc tế bào tốt trên hai dòng tế bào ung thư máu (U-937) và ung thư gan (Hep-G2), quan trọng hơn, sự kết hợp này cũng làm giảm độc tính của melphalan xuống khoảng 4-9 lần [58].
24 Một số chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có những hoạt tính khá thú vị. Cụ thể là, 15-ethyl-18-methyl pinifolate (136) có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung thư ở người như Hela, u nguyên bào thần kinh (SK-N-SH) và ung thư gan (Bel-7402) tại các phép thử in vitro [31]. Một nghiên cứu vào năm 2001 về hợp chất triterpenoid là (5α, 24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46) có hoạt tính ức chế nhẹ khả năng xúc tác của enzyme Topoisomerase II với giá trị IC50 là 186 μM [18]. Các chất isopimaric acid (48) và dehydroabietic acid (66) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ các khối u da ở chuột trên mô hình gây ung thư bằng DMBA và TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate) [59]. Các hợp chất 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56), elliotinol (121) và (E)-19-acetoxylabda- 8(14),12,15-triene (122) cho thấy khả năng kháng mạnh mẽ lại các tế bào ung thư biểu mô (A-431) và ung thư phổi (A549) với giá trị IC50 tương ứng là 1.60, 0.38, 4.74 μM (với dòng tế bào A-431) và 16.44, 2.00, 19.62 μM (với dòng tế bào A-549); người ta giải thích rằng 122 thể hiện hoạt tính mạnh mẽ nhất có thể là do ảnh hưởng của khung labdane và nhóm ester -OAc tại vị trí C-19 [23]. Chất 15-norpinifolic acid (139) thể hiện hoạt tính kháng ung thư trên hai dòng tế bào ung thư ác tính ở người-Hela và dòng tế bào ung thư biểu mô liên kết sợi ở chuột (L-929); hoạt tính của chất này có được có thể là do đặc thù cấu trúc khung labdane kết hợp với vị trí C-15 kém phân cực của phân tử này [32]. Gần đây, vào năm 2014, các nhà khoa học đã thấy rằng, α-terpineol (6)-một monoterpenoid có trong tinh dầu nhiều loài Pinus, có thể kháng lại hai dòng tế bào ung thư Hela và ung thư vú (T-47D). Ngoài ra, 6 còn có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) theo cơ chế kích hoạt lại quá trình chết tự nhiên (apoptosis) của dòng tế bào này bằng cách làm suy giảm số lượng gene Bcl-2 (một loại gene ức chế chết tế bào theo chương trình) và tăng số lượng biểu hiện của các gene Bax [60]. 1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Từ những năm 1994, khả năng kháng vi sinh vật của lá các loài Pinus đã được kiểm chứng qua các thử nghiệm; người ta thấy rằng chúng có hiệu quả trong việc chống lại sự phát triển theo quá trình amôn hóa của các vi sinh vật gây thối trong thực phẩm [12]. Trong những năm về sau đã có thêm nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm từ các dịch chiết của ở loài Pinus. Năm 2006, các nhà khoa học đã thấy rằng dịch chiết
25 nước và alcohol từ lá, thân, vỏ và quả khô của loài P. roxburghii có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh đó là Agrobacterium tumefaciens (gây bệnh khối u cho thực vật), Escherichia coli (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella arizonae (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella Typhi (gây bệnh đường ruột trên người) và Staphylococcus aureus (có khả năng gây cách bệnh ngoài da, gây viêm, mủ trên người) [12]. Tinh dầu của các loài P. densiflora và P. thungergii thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với các dòng Klebsiella pneumoniae (gây ra các bội nhiễm ở đường hô hấp), Shigella flexneri (bệnh lỵ trực khuẩn), Proteus vulgaris (có thể gây ra các viêm nhiễm) với nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu (MIC) đều nhỏ hơn 0.4 mg/mL [61]. Năm 2012, các nhà khoa học Mỹ và Canada đã nghiên cứu ra rằng, một peptide giàu hàm lượng cysteine tên là PmAMP1 được phân lập từ loài P. monticola có khả năng kháng lại các chủng nấm gây bệnh trên loài cải dầu (Brassica napus) [62]. Một công bố khoa học vào năm 2013 cho thấy dầu từ nhựa loài thông Scotland P. slyvestris có khả năng kháng lại mười ba chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng với liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 300 µg/mL; và kháng lại sáu chủng nấm gây bệnh trên thực vật liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 200 µg/mL [63]. Trong một nghiên cứu khác, phần tinh dầu và dịch chiết chloroform của loài P. roxburghii có khả năng ức chế các dòng vi khuẩn thử nghiệm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes (khuẩn liên cầu) [64]. Năm 2014, các nhà khoa học Brazil đã tìm thấy khả năng đầy hứa hẹn về việc sử dụng nhựa-dầu của loài P. elliottii làm thuốc chữa bệnh héo rũ trên hoa màu do vi nấm Sclerotium rolfsii gây ra khi giá trị MIC lên loài này là 1.95 μg/mL. Cũng trong nghiên cứu này, nhựa-dầu của loài P. tropicalis thể hiện hoạt tính tốt kháng lại dòng nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh thán thư trên cây trồng) và Fusarium solani (gây bệnh vàng lá, thối rễ) với giá trị MIC tương ứng là 31.25 μg/mL và 62.5 μg/mL, điều này cũng đã mở ra hy vọng cho việc sử dụng nhựa-dầu loài P. tropicalis làm thuốc sinh học điều trị các bệnh trên cây trồng do một số loài vi nấm gây ra [65]. Gần đây, từ hai loài P. brutia và P. pinea ở vùng Địa Trung Hải, người ta nhận thấy tinh dầu của chúng không những có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm mà còn có khả năng diệt trừ sâu bọ rất tốt. Phát hiện này mở đường cho khả năng sử dụng làm tác nhân bảo vệ thực vật sinh học
26 thân thiện với môi trường [9]. Bên cạnh đó, tinh dầu của một số loài P. halepensis Mill., P. densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt [66, 67]. Nhiều chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả. Các chất diterpenoid abieta-8,11,13-trien-7-ol (65), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 18- hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-8,11,13-trien- 4-ol (97), (E)-communic acid (119) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) đều có khả năng ngăn ngừa mụn khi chúng có hoạt tính ức chế lại chủng vi khuẩn Propionibacterium acnes gây ra mụn ở người [12, 30]. Các nhà khoa học tại đại học London cho rằng isopimaric acid (48) tách từ loài P. nigra có tác dụng kháng lại các chủng đa kháng thuốc (EMRSA) ở loài Staphylococcus aureus [68]. Ngoài ra, đã có những nghiên cứu chỉ ra rằng, hoạt tính kháng khuẩn ở các diterpenoid khung pimarane có được là do nhóm – COOH ở vị trí C-19 và hoạt tính này sẽ tăng thêm hơn nữa khi nhóm carboxyl được thay thế bằng các nhóm chứa oxymethylene (–CH2OR) [69]. Một số hợp chất phenolic như pinobanksin (171), 6-methyltectochrysin (196), (E)-pinosylvin monomethyl ether (249) và pinosylvin (252) có thể kháng lại nấm Cladosporium herbarum (gây bệnh thối rễ ở cây trồng). Ngoài ra, chất 249 và dihydropinosylvin monomethyl ether (257) còn có tác dụng ức chế năm chủng loại nấm gây thối rễ khác và còn có khả năng hoạt hóa enzyme lactase [12]. 1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa Có nhiều nghiên cứu bước đầu khẳng định các chiết xuất của nhiều loài Pinus thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt [12]. Sau đó, cũng có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa của các loài từ chi này. Các polyphenolic từ chiết xuất của hạt loài P. koraiensis thể hiện tính chống oxi hóa tốt qua các phép thử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), HO. và O2 . với giá trị nồng độ 50% tác dụng tối đa EC50 lần lượt là 0,023 ± 0,004 mg/mL, 0,391 ± 0.055 mg/mL và 4,37 ± 0.19 mg/mL tương ứng [70]. Năm 2011, Kim Mihyang và các cộng sự, bằng phương pháp gốc tự do DPPH , đã thấy rằng dịch chiết nước nóng của loài P. densiflora thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ với IC50 = 0,27 mg/mL tương đương với vitamin C (IC50 = 0,26 mg/mL). Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch chiết này
27 cũng có tác dụng ngăn chặn mạnh mẽ lên các LOPs (Lipid Oxidation Products – các sản phẩm oxi hóa lipid bằng gốc tự do peroxide hay superoxide gây tổn thương tế bào) trong gan và hồng cầu của chuột [71]. Chiết xuất alcohol của loài P. roxburghii cũng được chứng minh có hoạt tính chống oxi hóa tốt qua các thử nghiệm theo phương pháp TEAC (xác định hoạt tính chống oxi hóa khi so sánh với khả năng chống oxi hóa của Trolox) [72]. Năm 2016, nghiên cứu về chiết xuất methanol của nhựa loài P. nigra đã hứa hẹn rằng chúng sẽ sử dụng như là một chất chống oxi hóa tự nhiên khi nó thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tương đối tốt trên các phép thử nghiệm DPPH, tạo phức chelate với Fe2+ , TEAC, dọn hydrogen peroxide (H2O2) và dọn gốc tự do peroxide (O2 .– ) [73]. Các chất như 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol 3- O-β-D-glucopyranoside (201) có khả năng “quét dọn” các gốc NO3 – rất tốt với các giá trị IC50 tương ứng là 3,86 ± 0,41 μM và 4,02 ± 0,18 μM trong khi giá trị IC50 của chất so sánh L-penicillamine là 3,04 ± 0,74 μM [35]. 1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác Các chất isopimaric acid (48), sandaracopimaric acid (49) neoabietic acid (62), dehydroabietic acid (66) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid (126) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ chủng virus có thể gây ung thư máu, ung thư vòm-mũi họng Epstein-Barr (EBV) [28, 59]. Các thử nghiệm dược lý cũng cho thấy rằng abietic acid (63) có tác dụng chống co thắt [12]. Các phức lignin-carbohydrate (Lignin – carbohydrate complexes: LCC) có trong quả khô và hạt của nhiều loài Pinus như P. parviflora, P. densiflora, P. thunbergii, P. elliottii, P. taeda, P. caribaea, P. sylvestris và P. armadii được cho là có khả năng ức chế sự phát triển của của dòng virus nguy hiểm trên người HSV (Herpes Simplex Virus), đây là loại virus gây mụn mủ, lở loét ở da, niêm mạc phần trên của cơ thể như mắt, mũi, miệng và bộ phận sinh dục [74]. Các hợp chất polysaccharide có tính acid từ loài P. parviflora được cho là có khả năng kháng lại các virus cúm theo cách ức chế, “đầu độc” quá trình tổng hợp protein và enzyme quan trọng trong quá trình tự nhân đôi của DNA (enzyme RNA-dependent RNA polymerase) [75]. Năm 1998, Masatoshi Nakano và các cộng sự đã một nghiên cứu cho thấy rằng chiết xuất kiềm từ vỏ hạt loài P. koraiensis có khả năng ức chế virus gây suy
28 giảm miễn dịch mắc phải ở người (HIV) và ở động vật họ mèo (FIV) qua các phép thử in vivo [76]. Những năm sau đó, cũng có những công bố khoa học cho thấy khả năng kháng HIV của dịch chiết từ quả khô các loài P.nigra, P. parvifloria và P. elliottii. Đặc biệt là vào năm 2012, các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng chiết xuất từ quả khô của loài P. yunnanensis được xem như là nhóm ức chế men phiên mã ngược (reverse transcriptase inhibitors= RTI) trong điều trị HIV bởi vì nó có khả năng ức chế mạnh các chủng virus trong phòng thí nghiệm HIV-1IIIB, HIV-1RF, HIV-1A17, HIV-1AO18 và HIV-2ROD. Tất cả các nghiên cứu về hoạt tính kháng HIV được nêu ở trên đã mở ra hy vọng lớn về việc sử dụng các chiết xuất từ quả khô của các loài Pinus như là một tác nhân để điều trị HIV trong tương lai [77]. Năm 2011, nghiên cứu chiết xuất alcohol của loài P. roxburghii cho thấy hoạt tính chống rối loạn lipid trong máu (antidyslipidemic) khi làm giảm đáng kể triglyceride huyết tương (TG), cholesterol tổng (TC) và glicerol (Gly) trên những chú chuột Hamster được thử nghiệm. Trong một công bố vào năm 2012, chiết xuất dầu từ gỗ của loài này cũng cho thấy hoạt tính bảo vệ gan qua các phép thử in vivo trên chuột bị gây tổn thương gan bằng chloroform và ethanol. Hơn nữa, dịch chiết ethanol từ loài này được đánh giá là có tác dụng trị hen, co thắt phế quản trên các phép thử in vitro và cả in vivo. Tới năm 2015, các nhà khoa học Ấn Độ đã nhận thấy rằng, dịch chiết ethanol cũng như hợp chất flavonoid là quercetin (188) được tách ra từ vỏ của loài P. Roxburghii có khả năng ức chế enzyme α- amylase đã mở ra hi vọng sử dụng chúng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường [78, 79]. Ngoài ra, tinh dầu nhiều loài thông trong chi Pinus còn có tác dụng tiêu diệt ấu trùng của loài muỗi vằn hổ Aedes albopictus – một loài sinh vật trung gian gây nhiều bệnh nguy hiểm, đặc biệt là sốt xuất huyết [11]. Gần đây nhất, vào năm 2016, khi nghiên cứu tinh dầu của loài thông ba lá P. kesiya ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng nó có hoạt tính chống lại các loài ấu trùng muỗi gây các bệnh sốt rét, sốt xuất huyết và giun chỉ bạch huyết [80]. 1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Podocarpus.
29 Chi Thông tre (Podocarpus) là một chi lớn của họ Kim giao (Podocarpaceae), có khoảng 105 loài, phân bố chủ yếu ở bắc bán cầu [81]. Có nhiều loài trong chi này đã được quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Có thể liệt kê ra một số công bố đáng chú ý sau đây. Trong công bố vào năm 1976, từ nhiều loài Podocarpus khác nhau được thu thập từ các đại lục Á, Âu, Phi ; New Zealand và Brazil; Robert B. Bates và các cộng sự đã phân lập và chứng minh được cấu trúc các hợp chất norditerpene dilactone như inumakilactone A (295), nagilactone C (296), podolactone A (297), nagilactone A (298) và sellowin B (299) dựa trên một số biến đổi hóa học và các phương pháp phổ, đặc biệt là X-Ray đơn tinh thể [82]. Năm 1977, quả và vỏ rễ của loài P. nagi, Yuji Hayashi và các cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc của một số norditerpene dilactone đó là 15-hydroxy-nagilactone D (300), 3β-hydroxy-nagilactone A (301), 1β,2β-dihydroxy-nagilactone D (302), 15- methoxycarbonyl-nagilactone D (303), 1-deoxy-2α-hydroxy-nagilactone A (304), 16- hydroxy-podolide (305), 2,3-dihydro-16-hydroxy-podolide (306) và 2β,3β -epoxy- podolide (307) [83, 84, 85]. Năm 1990, từ vỏ rễ loài này, đã tách được ba hợp chất norditerpene dilactone đó là 2,3-dehydro-16-hydroxy-nagilactone F (308), nagilactone I (309) và l6-hydroxy-nagilactone E (310) [86]. Trong năm 1991, khi nghiên cứu thành phần hóa học của lá và vỏ rễ loài P. nagi, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được một số norditerpene dilactone mới đó là 2α-hydroxy-nagilactone F (311), 3-deoxy-2α- hydroxynagilactone E (312), 3-epinagilactone C (313) và nagilactone J (314). Thử nghiệm ban đầu về hoạt tính đã cho thấy chất 311 có khả năng kháng lại chủng nấm Saccharomyces cerecisiae-có thể gây ra một số bệnh về đường ruột trên người và động vật [87, 88, 89]. Sau đó, vào năm 1993, ba norditerpene dilactone mới đã được phân lập từ vỏ rễ của loài này đó là 1-deoxynagilactone A (315), 1-deoxy-2,3-dehydronagilactone A (316) và 2,3- dehydronagilactone A (317) [90]. Năm 1995, đã có ba hợp chất diterpene dilactone glycoside của nagilactone C-E (318-320) được phân lập từ dịch nước vỏ hạt loài P. nagi [91]. Trong một công bố vào năm 1996, H. Haraguchi và các cộng sự đã chỉ ra rằng totarol (321) được tách ra từ loài P. nagi có hoạt tính chống oxi hóa tốt, nó không những ức chế
30 quá trình peroxide hóa lipid mà còn thể hiện khả năng bảo vệ tế bào hồng cầu kháng lại sự huyết tán (hemolysis). Hơn nữa 321 còn được chứng minh có khả năng bảo vệ các hệ thống sinh học bằng cách chống lại quá trình ”stress oxi hóa” trong cơ thể [92]. Năm 1999, đã có hai diterpene dilactone glycoside mới với phần đường là một trisaccharide đã được phân lập từ loài này đó là 1-deoxy-nagilactone A-2α-O-β-D-glucopyranosyl-(1–3)-β-D- glucopyranosyl-(1–6) -β-D-glucopyranoside (322) và 1-deoxy-nagilactone A-2α-O-β-D- glucopyranosyl-(1–6)-β-D-glucopyranosyl-(1–3)-β-D-glucopyranoside (323) cùng với năm chất diterpene dilactone glycoside đã biết gồm (318-320) và (324-325) [93]. Thú vị là vào năm 2012, hai hợp chất cyclopeptide đó là nagitide A (326) và nagitide B (327) đã được phân lập từ chiết xuất CH2Cl2 và EtOAc của vỏ rễ loài P. nagi bởi Yang Ye và các cộng sự [94]. Gần đây nhất, năm 2017, từ chiết xuất EtOAc của lá loài P. nagi, Yegao Chen cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc được bốn chất là nagiol A (328), sugiol (329), 2,3-dihydroxyferruginol (330) và 298, trong đó 328 là một abietane mono- norditerpenoid mới [95]. Năm 1979, từ vỏ thân loài P. milanjianus và P. sellowii các nhà khoa học Mỹ và Brazil đã phân lập được nagilactone F (331) và nagilactone G (332). Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy chất 332 có khả năng kháng lại tế bào ung thư biểu mô họng người (9-KB) với ED50 = 10-2 µg/mL [96]. Một năm sau đó, từ loài P. milanjianus nhóm nghiên cứu này cũng đã tách và xác định thêm được hai chất có hoạt tính kháng lại tế bào 9-KB là milanjilactone A (333) và milanjilactone B (334) với giá trị ED50 tương ứng là 4 µg/mL và 10-1 µg/mL [97]. Tới năm 1984, podolactone C (335) cũng đã được phân lập và chứng minh lại cấu trúc đúng hơn của nó với cấu trúc 2,3-β-epoxide cùng với đặc trưng lập thể tại vị trí C-4, C-6 và C-15. Bước đầu sàng lọc hoạt tính cho thấy 335 có mức độ kháng trung bình đối với tế bào ung thư bạch cầu P-388 [98]. Trong một công bố năm 2005, từ vỏ rễ loài đã tách và xác định được chín hợp chất đó là β-sitosterol (292), daucosterol (293), 321, 331, 332, 335, nagilactone D (336), 19-hydroxytotarol (337) và stigmasterol (338) [99]. Năm 1999, Roy Stahlhut và các cộng sự khi sàng lọc về hoạt tính sinh học của loài P. gracilior đã nhận thấy rằng có sự tồn tại một lượng nhỏ hoạt chất kháng ung thư rất tốt là taxol (339) trong cuống lá và lá của loài này. Đây cũng là lần đầu tiên taxol được chứng
31 minh là có ở một loài thực vật không thuộc họ Thông đỏ (Taxaceae) [100]. Trong một công bố vào năm 2012, từ lá của loài này, Alessandra Braca và các cộng sự đã phân lập được ba terpenoid mới đó là 2α,16-dihydroxy-4β-carboxy-O-β-D-glucopyranosyl-19-nor-totarol (340), nagilactone K (341) và 15-hydroxy phaseic acid (342) [101]. Năm 2003 từ loài Tùng La hán lá dài P. macrophyllus đã phân lập được hai hợp chất có cấu trúc lập thể đối nhau tại vị trí chứa nguyên tử lưu huỳnh đó là SR-podolactone D (343) và SS-podolactone D (344), trong đó 343 là một chất mới [102]. Năm 2004, từ lá loài này, nhóm tác giả trên đã phân lập được mười chất, trong đó có 335, 343, 344, hallactone B (345) cùng với sáu norditerpene dilactone mới có chứa lưu huỳnh là các rakanmakilactone A–F (346-351), đặc biệt hợp chất rakanmakilactone E (350) có chứa nguyên tử chlorine trong phân tử. Qua các thử nghiệm in vitro cho thấy các chất 335, 343, 344 và các rakanmakilactone A–F (346-351) đều có hoạt tính kháng lại tế bào ung thư bạch cầu P-388 với các gí trị IC50 tương ứng là 0,16, 0,52, 0,23, 0,31, 0,18, 0,29, 0,25, 5,0, và 4,3 µg/mL [103]. Năm 2007, cũng từ loài này, Mei-Hsien Lee và các cộng sự đã phân lập được một biflavonoid mới là 2,3-dihydro-4′,4′′′-di-O-methylamentoflavone (352), và năm hợp chất đã được biết đến là quercetin (188), 2,3-dihydrosciadopitysin (353), (-)-catechin (354), sciadopitysin (355), và isoginkgetin (356). Các hợp chất này được thử nghiệm khả năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase chống lại quá trình tổng hợp ra chất tạo ra melanin trong biểu bì hắc tố con người (HEMn). Kết quả cho thấy 352 có thể ức chế tyrosinase mạnh với IC50 = 0,098 mM [104]. Trong một công bố vào năm 2014, từ cành lá và lá loài P. macrophyllus, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được một chất mới là podocarflavone A (357) cùng với mười lăm flavonoid đã biết đó là apigenin (168), luteolin (186), luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside (187), 188, quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside (197), 356, amentoflavone (358), hinokiflavone (359), apigenin-7-O-(-D- glucopyranoside) (360), tricin (361), salvigenin (362), ladanein (363), norartocarpesin (364), avicularin (365) và pedalitin-3′-O-glucoside (366). Các phép thử in vitro cho thấy các flavonoid 188, 197, 356 và 358 có hoạt tính chống oxi hóa tốt. Ngoài ra, các chất 186- 188, 197 và 358 có tác dụng bảo vệ tim mạch theo cách làm suy giảm nồng H2O2 nội sinh- nguyên nhân gây chết tự nhiên của tế bào cơ tim (H9c2) trong ống nghiệm [105]. Mới đây,
32 năm 2016, từ vỏ của loài này, Ye-Gao Chen và cộng sự đã phân lập được mười lăm chất sạch đó là 73, ferulic acid (264), 15-methoxydehydroabietic acid (367), 7α- hydroxydehydroabietic acid (368), methyl trans-ferulate (369), methyl 22-O- feruloyloxydocosanoate (370), vanillic acid (371), 2,6-dihydroxy-3,4-dimethylbenzoic acid methyl ester (372), các lignan (373-375), một flavonoid là sideroxylin (376) và ba steroid 292, 7-ketositosterol (377), 3β,5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-diene (378) [106]. Năm 2011, từ chiết xuất CH2Cl2-MeOH của vỏ rễ loài P. latifolius, John A. Beutler và các cộng sự đã phân lập được sáu chất, trong đó có ba diterpenoid mới là cycloinumakiol (379), inumakal (380), inumakoic acid (381) cùng với ba chất đã biết là 331, inumakilactone B (382)và inumakilactone (383). Qua phép thử AP-1 cho thấy hợp chất 331 và 383 có hoạt tính ức chế AP-1 (một protein hoạt hóa, được kích hoạt bởi 12-otetradecanoyl phorbol-13- acetate (TPA)) với IC50 tương ứng là 1,5 và 4 µM, kết quả này cho thấy hai chất trên rất có tiềm năng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh ung thư [107]. Năm 2012, từ lá của loài P. elongatus, Alessandra Braca và các cộng sự đã phân lập được tám hợp chất glycoside mới bao gồm nagilactone C 7-O-α-L-arabinopyranosyl- (1→4)-β-D-xylopyranoside (384), nagilactone C 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D- xylopyranoside (385), nagilactone C 7-O-β-D-xylopyranoside (386), nagilactone A 7-O-α- L-arabinopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranoside (387), 2β,15S,16,17,19-pentahydroxy-iso pimar-8(14)-ene 17-O-β-D-glucopyranoside (388), 2β,15R,16,17,19-pentahydroxy-iso pimar-8(14)-ene 17-O-β-D-glucopyranoside (389), một dẫn xuất ionol là 1-(2,6,6- trimethyl-4-hydroxycyclohexenyl)-1-hydroxy-buta-1-en-3-one 4-O-β-D-glucopyranoside (390) và một flavone C-glycoside đó là vitexin 2′′-O-β-D-(6′′′-acetyl)-glucopyranoside (391) [108]. Năm 2013, từ loài P. fleuryi các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được tổng cộng mười bảy chất trong đó có tám abietane diterpenoid đó là 337, các fleuryinol A–C (392-394), 19-hydroxyferruginol (395), lambertic acid (396), inumakiol D (397) và totaradiol (398), các chất 392-394 là những chất mới. Bước đầu sàng lọc hoạt tính cho thấy 393 và 395 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan (SMMC-7721) và ung thư phổi (A-549); riêng chất mới 393 còn
33 thể hiện mức độ ức chế trung bình đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu (HL-60) và ung thư vú (MCF-7) [109]. Trong năm nay, 2017, cũng từ loài này đã phân lập được một sterol mới có cấu trúc hiếm gặp với dạng bốn vòng ngưng tụ kiểu [6/5/6/5] đó là 3β,5β,6- trihydroxyl-B-norsitostane (399) cùng với mười hợp chất đã biết là 381, 396, sitostenone (400), β-sitosterol linoleate (401), 4β-hydroxyl-4(20→5),10(18→9)- abeopimar-15(16)- ene (402), secoisolariciresinol-9,9′-acetonide (403), 3,4-dimethoxy-benzyl alcohol (404), p-hydroxybenzyl alcohol (405), chrysophanol (406) và (−)-epicatechin (407) [110]. Năm 2014, từ loài P. imbricatus, Xiao-Ning Wang và các cộng sự phân lập được bảy chất trong đó có năm chất đã biết là abieta-8,11,13-triene-3β,6β,12-triol (408), margoclin (409), agathic acid (410), 6β-hydroxyisocupressic acid (411) và sanjoinenine (412) cùng với hai chất mới là podoimbricatin A (413) và podoimbricatin B (414). Chất 412 là một cyclic peptide, chất 413 là một diterpenoid có cấu trúc hiếm gặp với dạng bốn vòng ngưng tụ kiểu [6/6/5/6] còn 414 là một abietane mới. Qua các phép thử in vitro cho thấy 411, 413 và 414 có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung thư phổi (A-549) và ung thư biểu mô phổi (NCI-H292) [111]. Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus
34
35
36
37
38
39 1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) Trong khoảng thập niên 70 của thế kỉ 20, loài thông tre lá dài đã được nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Điển hình như, trong công bố vào năm 1971, nhóm các nhà khoa học người Australia đã phân lập được podolactone C (335) và podolactone D (344) [112]. Tuy nhiên, công bố này đã đề xuất cấu trúc cho 335 là chưa thật chính xác, sau đó, 335 đã được chứng minh lại cấu trúc đúng của nó bởi John M. Cassady và các cộng sự dựa trên phương pháp X-Ray đơn tinh thể [98]. Năm 1974, các chất dạng biflavone như isoginkgetin (356), amentoflavone (358), podocarpusflavone A (415) và podocarpusflavone B (416) đã được phân lập từ lá của loài này [113]. Cũng trong năm 1974, ở một công bố khác, từ bộ phận lá, nhóm tác giả trên đã phân lập được các chất 7,4′-dimethylaromadendrin (417) và 7,4′-dimethylaromadendrin 5-glucoside (418) [114]. Gần đây cũng đã có một vài công bố đáng chú ý, đó là vào năm 2001, nagilactone C (296) được tách ra từ loài này có hoạt tính chống tăng sinh đối với các dòng tế bào ung thư biểu mô liên kết di căn ở người (HT-1080) và ung thư ruột kết ở chuột (26-L5) với giá trị ED50 tương ứng là 2.3 và 1.2 µg/mL [115]. Năm 2017, từ phần chiết xuất tan trong EtOAc của lá loài P. neriifolius, Yegao Chen và các cộng sự đã phân lập được hai chất mới là neriitide A (419), neriilignan (420) cùng với sáu chất đã biết gồm ba sesquiterpenoid spatulenol (421), 10α-epoxyaromadendrane (422), blumenol C (423); hai diterpenoid isopimaric acid (48), Δ8,9 isopimaric acid (424); một sterol là 5α,6β-dihydroxysitosterol (425) [116].
40 Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus neriifolius) ❖ Nhận xét chung - Các nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Pinus và chi Podocarpus chủ yếu tập trung vào các loài phân bố phổ biến ở châu Á và nhiều nhất là ở Trung Quốc. Ở Việt Nam có khoảng 09 loài Pinus và 03 loài Podo- carpus; phân bố nhiều ở Tây nguyên, tuy nhiên những công bố mới chỉ tập trung về thực vật học, còn về thành phần hóa học và hoạt tính mới chưa nhiều và chưa có hệ thống - Thành phần hóa học của các loài trong hai chi này tương đối đa dạng, và nổi trội là các hợp chất diterpenoid với nhiều khung cấu trúc khác nhau. - Từ cơ sở trên, luận án tập trung nghiên cứu 03 loài sau:
41 Thông đà lạt (Pinus dalatensis): trên thế giới, chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Bộ phận được chọn để nghiên cứu là gỗ (chứa nhựa Thông) và lá (tùng diệp) vì chúng đã được sử dụng như là một vị thuốc trong y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh khác nhau. Thông ba lá (Pinus kesiya): chỉ có những nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học tại Trung Quốc. Ở Việt Nam, loài này hầu như chưa được nghiên cứu về hóa học. Bộ phận được chọn để nghiên cứu là rễ (tùng tiết) vì nó được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa lo âu, mất ngủ; giúp an thần, trừ thấp. Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius): bộ phận lá đã được nghiên cứu nhiều ở nước ngoài. Loài này có thành phần hóa học phong phú, có nhiều cấu trúc mới, là những chất ít gặp trong thiên nhiên và có hoạt tính sinh học thú vị và cũng chưa được nghiên cứu kỹ về mặt hóa học. Loài này phân bố ở Việt Nam tương đối ít nên để không làm ảnh hưởng nhiều tới sự sinh trưởng và phát triển của quần thể, tác giả đã thu lấy mẫu gỗ (cành) để nghiên cứu thành phần hóa học.
42 Chương 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học Thân gỗ và lá Thông đà lạt (Pinus dalatensis) cùng với thân gỗ loài Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) thu tại Lâm Đồng, vào tháng 1/2013. Rễ Thông ba lá Pinus kesiya được thu tại DakLak vào tháng 8/2015. Tất cả các mẫu trên đều được TS. Nguyễn Tiến Hiệp định danh và có tiêu bản tương ứng là VNMN.B000005006, VNMN.B0000050013 và VNMN.B000005007 được giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu Các mẫu thực vật sau khi thu hái được cắt nhỏ, phơi khô dưới nắng sau đó sấy ở nhiệt độ 40-45 0 C rồi đem nghiền nhỏ. Tất cả các mẫu thực vật được chiết theo quy trình chung như sau: đem chiết các mẫu đã được xay nhỏ ba lần với hỗn hợp dung môi MeOH-H2O ở nhiệt độ phòng. Lọc các dịch chiết, cô đặc dưới áp suất giảm thu được chiết xuất MeOH-H2O. Chiết xuất này được hòa vào nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, EtOAc và n-butanol. Quay cất dung môi dưới áp suất thấp thu được các chiết xuất tương ứng. 2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký lọc Gel. Sắc ký lớp mỏng (TLC) được dùng để khảo sát sơ bộ thành phần các chất trong chiết xuất, trong các phân đoạn chạy cột và kiểm tra chất sạch. Sự triển khai sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck). Dung môi triển khai là hỗn hợp các dung môi thông dụng trong phòng thí nghiệm như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH, EtOH và H2O. Sắc ký cột thường pha thuận với chất hấp phụ là silica gel 60, cỡ hạt 0.040-0.063 mm (230-400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane:CH2Cl2, n-hexane:EtOAc, n-hexane:acetone, CH2Cl2:EtOAc, CH2Cl2:acetone,
43 CH2Cl2:MeOH, CH2Cl2:MeOH:H2O, vv… với các tỉ lệ thích hợp. Sắc ký cột thường pha đảo với chất hấp phụ là RP-18, hệ dung môi dùng để rửa giải là MeOH:H2O, acetone:H2O, acetonitrile:H2O, vv... với tỉ lệ thích hợp Sắc ký lọc Gel (GFC) dùng Sephadex LH20 làm pha tĩnh với dung môi chạy cột là MeOH hoặc CH2Cl2:MeOH với tỉ lệ CH2Cl2<10%. 2.4. Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp và phân tích những số liệu thu được từ các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1 H-1 H-COSY, NOESY). 2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học ▪ Thực hiện ở Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các tế bào ung thư KB ở người được cung cấp bởi ATCC Các tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370 C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn (phương pháp Monks). Cách thử độc tế bào như sau: Cho 200 μL dung dịch tế bào ở nồng độ 3,104 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Recommended

Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...
Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...
Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...
Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
Tìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinaken
Tìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinakenTìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinaken
Tìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinaken
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm
Luận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩmLuận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm
Luận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Giao trinh enzyme 7662
Giao trinh enzyme 7662Giao trinh enzyme 7662
Giao trinh enzyme 7662
chuvantai Cvt
 
Chuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzyme
Chuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzymeChuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzyme
Chuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzyme
Nguyen Thanh Tu Collection
 
Tài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menTài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm men
visinh11012
 

Recommended

Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...
Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...
Luận văn HAY: Quản lý hoạt động văn hóa học đường của học sinh trung học phổ ...
Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
Tìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinaken
Tìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinakenTìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinaken
Tìm hiểu quy trình kiểm tra chất lượng bia thành phẩm của công ty bia vinaken
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Ứng phó với hành vi bạo lực học đường của học sinh - Gửi miễn phí qu...
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm
Luận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩmLuận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm
Luận văn: Xác định hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Giao trinh enzyme 7662
Giao trinh enzyme 7662Giao trinh enzyme 7662
Giao trinh enzyme 7662
chuvantai Cvt
 
Chuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzyme
Chuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzymeChuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzyme
Chuong 2 nguyen lieu va quy trinh san xuat che pham enzyme
Nguyen Thanh Tu Collection
 
Tài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menTài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm men
visinh11012
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Giáo trình công nghệ protein
Giáo trình công nghệ proteinGiáo trình công nghệ protein
Giáo trình công nghệ protein
Tử Dương Xanh
 
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Chất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặtChất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặt
107751101137
 
Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10
Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10
Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...
nataliej4
 
Tiet 8 sản xuất enzym 1
Tiet 8 sản xuất enzym 1Tiet 8 sản xuất enzym 1
Tiet 8 sản xuất enzym 1
Chu Kien
 
Bài giảng Xử lý nước thải công nghiệp
Bài giảng Xử lý nước thải công nghiệpBài giảng Xử lý nước thải công nghiệp
Bài giảng Xử lý nước thải công nghiệp
Nhuoc Tran
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAY
Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAYNghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAY
Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Giáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái học
Giáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái họcGiáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái học
Giáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái học
Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
2017 Hoàng Kim. Đề Cương
2017 Hoàng Kim. Đề Cương 2017 Hoàng Kim. Đề Cương
2017 Hoàng Kim. Đề Cương
FOODCROPS
 
Một số công cụ đánh giá năng lực
Một số công cụ đánh giá năng lựcMột số công cụ đánh giá năng lực
Một số công cụ đánh giá năng lực
Diu Diu
 
Luận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAY
Luận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAYLuận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAY
Luận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đ
Luận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đLuận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đ
Luận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đ
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdf
Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdfThực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdf
Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdf
Man_Ebook
 
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
jackjohn45
 
Luận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà Tĩnh
Luận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà TĩnhLuận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà Tĩnh
Luận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà Tĩnh
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...
Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...
Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...
Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 

More Related Content

What's hot

Chất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặtChất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặt
107751101137
 
Tiet 8 sản xuất enzym 1
Tiet 8 sản xuất enzym 1Tiet 8 sản xuất enzym 1
Tiet 8 sản xuất enzym 1
Chu Kien
 

What's hot (20)

Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
 
Giáo trình công nghệ protein
Giáo trình công nghệ proteinGiáo trình công nghệ protein
Giáo trình công nghệ protein
 
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ ch...
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
 
Chất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặtChất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặt
 
Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10
Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10
Luận văn: Phương pháp dạy học dự án trong dạy hóa học lớp 10
 
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
 
Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide...
 
Tiet 8 sản xuất enzym 1
Tiet 8 sản xuất enzym 1Tiet 8 sản xuất enzym 1
Tiet 8 sản xuất enzym 1
 
Bài giảng Xử lý nước thải công nghiệp
Bài giảng Xử lý nước thải công nghiệpBài giảng Xử lý nước thải công nghiệp
Bài giảng Xử lý nước thải công nghiệp
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
 
Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAY
Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAYNghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAY
Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn thuộc ngành Myxomycota, HAY
 
Giáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái học
Giáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái họcGiáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái học
Giáo dục môi trường thông qua các hoạt động trải nghiệm sinh thái học
 
2017 Hoàng Kim. Đề Cương
2017 Hoàng Kim. Đề Cương 2017 Hoàng Kim. Đề Cương
2017 Hoàng Kim. Đề Cương
 
Một số công cụ đánh giá năng lực
Một số công cụ đánh giá năng lựcMột số công cụ đánh giá năng lực
Một số công cụ đánh giá năng lực
 
Luận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAY
Luận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAYLuận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAY
Luận văn: Công tác đối với bệnh nhân bị bạo lực học đường, HAY
 
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
 
Luận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đ
Luận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đLuận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đ
Luận văn: Website hỗ trợ học sinh tự học phần hóa hữu cơ, 9đ
 
Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdf
Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdfThực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdf
Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường - Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu.pdf
 
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
 

Similar to Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...
Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...
Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...
Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...
Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...
https://www.facebook.com/garmentspace
 

Similar to Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620 (20)

Luận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà Tĩnh
Luận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà TĩnhLuận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà Tĩnh
Luận án: Sử dụng đất sản xuất nông nghiệp bền vững tỉnh Hà Tĩnh
 
Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...
Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...
Luận án: Hiệu quả can thiệp thay đổi kiến thức, thái độ, thực hành phòng chốn...
 
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh của loài Ardisia - Gửi miễn phí...
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh của loài Ardisia - Gửi miễn phí...Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh của loài Ardisia - Gửi miễn phí...
Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh của loài Ardisia - Gửi miễn phí...
 
Luận án: Nghiên cứu đánh giá tai biến môi trường liên quan đến hoạt động kh...
Luận án: Nghiên cứu đánh giá tai biến môi trường liên quan đến hoạt động kh...Luận án: Nghiên cứu đánh giá tai biến môi trường liên quan đến hoạt động kh...
Luận án: Nghiên cứu đánh giá tai biến môi trường liên quan đến hoạt động kh...
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
 
Luận án: Hoạt hóa bùn đỏ để hấp phụ anion ô nhiễm nguồn nước - Gửi miễn phí q...
Luận án: Hoạt hóa bùn đỏ để hấp phụ anion ô nhiễm nguồn nước - Gửi miễn phí q...Luận án: Hoạt hóa bùn đỏ để hấp phụ anion ô nhiễm nguồn nước - Gửi miễn phí q...
Luận án: Hoạt hóa bùn đỏ để hấp phụ anion ô nhiễm nguồn nước - Gửi miễn phí q...
 
Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall.
Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall.Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall.
Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall.
 
Luận án: Thành phần loài và phân bố của giáp xác nước ngọt, HAY
Luận án: Thành phần loài và phân bố của giáp xác nước ngọt, HAYLuận án: Thành phần loài và phân bố của giáp xác nước ngọt, HAY
Luận án: Thành phần loài và phân bố của giáp xác nước ngọt, HAY
 
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdfNghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
 
Luận án: Hoạt tính sinh học của hợp chất từ vi nấm biển phân lập - Gửi miễn p...
Luận án: Hoạt tính sinh học của hợp chất từ vi nấm biển phân lập - Gửi miễn p...Luận án: Hoạt tính sinh học của hợp chất từ vi nấm biển phân lập - Gửi miễn p...
Luận án: Hoạt tính sinh học của hợp chất từ vi nấm biển phân lập - Gửi miễn p...
 
Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...
Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...
Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu hiệu quả của đê ngầm đến quá trình tiêu h...
 
Nghiên cứu tác dụng giảm sóng của rừng cây ngập mặn ven biển
Nghiên cứu tác dụng giảm sóng của rừng cây ngập mặn ven biểnNghiên cứu tác dụng giảm sóng của rừng cây ngập mặn ven biển
Nghiên cứu tác dụng giảm sóng của rừng cây ngập mặn ven biển
 
Đề tài: Thiết kế quy trình công nghệ làm khô khí trên giàn, HOT, 9đ
Đề tài: Thiết kế quy trình công nghệ làm khô khí trên giàn, HOT, 9đĐề tài: Thiết kế quy trình công nghệ làm khô khí trên giàn, HOT, 9đ
Đề tài: Thiết kế quy trình công nghệ làm khô khí trên giàn, HOT, 9đ
 
Luận án: Tổng hợp hydrotalxit mang ức chế ăn mòn, HAY
Luận án: Tổng hợp hydrotalxit mang ức chế ăn mòn, HAYLuận án: Tổng hợp hydrotalxit mang ức chế ăn mòn, HAY
Luận án: Tổng hợp hydrotalxit mang ức chế ăn mòn, HAY
 
Luận án: Bệnh đơn bào do Leucocytozoon spp. gây ra ở gà nuôi
Luận án: Bệnh đơn bào do Leucocytozoon spp. gây ra ở gà nuôiLuận án: Bệnh đơn bào do Leucocytozoon spp. gây ra ở gà nuôi
Luận án: Bệnh đơn bào do Leucocytozoon spp. gây ra ở gà nuôi
 
Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...
Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...
Xây dựng, hoàn thiện và sử dụng các thí nghiệm trong dạy học một số kiến thức...
 
Luận án: Đặc trưng thủy động lực học của dòng nối tiếp, HAY
Luận án: Đặc trưng thủy động lực học của dòng nối tiếp, HAYLuận án: Đặc trưng thủy động lực học của dòng nối tiếp, HAY
Luận án: Đặc trưng thủy động lực học của dòng nối tiếp, HAY
 
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng...
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng...Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng...
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng...
 
Luận án: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana ...
Luận án: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana ...Luận án: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana ...
Luận án: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana ...
 
Luận án: Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng...
Luận án: Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng...Luận án: Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng...
Luận án: Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng...
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620 (20)

Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 Điểm
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 ĐiểmDanh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 Điểm
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 Điểm
 
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý Tưởng
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý TưởngDanh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý Tưởng
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý Tưởng
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên GiỏiDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên Giỏi
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá GiỏiDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá GiỏiDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
 

Recently uploaded

26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
ltbdieu
 
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hànhbài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
dangdinhkien2k4
 
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
ChuThNgnFEFPLHN
 
SLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdf
SLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdfSLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdf
SLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdf
hoangtuansinh1
 
C6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoi
C6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoiC6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoi
C6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoi
dnghia2002
 

Recently uploaded (20)

TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...
TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...
TUYỂN TẬP ĐỀ THI GIỮA KÌ, CUỐI KÌ 2 MÔN VẬT LÍ LỚP 11 THEO HÌNH THỨC THI MỚI ...
 
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
ĐỀ CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT CÁC TỈNH THÀNH NĂM HỌC 2020 –...
 
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng ĐồngGiới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
Giới thiệu Dự án Sản Phụ Khoa - Y Học Cộng Đồng
 
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiTrắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
 
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
Danh sách sinh viên tốt nghiệp Đại học - Cao đẳng Trường Đại học Phú Yên năm ...
 
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
 
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
 
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhhkinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
kinh tế chính trị mác lênin chương hai và hàng hoá và sxxhh
 
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hànhbài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
bài tập lớn môn kiến trúc máy tính và hệ điều hành
 
BỘ LUYỆN NGHE VÀO 10 TIẾNG ANH DẠNG TRẮC NGHIỆM 4 CÂU TRẢ LỜI - CÓ FILE NGHE.pdf
BỘ LUYỆN NGHE VÀO 10 TIẾNG ANH DẠNG TRẮC NGHIỆM 4 CÂU TRẢ LỜI - CÓ FILE NGHE.pdfBỘ LUYỆN NGHE VÀO 10 TIẾNG ANH DẠNG TRẮC NGHIỆM 4 CÂU TRẢ LỜI - CÓ FILE NGHE.pdf
BỘ LUYỆN NGHE VÀO 10 TIẾNG ANH DẠNG TRẮC NGHIỆM 4 CÂU TRẢ LỜI - CÓ FILE NGHE.pdf
 
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
SD-05_Xây dựng website bán váy Lolita Alice - Phùng Thị Thúy Hiền PH 2 7 8 6 ...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
TÀI LIỆU BỒI DƯỠNG HỌC SINH GIỎI KỸ NĂNG VIẾT ĐOẠN VĂN NGHỊ LUẬN XÃ HỘI 200 C...
TÀI LIỆU BỒI DƯỠNG HỌC SINH GIỎI KỸ NĂNG VIẾT ĐOẠN VĂN NGHỊ LUẬN XÃ HỘI 200 C...TÀI LIỆU BỒI DƯỠNG HỌC SINH GIỎI KỸ NĂNG VIẾT ĐOẠN VĂN NGHỊ LUẬN XÃ HỘI 200 C...
TÀI LIỆU BỒI DƯỠNG HỌC SINH GIỎI KỸ NĂNG VIẾT ĐOẠN VĂN NGHỊ LUẬN XÃ HỘI 200 C...
 
SLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdf
SLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdfSLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdf
SLIDE - Tu van, huong dan cong tac tuyen sinh-2024 (đầy đủ chi tiết).pdf
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiệnBài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
Bài giảng môn Truyền thông đa phương tiện
 
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.pptAccess: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
Access: Chuong III Thiet ke truy van Query.ppt
 
Đề thi tin học HK2 lớp 3 Chân Trời Sáng Tạo
Đề thi tin học HK2 lớp 3 Chân Trời Sáng TạoĐề thi tin học HK2 lớp 3 Chân Trời Sáng Tạo
Đề thi tin học HK2 lớp 3 Chân Trời Sáng Tạo
 
C6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoi
C6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoiC6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoi
C6. Van de dan toc va ton giao ....pdf . Chu nghia xa hoi
 
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
1.DOANNGOCPHUONGTHAO-APDUNGSTEMTHIETKEBTHHHGIUPHSHOCHIEUQUA (1).docx
 

Luận án: Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài lá kim - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN HOÀNG SA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS, PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2017
  • 2. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… NGUYỄN HOÀNG SA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS, PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hoá hữu cơ Mã số: 62 44 01 14 Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trịnh Thị Thủy Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Thanh Tâm Hà Nội – 2017
  • 3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Toàn bộ trích dẫn trong luận án đều chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận án Nguyễn Hoàng Sa
  • 4. LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, lãnh đạo Viện Hóa học, bộ phận đào tạo Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khánh Hòa, trưởng Khoa cùng cán bộ của Khoa Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TSKH. Trần Văn Sung đã có những định hướng xây dựng nền móng ban đầu cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Hoàng Sa
  • 5. i MỤC LỤC MỤC LỤC.............................................................................................................................i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .........................................................iv DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG.......................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................viii PHỤ LỤC ............................................................................................................................ix MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................................3 1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu ..........................................................................3 1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis)........................................................................3 1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya)...............................................................................3 1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius)..................................................4 1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus...............................5 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus .............................................5 1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus ................................................................6 1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus .............................................................14 1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus ...................................................................17 1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus......................................................................19 1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Thông ba lá.................................20 1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus................................................................................................................................20 1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau ................................................................21 1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư...............................................22 1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................................24 1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa .................................................................................26 1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác.............................................27 1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Podocarpus. ....................................................................................................................28 1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius).......................................................................................................................39 Chương 2. THỰC NGHIỆM............................................................................................42
  • 6. ii 2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học...........................................................42 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu...........................................................................42 2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật........42 2.4. Phương pháp xác định cấu trúc.............................................................................43 2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học..........................................................43 2.6. Hóa chất và thiết bị ...............................................................................................46 2.7. Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu..................47 2.8. Phân lập chất từ các chiết xuất..............................................................................48 2.8.1. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt.................48 2.8.2. Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt......................49 2.8.3. Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt .......................49 2.8.4. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt..................50 2.8.5. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá...................51 2.8.6. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài............52 2.9. Dữ kiện phổ của các chất tách được .....................................................................60 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................70 3.1. Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis) .................................70 3.1.1. Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol ...................................................................70 3.1.2. Hỗn hợp TT2 .................................................................................................71 3.1.3. Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid ........................................................73 3.1.4. Chất TT4: Lambertianic acid........................................................................75 3.1.5. Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid.................77 3.1.6. Chất TT6: Isopimaric acid.............................................................................78 3.1.7. Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one ................................................79 3.1.8. Chất TF1: Pinocembrin..................................................................................81 3.1.9. Chất TF2: Chrysin .........................................................................................82 3.1.10. Chất TF3: Pinostrobin....................................................................................83 3.1.11. Chất TF4: (+) Catechin..................................................................................84 3.1.12. Chất TF5: Kaempferol...................................................................................85
  • 7. iii 3.1.13. Chất TF7: Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyrano- side...............................................................................................................................86 3.1.14. Chất TP1: Dihydropinosylvin........................................................................89 3.1.15. Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether ...............................................89 3.1.16. Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene .....................................................90 3.1.17. Hỗn hợp TP5..................................................................................................90 3.1.18. Chất TP6: Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside).......................................92 3.1.19. Chất TL1: (+) Lariciresinol ...........................................................................94 3.1.20. Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside ............................................95 3.1.21. Chất TS1: β-Sitosterol....................................................................................97 3.1.22. Chất TS2: Daucosterol...................................................................................98 3.2. Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya).........................................99 3.2.1. Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid......................................99 3.2.2. Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside........................101 3.2.3. Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside..................................................102 3.2.4. Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -β- D-glucopyranoside.....................................................................................................103 3.2.5. Chất TL2: Cedrusin .....................................................................................105 3.3. Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius)................105 3.3.1. Chất TT7: Totarol........................................................................................105 3.3.2. Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid.........................................................106 3.3.3. Chất TT9: Inumakiol D ...............................................................................107 3.3.4. Chất TT10: Macrophyllic acid.....................................................................108 3.4. Hoạt tính sinh học của một số chất sạch.............................................................111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................................................116 DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ......................................................119 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................120
  • 8. iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột thường GFC Gel filtration chromatography Sắc ký lọc Gel TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phương pháp phổ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều 1 H- 1 H DEPT Distortionless Enhancement by Polarisa- tion Transfer Phổ DEPT ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spec- trometry Phổ khối ion hóa phun mù điện tử HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ioniza- tion - Mass Spectrometry Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet m: multiplet brs: broad singlet brd: broad doublet dd: doublet of doublets ddd: doublet of doublet of doublets td: triplet of doublets dt: doublet of triplets HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY Các dòng tế bào 9-KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô họng ở người 26-L5 Murine colon carcinoma Ung thư ruột kết ở chuột A-431 Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người A-549 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người
  • 9. v Bel-7402 Human hepatoma Ung thư gan ở người DU-145 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người HeLa HeLa cell line Tế bào ung thư Hela Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người HT-1080 Human fibrosarcoma bào ung thư biểu mô liên kết di căn ở người KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người L-929 Mouse fibroblast Ung thư biểu mô liên kết sợi ở chuột LNCaP Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người LU Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú ở người NCI-H292 Human lung mucoepidermoid Ung thư biểu mô phổi ở người OCI-AML Acute Myeloid Leukemia cells Tế bào ung thư bạch cầu myeloid cấp tính P-388 Lymphocytic leukemia Ung thư máu lympho (Ung thư bạch cầu) PC-3 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người SK-LU-1 Human Caucasian Lung adenocarcinoma Ung thư phổi ở người SK-N-SH Human neuroblastoma cell line U nguyên bào thần kinh ở người SMMC- 7721 Human hepatocarcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan ở người T-47D Human ductal breast epithelial tumor Ung thư vú ở người U-397 Human leukemic monocyte lymphoma Ung thư máu ở người Các viết tắt khác COX-2 Cyclooxygenase-2 Enzym cyclooxygenase-2 CTPT Công thức phân tử EBV Epstein-Barr Virus Virus Epstein-Barr ED50 Effective Dose Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử
  • 10. vi FIV Feline immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở động vật họ mèo HSV Herpes simplex virus Virus Herpes simplex HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở người IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử LD50 Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% thú thử MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MMTV Mouse mammary tumour virus Chủng virus gây ung thư vú ở chuột OD Optical Density Mật độ quang ROS Reactive oxygen species Những phần tử hoạt động chứa Oxygen mp Melting point Điểm nóng chảy n-BuOH n-Butanol Ac Acetoxyl CDCl3 Chloroform deuteri (d) Bz Benzoyl DCM Dichloromethane OMe Methoxy DMSO Dimethylsulfoxide Ph Phenyl EtOAc Ethyl acetate Et Ethyl EtOH Ethanol Me Methyl MeOH Methanol Glc Glucose CD3OD Methanol deuteri (d4) TMS Tetramethylsilane Xyl Xylose C Carbon bậc 4 Rf Retardation factor (retention factor) dm Dung môi
  • 11. vii DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus.........8 Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus.......................9 Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus...14 Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus................16 Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus.....................18 Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus ..................19 Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus ............................33 Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus neriifolius) ..........................................................................................................................40 Bảng 3.1. Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol ...................................................70 Bảng 3.2. Số liệu gán phổ 1 HNMR và 13 CNMR của TT2a và TT2b ..................................72 Bảng 3.3. Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid.........................................74 Bảng 3.4. Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid.........................................................76 Bảng 3.5. Số liệu phổ của chất TT5 và 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid ............................................................................................................................................78 Bảng 3.6. Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430............................................................81 Bảng 3.7. Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside ............................................................................................................................................87 Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-D- glucopyranoside..................................................................................................................93 Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432.............................................97 Bảng 3.10. Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O ...................................100 Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L- rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside.........................................................................104 Bảng 3.12. So sánh số liệu phổ 13 C-NMR của TT7, TT8 và TT9.....................................108 Bảng 3.13. Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8).....................111 Bảng 3.14. Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2 của một số chất sạch ......................................................................................................................112
  • 12. viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3)......3 Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá...............................4 Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài ...............................4 Hình 2.1. Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất.........................47 Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt........................................................................................................................54 Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt........................................................................................................................55 Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt........................................................................................................................56 Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt........................................................................................................................57 Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá .........................................................................................................................58 Hình 2.7. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài...................................................................................................................59 Hình 3.1. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b ................................73 Hình 3.2. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4 .................................................76 Hình 3.3. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6 ...............................79 Hình 3.4. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6 .................................................94 Hình 3.5. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1 ...............................95 Hình 3.6. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11 .............................................100 Hình 3.7. TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10. ............109 Hình 3.8. Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1........................................................................................113 Hình 3.9. Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1. ...............................114 Hình 3.10. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi được xử lí. (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác nhau .......................................................................................................................115
  • 13. ix PHỤ LỤC Phụ lục 1 Các phổ của hợp chất TT1 PL1 Phụ lục 2 Các phổ của hỗn hợp TT2 PL5 Phụ lục 3 Các phổ của hợp chất TT3 PL13 Phụ lục 4 Các phổ của hợp chất TT4 PL17 Phụ lục 5 Các phổ của hợp chất TT5 PL24 Phụ lục 6 Các phổ của hợp chất TT6 PL28 Phụ lục 7 Các phổ của hợp chất TT12 PL38 Phụ lục 8 Các phổ của hợp chất TF1 PL41 Phụ lục 9 Các phổ của hợp chất TF2 PL45 Phụ lục 10 Các phổ của hợp chất TF3 PL48 Phụ lục 11 Các phổ của hợp chất TF4 PL51 Phụ lục 12 Các phổ của hợp chất TF5 PL53 Phụ lục 13 Các phổ của hợp chất TF7 PL56 Phụ lục 14 Các phổ của hợp chất TP1 PL60 Phụ lục 15 Các phổ của hợp chất TP2 PL64 Phụ lục 16 Các phổ của hợp chất TP3 PL67 Phụ lục 17 Các phổ của hỗn hợp TP5 PL69 Phụ lục 18 Các phổ của hợp chất TP6 PL74 Phụ lục 19 Các phổ của hợp chất TL1 PL80 Phụ lục 20 Các phổ của hợp chất TL3 PL89 Phụ lục 21 Các phổ của hợp chất TS1 PL94 Phụ lục 22 Các phổ của hợp chất TS2 PL97 Phụ lục 23 Các phổ của hợp chất TT11 PL101 Phụ lục 24 Các phổ của hợp chất TF6 PL108 Phụ lục 25 Các phổ của hợp chất TP4 PL113 Phụ lục 26 Các phổ của hợp chất TP7 PL117 Phụ lục 27 Các phổ của hợp chất TL2 PL122 Phụ lục 28 Các phổ của hợp chất TT7 PL126 Phụ lục 29 Các phổ của hợp chất TT8 PL130 Phụ lục 30 Các phổ của hợp chất TT9 PL135 Phụ lục 31 Các phổ của hợp chất TT10 PL147 Phụ lục 32 Các biểu đồ biểu thị kết quả thử hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào OCI-AML của TF3 PL155 Phụ lục 33 Kết quả phân tích protein bằng Western plot của hỗn hợp TT2 với các tế bào OCI-AML PL155
  • 14. 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, đi đôi với sự phát triển nhanh chóng về mọi mặt của xã hội loài người là nhiều vấn đề nghiêm trọng mà cả thế giới đang phải đối mặt. Trong tám mục tiêu thiên niên kỷ mà nhân loại cố gắng đạt được trong thế kỷ 21 (gọi tắt là MDGs từ tiếng Anh: Millennium Development Goals), thì vấn đề có liên quan tới sức khỏe của con người là một trong số mục tiêu được đặt lên hàng đầu. Rõ ràng, biến đổi khí hậu đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu cùng với sự ô nhiễm ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng và vấn đề thực phẩm bẩn đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng tiêu cực đến sức khỏe của con người nói riêng và sự sống của toàn thể sinh vật trên trái đất nói chung. Cụ thể là, gần đây nhân loại luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các loại ung thư, các loại bệnh viêm nhiễm, các loại cúm virus, bệnh do virus Ebola, các biến chứng do nhiễm virus Zika, tim mạch, đái tháo đường, vv... Việc tìm ra phương pháp hiệu quả để điều trị các bệnh này là vấn đề vô cùng khó khăn, nó đặt ra nhiều thách thức lớn cho các nhà khoa học. Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Và như thế, người ta có thể sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới. Việt Nam là nước có khí hậu và địa hình rất đa dạng, gồm có bốn miền khí hậu chủ yếu: khí hậu phía Bắc, phía Nam, Trung và nam Trung bộ, khí hậu Biển Đông. Việt nam với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi. Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên và khí hậu như trên đã tạo ra thảm thực vật có đa dạng sinh học cao. Theo những nghiên cứu mới đây ở Việt Nam có hơn 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm, hơn 2000 loài tảo, 537 loài vi tảo, 667 loài rong biển và 15 loài cỏ biển, trong đó nhiều loài được dùng làm thuốc [1]. Trong thảm thực vật phong phú và đa dạng ấy, các loài cây lá kim là những cây rừng quan trọng cả về sinh thái, kinh tế, thương mại và văn hóa. Ngoài nguồn cung cấp gỗ, tinh dầu thông còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, công
  • 15. 2 nghiệp chất béo, vv...), một số loài Thông còn được dùng là vị thuốc dân tộc. Thông còn là môi trường của nhiều loài nấm nội kí sinh, Taxol® (paclitaxel) là thuốc chống ung thư được cho là tốt nhất hiện nay được phát hiện từ loài thông đỏ ở châu Âu. Cũng như các chi khác trong bộ Thông (Pinales), nhiều loài trong chi Pinus L. (Pinaceae) và chi Podocarpus L'Hér. ex Pers. (Podocarpaceae) từ lâu đã gắn bó với đời sống hằng ngày của người dân và cũng được sử dụng trong y học cổ truyền để trị nhiều loại bệnh khác nhau. Trong khi đó, tính tới thời điểm này (2017) tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của trên một trăm loài Pinus và khoảng tám mươi loài Podocarpus nhưng vẫn còn có nhiều loài trong hai chi này hầu như chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu. Trong đó, loài Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) là một loài gần như đặc hữu của Việt Nam và chưa được nghiên cứu về mặt hóa học; Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) và loài Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên cứu nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài này là rất cần thiết, nhằm góp phần tạo cơ sở để hướng đến nghiên cứu khai thác và sử dụng sau này. Chính vì lý do trên, mục tiêu của các nghiên cứu trong luận án này là: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài lá kim: Thông đà lạt (P. dalatensis), Thông ba lá (P. kesiya) và Thông tre lá dài (P. neriifolius) 2. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch tách ra từ các loài trên để tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng vào cuộc sống.
  • 16. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu 1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré), tên đồng nghĩa: Pinus wallichiana A.B. Jacks. [2] thuộc họ Thông (Pinaceae). Đây là một loài thông năm lá gần đặc hữu của Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở Đà Lạt và một số vùng lân cận, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở Quảng Nam, Quảng Bình và biên giới Việt-Lào. Cây mọc trong rừng rậm, trên núi trung bình, ở độ cao 1500-2000 m. Cây gỗ to, cao đến hơn 30 m và đường kính thân 0.6-0.8 m [2]. Gỗ không bị mối mọt, được sử dụng trong xây dựng, làm đồ gỗ gia dụng và mỹ nghệ. Đến nay, chưa có công bố nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thành phần hóa học và hoa ̣t tính sinh học của loài này. Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3) (Tiêu bản số VNMN.B000005006 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST) 1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) Thôngbalá(Pinus kesiya Royle ex Gordon; tên đồng nghĩa: Pinus langbianensis A. Chev., Pinus insularis var. khasyana (Griff.) Silba, Pinus yunnanensis Franch.)là một loài lá kim thuộc họ Thông (Pinaceae). Trên thế giới, cây phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam và Philippines. Ở Việt Nam, thông ba lá lần đầu được phát hiện ởcao nguyên Langbiang, đó là loài có diện tích lớn nhất trong số các loài thông ở Việt Nam, phân bố ở Hà Giang, Sơn La, Gia Lai, Kon Tum,... nhưng nhiều nhất (90% diện tích) là trên cao
  • 17. 4 nguyên Langbiang. Lá cây hình kim, thường đính ba lá kim trên một đầu cành ngắn, thường có màu xanh ngọc, mỗi lá kim thường dài 20-25 cm. Đầu cành ngắn đính lá thường có độ dài 1.5 cm, đính cách vòng xoắn ốc trên cành lớn [3]. Cây thường được trồng để lấy gỗ phục vụ cho công nghiệp giấy, ngành xây dựng và mỹ nghệ. Đến nay, chỉ mới có vài công bố về thành phần hóa học và hoạt tính của tinh dầu từ loài này. Gần đây (năm 2013 và 2014), có một vài công bố nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của loài này ở Trung Quốc [4, 5]. Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá (Tiêu bản số VNMN.B000005007 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST) 1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius D. Don) Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài (Tiêu bản số VNMN.B0000050013 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST) Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) là một loài thực vật họ Thông tre
  • 18. 5 (Podocarpaceae). Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng nguyên sinh các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, ĐakLak, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang, Nghệ An, Hà Tĩnh, Yên Bái, Tuyên Quang... và mọc ở độ cao 2300 m ở Vườn quốc gia Bì Đúp - Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng. Cây gỗ cao 20–25 m, đường kính có thể tới 50 cm, thân thẳng, tròn. Vỏ xám nâu, mỏng, nhẵn. Cành lá mọc vòng, màu xanh non hoặc xanh vàng. Lá mọc cách, hình mác dài, đầu nhọn dần, dài 7–15 cm, rộng 0.9–1.9 cm, đầu và đuôi nhọn, đầu mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh vàng. Gân chính nổi ở giữa rõ cả 2 mặt, mép lá cong xuống phía dưới. Cuống lá dài 0.3–0.5 cm, phía dưới có rãnh. Nón đực dạng bông không cuống, thường 3 bông mọc chụm ở nách lá gần đầu cành, khi non hình trứng, khi già hình trụ dài 2–5 cm. Nón cái mọc lẻ ở nách lá, chỉ có một lá noãn phát triển mang một noãn, các lá noãn khác hợp thành đế. Nón hình trứng dài 1.2–1.6 cm, đường kính 0.8–12 cm, đế mập to gần bằng nón, có cuống dài 0.5-1 cm. Có 2 lá bắc sớm rụng, dài 1,5 cm, rộng 1 cm. Hạt hình trứng, dài 1,2–1.6 cm, rộng 1.1 cm, dưới có đế mập, đường kính gần bằng đường kính hạt, quả màu tím [6]. 1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus Về thành phần hóa học thì hầu hết các loài lá kim đều có chứa tinh dầu. Bên cạnh đó, theo thống kê trên thế giới đến nay đã có trên 450 hợp chất được phân lập từ trên một trăm loài thuộc chi Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpenoid, phổ biến nhất là diterpene có khung carbon rất đa dạng như: cembrane pimarane, labdane và abietane; triterpene khung seratane và lanostane, lignan, steroid, các phenol, flavonoid và flavonoid glycoside [7]. 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus Hầu hết các loài trong chi Pinus đều có tinh dầu, có rất nhiều nghiên cứu trong vòng 40 năm trở lại đây chỉ ra rằng thành phần chính của có trong dầu thông của nhiều loài thuộc chi Pinus có chứa chủ yếu là các hợp chất terpenoid như: sesquiterpenoid và monoterpe- noid; trong đó thường hay gặp với hàm lượng cao là các chất α-pinene (1) và β-pinene (2), camphene (3), α-myrcene (4), β-myrcene (5) α-terpineol (6), limonene (7) và α-terpinene (8) [8, 9, 10, 11, 12]; các sesquiterpenoid thường thấy nhất là longifolene (9), caryo- phyllene (10) và germacrene D (11) [10, 11]. Ngoài ra, theo một nghiên cứu gần đây vào
  • 19. 6 2014 về thành phần tinh dầu của loài P. nigra, người ta đã nhận thấy sự có mặt lượng lớn các nhóm chất oxygen–diterpene và sesquiterpene [13]. Trong một công bố vào năm 2015 của Zhouqi Li và các cộng sự, ngoài α-pinene (1) còn tìm thấy thêm hàm lượng β- caryophellen (12) tương đối cao trong tinh dầu ở sáu loài thuộc chi Pinus bản địa ở Trung Quốc [14]. 1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus Các triterpenoid được tìm thấy trong chi Pinus chủ yếu có khung seratane và lanostane. Trong một công bố vào năm 1991, từ vỏ loài thông trắng Trung Quốc P. armandii các nhà khoa học đã tách ra được các chất (13-22) có khung seratane [15]. Từ các loài thông trắng miền Tây ở Bắc Mỹ là P. monticola, và loài thông Luchu P. luchuensis đã tách được tám triterpenoid khung seratane (23-30) trong các công bố vào năm 1984, 1975 và 2001 [16, 17, 18]. Ngoài ra, các seratane triterpenoid kể trên cũng được tìm thấy từ các loài P. massoniana, P. taiwanensis, P. monticola và P. strobus [12]. Các lanostane triterpenoid được tìm thấy chủ yếu từ loài P. monticola và P. luchuensis. Cụ thể là, năm 1981, mười chất (31-40) đã được phân lập từ loài P. monticola [19]; năm 2000, có bốn chất mới (41-44) được xác định từ loài P. luchuensis [20]; năm 2010, hợp chất mới pinusyunnanol (45) được phân lập từ loài P. yunnanensis phân bố ở vùng Vân Nam, Trung Quốc [21]. Ngoài ra trước đó, trong một công bố khác, các chất (24S)-3β-methoxy-5α- lanost-9(11)-ene-24,25-diol (31), (32) và (5α,24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46), (3α,5α,24S)-lanost-9(11)-ene-3,24,25-triol (47) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [18]. Có thể nói diterpenoid là nhóm chất chính có trong chi Pinus. Cho đến nay, các diterpenoid chủ yếu được tách ra từ các loài thuộc chi này có thể chia thành ba nhóm với đặc trưng cấu trúc chứa các bộ khung pimarane, abietane và labdane. Các chất 48-58 thuộc nhóm có khung pimarane thường hay gặp ở loài P. massoniana và P. armandii. Cụ thể là sandaracopimaric acid (49), 2β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-oic acid (53), pimaric acid (54), pimara-8(14),15-dien-18-al (55), 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56) và ent-8,13-epoxylabd-14-en-19-oic acid (57) được tách ra từ loài P. massoniana [12, 22, 23]; từ loài P. armandii đã tách được isopimaric acid (48), isodextropimaric acid (51) cùng với 49 và 54 [12, 24]. Các chất isopimarol (50) và pimarol (52) có trong loài P. kesiya còn
  • 20. 7 manoyl oxide acid (58) đã được tìm thấy trong các loài P. sylvestris, P. nigra và P. pumila [12]. Cho đến nay, trong các loài Pinus thì các chất thuộc nhóm abietane (59-118) được tìm thấy với số lượng nhiều nhất so với các diterpenoid còn lại. Từ loài P. massoniana đã tách được hai mươi ba chất abietane diterpenoid đó là levopimaric acid (60), palustric acid (61), neoabietic acid (62), abietic acid (63), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 7α- hydroxydehydroabietan-18-oic acid (68), 7β- hydroxydehydroabietan-18- oic acid (69), abieta-6,8,11,13-tetraene-15,19-diol (70), 2β-hydroxydehydroabietic acid (72), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 7β-hydroxydehydroabiet-15-enoic acid (76), 13β-ethoxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (90), podocarp-8(14)-ene-7,13-dion-18-oic acid (92), 12α-hydroxydehyroabietic acid (98), abieta-7,13,15-trien-18-oic acid (99), 15- hydroxy-12-oxoabietic acid (100), 12β-methoxyabietic acid (103), 13-hydroxypodocarpa- 8,11,13-trien-18-oic acid (113), 12-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (114), 7β- hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (115), 7α-hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)- en-15-oic acid (116) và 13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (117) trong các công bố vào năm 1993 và 2010 [12, 22, 23]. Trong các năm 2010 và 2011, từ loài P. yunnanensis các nhà khoa học đã phân lập được dehydroabietane (64), 66, abieta-6,8,11,13-tetraene-15,18- diol (71), 73, abiesadine N (75), 15-hydroxy-7-oxodehydroabietic acid (79), 15,18- dihydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (80), 4,15-dihydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7- one (81), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), 4-hydroxy-19-norabieta-8,11,13- trien-7-one (83), abieta-8,11,13-triene-7a ,15,18-triol (84), methyl 7α ,15- dihydroxydehydroabietate (85), 7α,15-dihydroxypodocarp-8(14)-en-13-one (86), 12α,13β- dihydroxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (87), daturabietatriene (93), 18-norabieta- 8,11,13-triene-4,15-diol (94), abiesadine I (95), dehydroabietinol (96), 18-norabieta- 8,11,13-trien-4-ol (97), 12α -methoxyabietic acid (102), pinyunin A (104), pinyunin B (105), 113 và 117 [25, 26]. Ngoài ra, các hợp chất abietane diterpenoid cũng đã được tìm thấy từ các loài P. koraiensis, P. pumila, P. densiflora, P. strobus, P. taeda, P. kesiya, P. armandii, P. sylvestris, P. luchuensis, P. sibirica và P. banksiana trong các công bố khoa học từ năm 1970-2010 [12].
  • 21. 8 Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus Khung Cấu trúc cơ bản Khung Cấu trúc cơ bản seratane pimarane lanostane abietane labdane Các hợp chất labdane diterpenoid (119-159) cũng thường có mặt trong thành phần hóa học của nhiều loài Pinus. Năm 1985, từ loài Thông đen P. nigra, Duane và cộng sự đã tách được: chất 120, labda-13(16),14-dien-8-ol (132), pinifolic acid (133), 4- epiimbricataloic acid (134), dimethyl pinifolate (147), methyl 15-methyl-15-oxolabd- 8(17)-en-18-oate (148), 4-Epiimbricataloate (149) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)- en-13-one (150) [27]. Năm 2002, các chất (E)-communic acid (119), (E)-15-norlabda- 8(17),12-diene-13,19-dioic acid (125), (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid (126) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-en-13-one (150) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [28]. Trong các năm 1991 và 2005, từ loài P. armandii các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được tám labdane, đó là (+)-isocupressic acid (140), demethyl pinusolide (145), 16-hydroxy-14-oxo-15-norlabd-8-en-19-oic acid (152), pinusolide (153), 16- hydroxylabda-8(17),13-diene-15,19-dioic acid butenolide (154), lambertianic acid (155), labda-8(17),13-dien-16,14-olid-18-oic acid (156) và 15-hydroxylabda-8(17),13-dien- 16,14-olid-18-oic acid (157) [24, 29]. Năm 2008, từ loài P. densiflora các nhà khoa học
  • 22. 9 Hàn Quốc đã tách ra được hai labdane là 4-epicommunic acid (120)và (E)-15-nor-14- oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) [30]. Năm 2010, từ loài P. massoniana đã tách được elliotinol (121), (E)-19-acetoxylabda-8(14),12,15-triene (122), 13-epimanool (128) và 8,14-dioxo-8,14-secoabiet-13(15)-en-18-oic acid (138) [23]. Trong các năm 2006, 2008 và 2010, từ loài P. sylvestris các nhà khoa học đã tách được chất 133, 134, 15-acetoxylabd- 8(17)-en-18-oic acid (135), 15-ethyl 18-methyl pinifolate (136), 18-acetoxylabd-8(17)-en- 15-oic acid (137), 15-norpinifolic acid (139), (13E)-18-hydroxylabda-8(17),13-dien-15-yl acetate (142), (13E)-18-acetoxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (143), (13E)-3β- hydroxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (144) và monomethyl pinifolate (146) [12, 31, 32]. Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid khung labdane cũng đã được tìm thấy ở các loài P. pumila, P. sibirica, P. koraiensis, P. radiata, P. strobus và P. banksiana [12]. Hợp chất (14S)-14,17-cyclolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (160) là một là một chất tương đối khác lạ với cấu trúc vòng C có bảy cạnh, đã được phân lập từ vỏ của loài P. strobus [33]. Chất isocembrol (161) và 18-norcembra-2,7,11-trien-4-one (162) là các macrocyclic diterpene có trong dầu-nhựa của loài P. koraiensis [12, 34]. Năm 2009, từ phần ethyl acetate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã tách được một diterpenoid glucoside mới là 9α,13α-epoxy-8β,14β-dihydroxy-abietic acid-18-O- β-D-glucopyranoside (163). Đặc biệt đây là lần đầu tiên hợp chất monoterpenoid glucoside được tìm thấy trong chi này đó là bornyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D- glucopyranoside (164) và bornyl 6-O-β-D-apiofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside (165) [35]. Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus
  • 23. 10
  • 24. 11
  • 25. 12
  • 26. 13
  • 27. 14 1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus Flavonoid cũng là một lớp chất tương đối phổ biến có trong các loài họ Thông nói chung và trong chi Pinus nói riêng. Chiếm đa số trong các chất 166-212 đã được tìm thấy từ các loài Pinus thì chủ yếu là dạng cấu trúc flavone, flavonol, flavanone, flavanonol và một số ít chất khác có cấu trúc flavan-3-ol. Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus Khung Cấu trúc cơ bản Khung Cấu trúc cơ bản flavone flavanone flavonol flavanonol flavan-3-ol Vào năm 1987, từ loài Thông trắng P. morrisonicola Đài Loan, Y.S. Cheng và các cộng sự đã phân lập được chrysin (166), tectochrysin (167), apigenin (168), pinocembrin (169), pinostrobin (170), pinobanksin (171), pinobanksin 3-acetate (172), strobochrysin (173), cryptochrysin (174), genkwanin (175), izalpinin (176), galangin (177), poriol (178), 3-acetoxy-5,7-dihydroxy-6-methylflavanone (179) và 3,5,7-Trihydroxy-6-methyl-fla- vanone (180) [36]. Từ loài Thông trắng P. armandii Trung Quốc, đã phân lập được các flavonoid 166-
  • 28. 15 172, catechin (190) và naringenin 4′,7-dimethyl ether (203) trong các công bố vào năm 1988 và 1991 [12, 29, 37]. Năm 1996, các nhà khoa học Thụy Điển đã phân lập được chất 190, catechin 3-β-D- glucopyranoside (191), 3′-O-methylcatechin (192), (2R,3R)-dihydroquercetin (193), (2R,3R)-dihydroquercetin 3′-O-β-D-glucopyranoside (194), (2R,3R)-dihydroquercetin 7- O-β-D-glucopyranoside (195), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranoside (202), proanthocy- anidin B1-B3 (208-210) và epicatechin-(4β→ 8)-epicatechin-(4β→ 8)-catechin từ loài Thông Scotland P. sylvestris [38]. Trong số đó các chất 209-211 là biflavone và duy nhất một triflavone là 212. Ngoài ra, cũng trong năm này các flavonoid là 6-methyltectochrysin (196), 6-methylpinostrobin (198) và 6-methylchrysin (199) cũng đã được phân lập từ loài P. strobus [39]. Từ loài Thông đuôi ngựa P. massoniana, đã phân lập được các chất 3′,5-dihydroxy- 4′-methoxyflavanone 7-O-𝛼-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (183), 3′,5- dihydroxy-4′-methoxyflavanone 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranoside (184), 4′,5-dihydroxyflavanone 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (185), luteolin (186), luteolin 7-O- β-glucopyranoside (187), quercetin (188), taxifolin (189) và pinocembrin (169) vào năm 2008 [40, 41]. Năm 2009 và 2010, từ phần ethyl ace- tate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã phân lập được các flavonoid glycoside đó là 4′,5,7,8-tetrahydroxy-3-methoxy-6-methylflavone 8-O-β-D-glucopyranoside (181), kaempferol 3-O-β-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182), quercetin 3-O-β-D-glucopyra- noside (197), 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol 3-O-β- D-glucopyranoside (201) [35, 42] Khi nghiên cứu về loài thông lá dẹt P. krempfii Việt Nam, H. Erdtman đã phân lập được bốn flavonoid từ thân gỗ đó là: chrysin (166), strobopinin (204), cryptostrobin (205), demethoxymatteucinol (206). Trong đó, các hợp chất C-methyl flavanoid như 205, 206 và 207 là các hợp chất có cấu trúc rất thú vị [43]. Vào năm 2013, nhóm các nhà khoa học Việt Nam khi nghiên cứu về hóa học rễ loài P. krempfii đã phân lập và xác định cấu trúc được sáu flavononoid đó là tectochrysin (167), pinostrobin (170), pinobanksin (171), galangin
  • 29. 16 (177), 205 và 206. Sàng lọc về hoạt tính sinh học bước đầu cho thấy các chất 171, 177, 206 có hoạt tính tương đối tốt với các dòng tế bào KB, Hep-G2, LU, MCF-7 [44]. Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus
  • 30. 17 1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus Các hợp chất lignan cũng thường được tách ra từ các loài Pinus. Trong đó có, hai benzodioxane là massonianoside E (212) được phân lập từ loài P. massoniana [12] và cupressoside A (213) được phân lập từ loài P. densiflora [42]. Mười một benzofuran neolignan (214-224) đã được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana, P. koraiensis và P. densiflora [12, 45]. Ba lignanolide chứa vòng γ-lactone được xem là các dibenzylbutyrolactone (225-227) đã được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana
  • 31. 18 và P. koraiensis [12]. Bảy tetrahydrofuran (228-234) đã được phân lập từ các loài P. massoniana và P. strobus [12, 39]. Tám oligomeric lignan (235-237) và (239-243) đã được phân lập từ các loài P. massoniana, P. yunnanensis, P. koraiensis và P. sylvestris [12]. Một diepoxylignan là pinoresinol (238); ba arylnaphthalene (244-246) và một dibenzocyclooctene là schizandrin (247) được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana, P. koraiensis và P. roxburghii [12]. Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus
  • 32. 19 1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus Có hai mươi bảy dẫn xuất của phenol và anisole (249-285) được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài thuộc chi Pinus như P. massoniana, P. strobus, P. taeda, P. armandii, P. sylvestris, P. densiflora, P. koraiensis và P. kesiya. Ngoài ra còn có một số loại chất khác như coumarin (286), các acid béo (287-291), các steroid (292-293) và (-) shikimic acid (294) [12, 5, 45]. Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus
  • 33. 20 1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Thông ba lá Năm 2013, từ quả của loài Thông ba lá, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được bốn hợp chất lignan đó là cedrusin (214), matairesinol (225), pinoresinol (238) và dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (248), cùng với một flavonoid là 4′,5,7- trihydroxyflavanonol-3′-O-β-D-glucopyranoside (207) và một phenol là 3,4- dihydroxybenzoic acid (271) [4]. Tiếp sau đó. vào năm 2014, cũng từ quả của loài này đã tách thêm được ba diterpenoid là 15-hydroxydehydroabietic acid (73), imbricatolic acid (158), junicedric acid (159) cùng với hai sterol là 292 và 293 [5]. 1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus
  • 34. 21 Diterpenoid là nhóm chất chủ yếu có trong các loài thuộc chi Thông (Pinus), tiếp đến là các hợp chất flavonoid, lignan và phenol cũng tương đối phổ biến. Trong chi này, các thành phần dầu dễ bay hơi và các phần rất phân cực như dịch chiết cồn, dịch nước chứa nhiều polyphenol và polysaccharide thể hiện nhiều hoạt tính mạnh mẽ nhất như chống oxi hóa, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng HIV, vv… nhiều chất sạch đã được sàng lọc hoạt tính và một số đã cho thấy được chúng là những hoạt chất tiềm năng. Những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính có thể mở ra cơ hội sử dụng các thành phần có hoạt tính từ các loài thuộc chi này để làm thuốc trị bệnh trên người, động vật và cả thực vật. Sau đây là một số thống kê đáng chú ý. 1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau Dịch chiết H2O từ lá của loài P. massoniana cho thấy khả năng làm tăng đáng kể ngưỡng chịu đau và giảm số lượng chuột bị cơn đau quằng quại ở mô hình gây phù tai chuột vào năm 1999 [12]. Khi cho chuột thử nghiệm uống hoặc tiêm qua màng bụng thì các nhà khoa học thấy rằng tinh dầu của loài P. pumila có khả năng ức chế hệ thống thần kinh trung ương và liều gây chết 50% đối tượng thử LD50 = 0,577 ± 0,056 mL/kg [12]. Chiết xuất H2O từ lá của loài P. armandii cũng biểu hiện tỉ lệ ức chế 50.8% tại liều lượng thử 100m g/kg ở mô hình gây phù nề cấp tính cho tai chuột bằng dầu [12]. Vào năm 2007, ở phép thử nghiệm in vivo trên mô hình gây quặn đau bằng acetic acid, mô hình gây đau bằng formalin và mô hình gây đau bằng đĩa nóng tại liều lượng thử tại liều lượng thử 100 mg/kg và 200 mg/kg; kết quả là chiết xuất ethanol từ phấn hoa loài P. densiflora đã tạo ra ức chế đáng kể (thể hiện qua thông số tỉ lệ giảm các cơn đau) ở cả ba mô hình trên khi so sánh với chất đối chiếu là aminopyrine. Thêm vào đó, khả năng kháng viêm của chiết xuất ethanol này cũng được thể hiện qua những thử nghiệm ở chuột trên các mô hình gây phù nề chân bằng carrageenan, bằng formalin và gây phù nề tai bằng arachidonic acid so sánh với chất đối chiếu là indomethacin [46]. Năm 2012, khi nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm và giảm đau của các chất có trong loài P. roxburghii, các nhà khoa học Ấn Độ đã thấy rằng chiết xuất ethanol phần lá của loài này thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể phù nề chân chuột trên mô hình gây phù bằng carrageenan, tại liều lượng thử 100 mg/kg, 300 mg/kg và 500 mg/kg trọng lượng chuột
  • 35. 22 được thử nghiệm khi so sánh với tác nhân đối chiếu là indomethacin; hoạt tính kháng viêm của chiết xuất ethanol còn được thể hiện ở khả năng ức chế các u hạt cấy dưới da chuột (mô hình “cotton pellet granuloma”) khi so sánh với tác nhân đối chiếu là diclofenac sodium. Về hoạt tính giảm đau, cao chiết này cũng thể hiện được hiệu quả đáng kể qua hai mô hình thử nghiệm là mô hình gây đau bằng cách tiêm acetic acid (Acetic Acid Induced Writhing Test) và mô hình giảm đau trung ương theo phương pháp nhúng đuôi chuột (Tail Immersion Test) [47]. Cũng trong năm này, Ipek Suntar và cộng sự phát hiện khả năng chống viêm của tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [48]. Các diterpenoid pinyunin A (104), pinyunin B (105) và hợp chất lignan mới là 2- [2,3-dihydroxy-5-(3-hydroxypropyl)phenyl]-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propane- 1,3-diol (237) thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế COX-2 với tỉ lệ ức chế là 84.83, 83.71 và 88.25% tương ứng trong các phép thử nghiệm in vitro [25, 49]. Các flavonol kaempferol 3-O-𝛽-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182) và 6-methyl- tectochrysin (196) có hoạt tính ức chế đáng kể NO với nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50 lần lượt là 26,8 và 27,1 μg/mL, và còn ức chế ở mức độ vừa phải prostaglandin E2 (PGE2) khi IC50 là 56,2 và 24,8 μg/mL tương ứng [12]. 1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư Hoạt tính này được thể hiện nhiều ở phần cao chiết và tinh dầu, một số chất sạch được tách ra cũng thể hiện được khả năng kháng ung thư đáng quan tâm. Từ những năm 1987, các nhà khoa học Nhật Bản đã thấy rằng, chiết xuất nước nóng từ quả của loài P. parviflora (PCE) có tác dụng ức chế các khối u gây bụng báng (u cổ trướng-ascites tumor cells) trên chuột. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các polysaccharide có tính acid trong chiết xuất từ dịch chiết dung dịch NaOH có hoạt tính mạnh nhất [50]. Sau đó, vào năm 1992, Nagasawa và các cộng sự cũng đã công bố rằng, khi các con chuột đang cho con bú được tiêm tĩnh mạch hoặc uống PCE cùng với dehydrogenation polymer của ferulic acid (DHP- FA) thì thấy có tác dụng ngăn chặn đáng kể sự phát triển của chủng virus gây ung thư vú (mouse mammary tumour virus-MMTV) [51]. Năm 2006, các chiết xuất từ vỏ của loài P. maritima đã chứng tỏ khả năng ngăn ngừa
  • 36. 23 ung thư da trên chuột khi được thử nghiệm trên hai mô hình gây ung thư da bằng bức xạ cực tím (UVR) và mô hình UVR kết hợp với 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) [52]; chiết xuất từ vỏ của loài này cũng được chứng minh có nhiều hoạt tính tốt như tiêu diệt các tế bào ung thư, chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, trị tiểu đường,... và đã được đưa ra thị trường với tên thương phẩm là Pycnogenol® . Trong một công bố vào năm 2007, các nhà khoa học Trung Quốc đã chỉ ra rằng, các procyanidin có trong các chiết xuất từ vỏ của loài P. koraiensis thể hiện tác dụng ức chế sự tăng sinh trưởng cũng như sự biểu hiện của kháng nguyên liên quan đến sự tăng sinh tế bào (proliferating cell nuclear antigen-PCNA) và cả yếu tố hoại tử u α (TNF-α) ở ung thư cổ tử cung trên chuột [53]. Năm 2009, các nhà khoa học đã thấy rằng, các chiết xuất từ vỏ của loài P. pinea và P. sylvestris thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ kháng lại các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3, DU- 145, LNCaP) và ung thư tuyến vú (MCF-7) [54]. Vào năm 2010, một nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng, dịch chiết từ vỏ của loài P. massoniana không chỉ có tác dụng kích hoạt các caspase để cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên (apoptosis) ở các tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2) trong thử nghiệm in vitro mà còn ức chế sự tăng trưởng của các khối u được cấy ghép trên cơ thể chuột qua các phép thử in vivo [55]. Sau đó, vào năm 2012, khi nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của tinh dầu từ lá của loài P. densiflora, các nhà khoa học Hàn Quốc đã thấy rằng tinh dầu này cũng có khả năng cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên của các tế bào ung thư miệng ở người (YD-8) qua việc kích hoạt được các caspase và các phần tử hoạt động chứa oxygen (reactive oxygen species-ROS) [56]. Tiếp theo, năm 2013, một công bố khoa học đã cho thấy rằng polysaccharide từ các chiết xuất ethanol của quả khô loài P. koraiensis cho hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2), trong đó hai chiết xuất sử dụng dịch chiết là dung dịch ethanol 30% và 80% có hoạt tính mạnh nhất [57]. Mới đây, năm 2016, W. Natthida và các cộng sự đã thấy rằng chiết xuất ethanol-H2O (50:50) của cành nhỏ loài thông ba lá P. kesiya khi kết hợp với melphalan theo một tỉ lệ thích hợp cho thấy khả năng gây độc tế bào tốt trên hai dòng tế bào ung thư máu (U-937) và ung thư gan (Hep-G2), quan trọng hơn, sự kết hợp này cũng làm giảm độc tính của melphalan xuống khoảng 4-9 lần [58].
  • 37. 24 Một số chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có những hoạt tính khá thú vị. Cụ thể là, 15-ethyl-18-methyl pinifolate (136) có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung thư ở người như Hela, u nguyên bào thần kinh (SK-N-SH) và ung thư gan (Bel-7402) tại các phép thử in vitro [31]. Một nghiên cứu vào năm 2001 về hợp chất triterpenoid là (5α, 24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46) có hoạt tính ức chế nhẹ khả năng xúc tác của enzyme Topoisomerase II với giá trị IC50 là 186 μM [18]. Các chất isopimaric acid (48) và dehydroabietic acid (66) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ các khối u da ở chuột trên mô hình gây ung thư bằng DMBA và TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate) [59]. Các hợp chất 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56), elliotinol (121) và (E)-19-acetoxylabda- 8(14),12,15-triene (122) cho thấy khả năng kháng mạnh mẽ lại các tế bào ung thư biểu mô (A-431) và ung thư phổi (A549) với giá trị IC50 tương ứng là 1.60, 0.38, 4.74 μM (với dòng tế bào A-431) và 16.44, 2.00, 19.62 μM (với dòng tế bào A-549); người ta giải thích rằng 122 thể hiện hoạt tính mạnh mẽ nhất có thể là do ảnh hưởng của khung labdane và nhóm ester -OAc tại vị trí C-19 [23]. Chất 15-norpinifolic acid (139) thể hiện hoạt tính kháng ung thư trên hai dòng tế bào ung thư ác tính ở người-Hela và dòng tế bào ung thư biểu mô liên kết sợi ở chuột (L-929); hoạt tính của chất này có được có thể là do đặc thù cấu trúc khung labdane kết hợp với vị trí C-15 kém phân cực của phân tử này [32]. Gần đây, vào năm 2014, các nhà khoa học đã thấy rằng, α-terpineol (6)-một monoterpenoid có trong tinh dầu nhiều loài Pinus, có thể kháng lại hai dòng tế bào ung thư Hela và ung thư vú (T-47D). Ngoài ra, 6 còn có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) theo cơ chế kích hoạt lại quá trình chết tự nhiên (apoptosis) của dòng tế bào này bằng cách làm suy giảm số lượng gene Bcl-2 (một loại gene ức chế chết tế bào theo chương trình) và tăng số lượng biểu hiện của các gene Bax [60]. 1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Từ những năm 1994, khả năng kháng vi sinh vật của lá các loài Pinus đã được kiểm chứng qua các thử nghiệm; người ta thấy rằng chúng có hiệu quả trong việc chống lại sự phát triển theo quá trình amôn hóa của các vi sinh vật gây thối trong thực phẩm [12]. Trong những năm về sau đã có thêm nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm từ các dịch chiết của ở loài Pinus. Năm 2006, các nhà khoa học đã thấy rằng dịch chiết
  • 38. 25 nước và alcohol từ lá, thân, vỏ và quả khô của loài P. roxburghii có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh đó là Agrobacterium tumefaciens (gây bệnh khối u cho thực vật), Escherichia coli (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella arizonae (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella Typhi (gây bệnh đường ruột trên người) và Staphylococcus aureus (có khả năng gây cách bệnh ngoài da, gây viêm, mủ trên người) [12]. Tinh dầu của các loài P. densiflora và P. thungergii thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với các dòng Klebsiella pneumoniae (gây ra các bội nhiễm ở đường hô hấp), Shigella flexneri (bệnh lỵ trực khuẩn), Proteus vulgaris (có thể gây ra các viêm nhiễm) với nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu (MIC) đều nhỏ hơn 0.4 mg/mL [61]. Năm 2012, các nhà khoa học Mỹ và Canada đã nghiên cứu ra rằng, một peptide giàu hàm lượng cysteine tên là PmAMP1 được phân lập từ loài P. monticola có khả năng kháng lại các chủng nấm gây bệnh trên loài cải dầu (Brassica napus) [62]. Một công bố khoa học vào năm 2013 cho thấy dầu từ nhựa loài thông Scotland P. slyvestris có khả năng kháng lại mười ba chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng với liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 300 µg/mL; và kháng lại sáu chủng nấm gây bệnh trên thực vật liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 200 µg/mL [63]. Trong một nghiên cứu khác, phần tinh dầu và dịch chiết chloroform của loài P. roxburghii có khả năng ức chế các dòng vi khuẩn thử nghiệm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes (khuẩn liên cầu) [64]. Năm 2014, các nhà khoa học Brazil đã tìm thấy khả năng đầy hứa hẹn về việc sử dụng nhựa-dầu của loài P. elliottii làm thuốc chữa bệnh héo rũ trên hoa màu do vi nấm Sclerotium rolfsii gây ra khi giá trị MIC lên loài này là 1.95 μg/mL. Cũng trong nghiên cứu này, nhựa-dầu của loài P. tropicalis thể hiện hoạt tính tốt kháng lại dòng nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh thán thư trên cây trồng) và Fusarium solani (gây bệnh vàng lá, thối rễ) với giá trị MIC tương ứng là 31.25 μg/mL và 62.5 μg/mL, điều này cũng đã mở ra hy vọng cho việc sử dụng nhựa-dầu loài P. tropicalis làm thuốc sinh học điều trị các bệnh trên cây trồng do một số loài vi nấm gây ra [65]. Gần đây, từ hai loài P. brutia và P. pinea ở vùng Địa Trung Hải, người ta nhận thấy tinh dầu của chúng không những có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm mà còn có khả năng diệt trừ sâu bọ rất tốt. Phát hiện này mở đường cho khả năng sử dụng làm tác nhân bảo vệ thực vật sinh học
  • 39. 26 thân thiện với môi trường [9]. Bên cạnh đó, tinh dầu của một số loài P. halepensis Mill., P. densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt [66, 67]. Nhiều chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả. Các chất diterpenoid abieta-8,11,13-trien-7-ol (65), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 18- hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-8,11,13-trien- 4-ol (97), (E)-communic acid (119) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) đều có khả năng ngăn ngừa mụn khi chúng có hoạt tính ức chế lại chủng vi khuẩn Propionibacterium acnes gây ra mụn ở người [12, 30]. Các nhà khoa học tại đại học London cho rằng isopimaric acid (48) tách từ loài P. nigra có tác dụng kháng lại các chủng đa kháng thuốc (EMRSA) ở loài Staphylococcus aureus [68]. Ngoài ra, đã có những nghiên cứu chỉ ra rằng, hoạt tính kháng khuẩn ở các diterpenoid khung pimarane có được là do nhóm – COOH ở vị trí C-19 và hoạt tính này sẽ tăng thêm hơn nữa khi nhóm carboxyl được thay thế bằng các nhóm chứa oxymethylene (–CH2OR) [69]. Một số hợp chất phenolic như pinobanksin (171), 6-methyltectochrysin (196), (E)-pinosylvin monomethyl ether (249) và pinosylvin (252) có thể kháng lại nấm Cladosporium herbarum (gây bệnh thối rễ ở cây trồng). Ngoài ra, chất 249 và dihydropinosylvin monomethyl ether (257) còn có tác dụng ức chế năm chủng loại nấm gây thối rễ khác và còn có khả năng hoạt hóa enzyme lactase [12]. 1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa Có nhiều nghiên cứu bước đầu khẳng định các chiết xuất của nhiều loài Pinus thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt [12]. Sau đó, cũng có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa của các loài từ chi này. Các polyphenolic từ chiết xuất của hạt loài P. koraiensis thể hiện tính chống oxi hóa tốt qua các phép thử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), HO. và O2 . với giá trị nồng độ 50% tác dụng tối đa EC50 lần lượt là 0,023 ± 0,004 mg/mL, 0,391 ± 0.055 mg/mL và 4,37 ± 0.19 mg/mL tương ứng [70]. Năm 2011, Kim Mihyang và các cộng sự, bằng phương pháp gốc tự do DPPH , đã thấy rằng dịch chiết nước nóng của loài P. densiflora thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ với IC50 = 0,27 mg/mL tương đương với vitamin C (IC50 = 0,26 mg/mL). Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch chiết này
  • 40. 27 cũng có tác dụng ngăn chặn mạnh mẽ lên các LOPs (Lipid Oxidation Products – các sản phẩm oxi hóa lipid bằng gốc tự do peroxide hay superoxide gây tổn thương tế bào) trong gan và hồng cầu của chuột [71]. Chiết xuất alcohol của loài P. roxburghii cũng được chứng minh có hoạt tính chống oxi hóa tốt qua các thử nghiệm theo phương pháp TEAC (xác định hoạt tính chống oxi hóa khi so sánh với khả năng chống oxi hóa của Trolox) [72]. Năm 2016, nghiên cứu về chiết xuất methanol của nhựa loài P. nigra đã hứa hẹn rằng chúng sẽ sử dụng như là một chất chống oxi hóa tự nhiên khi nó thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tương đối tốt trên các phép thử nghiệm DPPH, tạo phức chelate với Fe2+ , TEAC, dọn hydrogen peroxide (H2O2) và dọn gốc tự do peroxide (O2 .– ) [73]. Các chất như 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol 3- O-β-D-glucopyranoside (201) có khả năng “quét dọn” các gốc NO3 – rất tốt với các giá trị IC50 tương ứng là 3,86 ± 0,41 μM và 4,02 ± 0,18 μM trong khi giá trị IC50 của chất so sánh L-penicillamine là 3,04 ± 0,74 μM [35]. 1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác Các chất isopimaric acid (48), sandaracopimaric acid (49) neoabietic acid (62), dehydroabietic acid (66) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid (126) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ chủng virus có thể gây ung thư máu, ung thư vòm-mũi họng Epstein-Barr (EBV) [28, 59]. Các thử nghiệm dược lý cũng cho thấy rằng abietic acid (63) có tác dụng chống co thắt [12]. Các phức lignin-carbohydrate (Lignin – carbohydrate complexes: LCC) có trong quả khô và hạt của nhiều loài Pinus như P. parviflora, P. densiflora, P. thunbergii, P. elliottii, P. taeda, P. caribaea, P. sylvestris và P. armadii được cho là có khả năng ức chế sự phát triển của của dòng virus nguy hiểm trên người HSV (Herpes Simplex Virus), đây là loại virus gây mụn mủ, lở loét ở da, niêm mạc phần trên của cơ thể như mắt, mũi, miệng và bộ phận sinh dục [74]. Các hợp chất polysaccharide có tính acid từ loài P. parviflora được cho là có khả năng kháng lại các virus cúm theo cách ức chế, “đầu độc” quá trình tổng hợp protein và enzyme quan trọng trong quá trình tự nhân đôi của DNA (enzyme RNA-dependent RNA polymerase) [75]. Năm 1998, Masatoshi Nakano và các cộng sự đã một nghiên cứu cho thấy rằng chiết xuất kiềm từ vỏ hạt loài P. koraiensis có khả năng ức chế virus gây suy
  • 41. 28 giảm miễn dịch mắc phải ở người (HIV) và ở động vật họ mèo (FIV) qua các phép thử in vivo [76]. Những năm sau đó, cũng có những công bố khoa học cho thấy khả năng kháng HIV của dịch chiết từ quả khô các loài P.nigra, P. parvifloria và P. elliottii. Đặc biệt là vào năm 2012, các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng chiết xuất từ quả khô của loài P. yunnanensis được xem như là nhóm ức chế men phiên mã ngược (reverse transcriptase inhibitors= RTI) trong điều trị HIV bởi vì nó có khả năng ức chế mạnh các chủng virus trong phòng thí nghiệm HIV-1IIIB, HIV-1RF, HIV-1A17, HIV-1AO18 và HIV-2ROD. Tất cả các nghiên cứu về hoạt tính kháng HIV được nêu ở trên đã mở ra hy vọng lớn về việc sử dụng các chiết xuất từ quả khô của các loài Pinus như là một tác nhân để điều trị HIV trong tương lai [77]. Năm 2011, nghiên cứu chiết xuất alcohol của loài P. roxburghii cho thấy hoạt tính chống rối loạn lipid trong máu (antidyslipidemic) khi làm giảm đáng kể triglyceride huyết tương (TG), cholesterol tổng (TC) và glicerol (Gly) trên những chú chuột Hamster được thử nghiệm. Trong một công bố vào năm 2012, chiết xuất dầu từ gỗ của loài này cũng cho thấy hoạt tính bảo vệ gan qua các phép thử in vivo trên chuột bị gây tổn thương gan bằng chloroform và ethanol. Hơn nữa, dịch chiết ethanol từ loài này được đánh giá là có tác dụng trị hen, co thắt phế quản trên các phép thử in vitro và cả in vivo. Tới năm 2015, các nhà khoa học Ấn Độ đã nhận thấy rằng, dịch chiết ethanol cũng như hợp chất flavonoid là quercetin (188) được tách ra từ vỏ của loài P. Roxburghii có khả năng ức chế enzyme α- amylase đã mở ra hi vọng sử dụng chúng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường [78, 79]. Ngoài ra, tinh dầu nhiều loài thông trong chi Pinus còn có tác dụng tiêu diệt ấu trùng của loài muỗi vằn hổ Aedes albopictus – một loài sinh vật trung gian gây nhiều bệnh nguy hiểm, đặc biệt là sốt xuất huyết [11]. Gần đây nhất, vào năm 2016, khi nghiên cứu tinh dầu của loài thông ba lá P. kesiya ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng nó có hoạt tính chống lại các loài ấu trùng muỗi gây các bệnh sốt rét, sốt xuất huyết và giun chỉ bạch huyết [80]. 1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Podocarpus.
  • 42. 29 Chi Thông tre (Podocarpus) là một chi lớn của họ Kim giao (Podocarpaceae), có khoảng 105 loài, phân bố chủ yếu ở bắc bán cầu [81]. Có nhiều loài trong chi này đã được quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Có thể liệt kê ra một số công bố đáng chú ý sau đây. Trong công bố vào năm 1976, từ nhiều loài Podocarpus khác nhau được thu thập từ các đại lục Á, Âu, Phi ; New Zealand và Brazil; Robert B. Bates và các cộng sự đã phân lập và chứng minh được cấu trúc các hợp chất norditerpene dilactone như inumakilactone A (295), nagilactone C (296), podolactone A (297), nagilactone A (298) và sellowin B (299) dựa trên một số biến đổi hóa học và các phương pháp phổ, đặc biệt là X-Ray đơn tinh thể [82]. Năm 1977, quả và vỏ rễ của loài P. nagi, Yuji Hayashi và các cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc của một số norditerpene dilactone đó là 15-hydroxy-nagilactone D (300), 3β-hydroxy-nagilactone A (301), 1β,2β-dihydroxy-nagilactone D (302), 15- methoxycarbonyl-nagilactone D (303), 1-deoxy-2α-hydroxy-nagilactone A (304), 16- hydroxy-podolide (305), 2,3-dihydro-16-hydroxy-podolide (306) và 2β,3β -epoxy- podolide (307) [83, 84, 85]. Năm 1990, từ vỏ rễ loài này, đã tách được ba hợp chất norditerpene dilactone đó là 2,3-dehydro-16-hydroxy-nagilactone F (308), nagilactone I (309) và l6-hydroxy-nagilactone E (310) [86]. Trong năm 1991, khi nghiên cứu thành phần hóa học của lá và vỏ rễ loài P. nagi, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được một số norditerpene dilactone mới đó là 2α-hydroxy-nagilactone F (311), 3-deoxy-2α- hydroxynagilactone E (312), 3-epinagilactone C (313) và nagilactone J (314). Thử nghiệm ban đầu về hoạt tính đã cho thấy chất 311 có khả năng kháng lại chủng nấm Saccharomyces cerecisiae-có thể gây ra một số bệnh về đường ruột trên người và động vật [87, 88, 89]. Sau đó, vào năm 1993, ba norditerpene dilactone mới đã được phân lập từ vỏ rễ của loài này đó là 1-deoxynagilactone A (315), 1-deoxy-2,3-dehydronagilactone A (316) và 2,3- dehydronagilactone A (317) [90]. Năm 1995, đã có ba hợp chất diterpene dilactone glycoside của nagilactone C-E (318-320) được phân lập từ dịch nước vỏ hạt loài P. nagi [91]. Trong một công bố vào năm 1996, H. Haraguchi và các cộng sự đã chỉ ra rằng totarol (321) được tách ra từ loài P. nagi có hoạt tính chống oxi hóa tốt, nó không những ức chế
  • 43. 30 quá trình peroxide hóa lipid mà còn thể hiện khả năng bảo vệ tế bào hồng cầu kháng lại sự huyết tán (hemolysis). Hơn nữa 321 còn được chứng minh có khả năng bảo vệ các hệ thống sinh học bằng cách chống lại quá trình ”stress oxi hóa” trong cơ thể [92]. Năm 1999, đã có hai diterpene dilactone glycoside mới với phần đường là một trisaccharide đã được phân lập từ loài này đó là 1-deoxy-nagilactone A-2α-O-β-D-glucopyranosyl-(1–3)-β-D- glucopyranosyl-(1–6) -β-D-glucopyranoside (322) và 1-deoxy-nagilactone A-2α-O-β-D- glucopyranosyl-(1–6)-β-D-glucopyranosyl-(1–3)-β-D-glucopyranoside (323) cùng với năm chất diterpene dilactone glycoside đã biết gồm (318-320) và (324-325) [93]. Thú vị là vào năm 2012, hai hợp chất cyclopeptide đó là nagitide A (326) và nagitide B (327) đã được phân lập từ chiết xuất CH2Cl2 và EtOAc của vỏ rễ loài P. nagi bởi Yang Ye và các cộng sự [94]. Gần đây nhất, năm 2017, từ chiết xuất EtOAc của lá loài P. nagi, Yegao Chen cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc được bốn chất là nagiol A (328), sugiol (329), 2,3-dihydroxyferruginol (330) và 298, trong đó 328 là một abietane mono- norditerpenoid mới [95]. Năm 1979, từ vỏ thân loài P. milanjianus và P. sellowii các nhà khoa học Mỹ và Brazil đã phân lập được nagilactone F (331) và nagilactone G (332). Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy chất 332 có khả năng kháng lại tế bào ung thư biểu mô họng người (9-KB) với ED50 = 10-2 µg/mL [96]. Một năm sau đó, từ loài P. milanjianus nhóm nghiên cứu này cũng đã tách và xác định thêm được hai chất có hoạt tính kháng lại tế bào 9-KB là milanjilactone A (333) và milanjilactone B (334) với giá trị ED50 tương ứng là 4 µg/mL và 10-1 µg/mL [97]. Tới năm 1984, podolactone C (335) cũng đã được phân lập và chứng minh lại cấu trúc đúng hơn của nó với cấu trúc 2,3-β-epoxide cùng với đặc trưng lập thể tại vị trí C-4, C-6 và C-15. Bước đầu sàng lọc hoạt tính cho thấy 335 có mức độ kháng trung bình đối với tế bào ung thư bạch cầu P-388 [98]. Trong một công bố năm 2005, từ vỏ rễ loài đã tách và xác định được chín hợp chất đó là β-sitosterol (292), daucosterol (293), 321, 331, 332, 335, nagilactone D (336), 19-hydroxytotarol (337) và stigmasterol (338) [99]. Năm 1999, Roy Stahlhut và các cộng sự khi sàng lọc về hoạt tính sinh học của loài P. gracilior đã nhận thấy rằng có sự tồn tại một lượng nhỏ hoạt chất kháng ung thư rất tốt là taxol (339) trong cuống lá và lá của loài này. Đây cũng là lần đầu tiên taxol được chứng
  • 44. 31 minh là có ở một loài thực vật không thuộc họ Thông đỏ (Taxaceae) [100]. Trong một công bố vào năm 2012, từ lá của loài này, Alessandra Braca và các cộng sự đã phân lập được ba terpenoid mới đó là 2α,16-dihydroxy-4β-carboxy-O-β-D-glucopyranosyl-19-nor-totarol (340), nagilactone K (341) và 15-hydroxy phaseic acid (342) [101]. Năm 2003 từ loài Tùng La hán lá dài P. macrophyllus đã phân lập được hai hợp chất có cấu trúc lập thể đối nhau tại vị trí chứa nguyên tử lưu huỳnh đó là SR-podolactone D (343) và SS-podolactone D (344), trong đó 343 là một chất mới [102]. Năm 2004, từ lá loài này, nhóm tác giả trên đã phân lập được mười chất, trong đó có 335, 343, 344, hallactone B (345) cùng với sáu norditerpene dilactone mới có chứa lưu huỳnh là các rakanmakilactone A–F (346-351), đặc biệt hợp chất rakanmakilactone E (350) có chứa nguyên tử chlorine trong phân tử. Qua các thử nghiệm in vitro cho thấy các chất 335, 343, 344 và các rakanmakilactone A–F (346-351) đều có hoạt tính kháng lại tế bào ung thư bạch cầu P-388 với các gí trị IC50 tương ứng là 0,16, 0,52, 0,23, 0,31, 0,18, 0,29, 0,25, 5,0, và 4,3 µg/mL [103]. Năm 2007, cũng từ loài này, Mei-Hsien Lee và các cộng sự đã phân lập được một biflavonoid mới là 2,3-dihydro-4′,4′′′-di-O-methylamentoflavone (352), và năm hợp chất đã được biết đến là quercetin (188), 2,3-dihydrosciadopitysin (353), (-)-catechin (354), sciadopitysin (355), và isoginkgetin (356). Các hợp chất này được thử nghiệm khả năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase chống lại quá trình tổng hợp ra chất tạo ra melanin trong biểu bì hắc tố con người (HEMn). Kết quả cho thấy 352 có thể ức chế tyrosinase mạnh với IC50 = 0,098 mM [104]. Trong một công bố vào năm 2014, từ cành lá và lá loài P. macrophyllus, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được một chất mới là podocarflavone A (357) cùng với mười lăm flavonoid đã biết đó là apigenin (168), luteolin (186), luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside (187), 188, quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside (197), 356, amentoflavone (358), hinokiflavone (359), apigenin-7-O-(-D- glucopyranoside) (360), tricin (361), salvigenin (362), ladanein (363), norartocarpesin (364), avicularin (365) và pedalitin-3′-O-glucoside (366). Các phép thử in vitro cho thấy các flavonoid 188, 197, 356 và 358 có hoạt tính chống oxi hóa tốt. Ngoài ra, các chất 186- 188, 197 và 358 có tác dụng bảo vệ tim mạch theo cách làm suy giảm nồng H2O2 nội sinh- nguyên nhân gây chết tự nhiên của tế bào cơ tim (H9c2) trong ống nghiệm [105]. Mới đây,
  • 45. 32 năm 2016, từ vỏ của loài này, Ye-Gao Chen và cộng sự đã phân lập được mười lăm chất sạch đó là 73, ferulic acid (264), 15-methoxydehydroabietic acid (367), 7α- hydroxydehydroabietic acid (368), methyl trans-ferulate (369), methyl 22-O- feruloyloxydocosanoate (370), vanillic acid (371), 2,6-dihydroxy-3,4-dimethylbenzoic acid methyl ester (372), các lignan (373-375), một flavonoid là sideroxylin (376) và ba steroid 292, 7-ketositosterol (377), 3β,5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-diene (378) [106]. Năm 2011, từ chiết xuất CH2Cl2-MeOH của vỏ rễ loài P. latifolius, John A. Beutler và các cộng sự đã phân lập được sáu chất, trong đó có ba diterpenoid mới là cycloinumakiol (379), inumakal (380), inumakoic acid (381) cùng với ba chất đã biết là 331, inumakilactone B (382)và inumakilactone (383). Qua phép thử AP-1 cho thấy hợp chất 331 và 383 có hoạt tính ức chế AP-1 (một protein hoạt hóa, được kích hoạt bởi 12-otetradecanoyl phorbol-13- acetate (TPA)) với IC50 tương ứng là 1,5 và 4 µM, kết quả này cho thấy hai chất trên rất có tiềm năng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh ung thư [107]. Năm 2012, từ lá của loài P. elongatus, Alessandra Braca và các cộng sự đã phân lập được tám hợp chất glycoside mới bao gồm nagilactone C 7-O-α-L-arabinopyranosyl- (1→4)-β-D-xylopyranoside (384), nagilactone C 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D- xylopyranoside (385), nagilactone C 7-O-β-D-xylopyranoside (386), nagilactone A 7-O-α- L-arabinopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranoside (387), 2β,15S,16,17,19-pentahydroxy-iso pimar-8(14)-ene 17-O-β-D-glucopyranoside (388), 2β,15R,16,17,19-pentahydroxy-iso pimar-8(14)-ene 17-O-β-D-glucopyranoside (389), một dẫn xuất ionol là 1-(2,6,6- trimethyl-4-hydroxycyclohexenyl)-1-hydroxy-buta-1-en-3-one 4-O-β-D-glucopyranoside (390) và một flavone C-glycoside đó là vitexin 2′′-O-β-D-(6′′′-acetyl)-glucopyranoside (391) [108]. Năm 2013, từ loài P. fleuryi các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được tổng cộng mười bảy chất trong đó có tám abietane diterpenoid đó là 337, các fleuryinol A–C (392-394), 19-hydroxyferruginol (395), lambertic acid (396), inumakiol D (397) và totaradiol (398), các chất 392-394 là những chất mới. Bước đầu sàng lọc hoạt tính cho thấy 393 và 395 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan (SMMC-7721) và ung thư phổi (A-549); riêng chất mới 393 còn
  • 46. 33 thể hiện mức độ ức chế trung bình đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu (HL-60) và ung thư vú (MCF-7) [109]. Trong năm nay, 2017, cũng từ loài này đã phân lập được một sterol mới có cấu trúc hiếm gặp với dạng bốn vòng ngưng tụ kiểu [6/5/6/5] đó là 3β,5β,6- trihydroxyl-B-norsitostane (399) cùng với mười hợp chất đã biết là 381, 396, sitostenone (400), β-sitosterol linoleate (401), 4β-hydroxyl-4(20→5),10(18→9)- abeopimar-15(16)- ene (402), secoisolariciresinol-9,9′-acetonide (403), 3,4-dimethoxy-benzyl alcohol (404), p-hydroxybenzyl alcohol (405), chrysophanol (406) và (−)-epicatechin (407) [110]. Năm 2014, từ loài P. imbricatus, Xiao-Ning Wang và các cộng sự phân lập được bảy chất trong đó có năm chất đã biết là abieta-8,11,13-triene-3β,6β,12-triol (408), margoclin (409), agathic acid (410), 6β-hydroxyisocupressic acid (411) và sanjoinenine (412) cùng với hai chất mới là podoimbricatin A (413) và podoimbricatin B (414). Chất 412 là một cyclic peptide, chất 413 là một diterpenoid có cấu trúc hiếm gặp với dạng bốn vòng ngưng tụ kiểu [6/6/5/6] còn 414 là một abietane mới. Qua các phép thử in vitro cho thấy 411, 413 và 414 có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung thư phổi (A-549) và ung thư biểu mô phổi (NCI-H292) [111]. Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus
  • 47. 34
  • 48. 35
  • 49. 36
  • 50. 37
  • 51. 38
  • 52. 39 1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) Trong khoảng thập niên 70 của thế kỉ 20, loài thông tre lá dài đã được nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Điển hình như, trong công bố vào năm 1971, nhóm các nhà khoa học người Australia đã phân lập được podolactone C (335) và podolactone D (344) [112]. Tuy nhiên, công bố này đã đề xuất cấu trúc cho 335 là chưa thật chính xác, sau đó, 335 đã được chứng minh lại cấu trúc đúng của nó bởi John M. Cassady và các cộng sự dựa trên phương pháp X-Ray đơn tinh thể [98]. Năm 1974, các chất dạng biflavone như isoginkgetin (356), amentoflavone (358), podocarpusflavone A (415) và podocarpusflavone B (416) đã được phân lập từ lá của loài này [113]. Cũng trong năm 1974, ở một công bố khác, từ bộ phận lá, nhóm tác giả trên đã phân lập được các chất 7,4′-dimethylaromadendrin (417) và 7,4′-dimethylaromadendrin 5-glucoside (418) [114]. Gần đây cũng đã có một vài công bố đáng chú ý, đó là vào năm 2001, nagilactone C (296) được tách ra từ loài này có hoạt tính chống tăng sinh đối với các dòng tế bào ung thư biểu mô liên kết di căn ở người (HT-1080) và ung thư ruột kết ở chuột (26-L5) với giá trị ED50 tương ứng là 2.3 và 1.2 µg/mL [115]. Năm 2017, từ phần chiết xuất tan trong EtOAc của lá loài P. neriifolius, Yegao Chen và các cộng sự đã phân lập được hai chất mới là neriitide A (419), neriilignan (420) cùng với sáu chất đã biết gồm ba sesquiterpenoid spatulenol (421), 10α-epoxyaromadendrane (422), blumenol C (423); hai diterpenoid isopimaric acid (48), Δ8,9 isopimaric acid (424); một sterol là 5α,6β-dihydroxysitosterol (425) [116].
  • 53. 40 Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus neriifolius) ❖ Nhận xét chung - Các nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Pinus và chi Podocarpus chủ yếu tập trung vào các loài phân bố phổ biến ở châu Á và nhiều nhất là ở Trung Quốc. Ở Việt Nam có khoảng 09 loài Pinus và 03 loài Podo- carpus; phân bố nhiều ở Tây nguyên, tuy nhiên những công bố mới chỉ tập trung về thực vật học, còn về thành phần hóa học và hoạt tính mới chưa nhiều và chưa có hệ thống - Thành phần hóa học của các loài trong hai chi này tương đối đa dạng, và nổi trội là các hợp chất diterpenoid với nhiều khung cấu trúc khác nhau. - Từ cơ sở trên, luận án tập trung nghiên cứu 03 loài sau:
  • 54. 41 Thông đà lạt (Pinus dalatensis): trên thế giới, chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Bộ phận được chọn để nghiên cứu là gỗ (chứa nhựa Thông) và lá (tùng diệp) vì chúng đã được sử dụng như là một vị thuốc trong y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh khác nhau. Thông ba lá (Pinus kesiya): chỉ có những nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học tại Trung Quốc. Ở Việt Nam, loài này hầu như chưa được nghiên cứu về hóa học. Bộ phận được chọn để nghiên cứu là rễ (tùng tiết) vì nó được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa lo âu, mất ngủ; giúp an thần, trừ thấp. Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius): bộ phận lá đã được nghiên cứu nhiều ở nước ngoài. Loài này có thành phần hóa học phong phú, có nhiều cấu trúc mới, là những chất ít gặp trong thiên nhiên và có hoạt tính sinh học thú vị và cũng chưa được nghiên cứu kỹ về mặt hóa học. Loài này phân bố ở Việt Nam tương đối ít nên để không làm ảnh hưởng nhiều tới sự sinh trưởng và phát triển của quần thể, tác giả đã thu lấy mẫu gỗ (cành) để nghiên cứu thành phần hóa học.
  • 55. 42 Chương 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học Thân gỗ và lá Thông đà lạt (Pinus dalatensis) cùng với thân gỗ loài Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) thu tại Lâm Đồng, vào tháng 1/2013. Rễ Thông ba lá Pinus kesiya được thu tại DakLak vào tháng 8/2015. Tất cả các mẫu trên đều được TS. Nguyễn Tiến Hiệp định danh và có tiêu bản tương ứng là VNMN.B000005006, VNMN.B0000050013 và VNMN.B000005007 được giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu Các mẫu thực vật sau khi thu hái được cắt nhỏ, phơi khô dưới nắng sau đó sấy ở nhiệt độ 40-45 0 C rồi đem nghiền nhỏ. Tất cả các mẫu thực vật được chiết theo quy trình chung như sau: đem chiết các mẫu đã được xay nhỏ ba lần với hỗn hợp dung môi MeOH-H2O ở nhiệt độ phòng. Lọc các dịch chiết, cô đặc dưới áp suất giảm thu được chiết xuất MeOH-H2O. Chiết xuất này được hòa vào nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, EtOAc và n-butanol. Quay cất dung môi dưới áp suất thấp thu được các chiết xuất tương ứng. 2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký lọc Gel. Sắc ký lớp mỏng (TLC) được dùng để khảo sát sơ bộ thành phần các chất trong chiết xuất, trong các phân đoạn chạy cột và kiểm tra chất sạch. Sự triển khai sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck). Dung môi triển khai là hỗn hợp các dung môi thông dụng trong phòng thí nghiệm như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH, EtOH và H2O. Sắc ký cột thường pha thuận với chất hấp phụ là silica gel 60, cỡ hạt 0.040-0.063 mm (230-400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane:CH2Cl2, n-hexane:EtOAc, n-hexane:acetone, CH2Cl2:EtOAc, CH2Cl2:acetone,
  • 56. 43 CH2Cl2:MeOH, CH2Cl2:MeOH:H2O, vv… với các tỉ lệ thích hợp. Sắc ký cột thường pha đảo với chất hấp phụ là RP-18, hệ dung môi dùng để rửa giải là MeOH:H2O, acetone:H2O, acetonitrile:H2O, vv... với tỉ lệ thích hợp Sắc ký lọc Gel (GFC) dùng Sephadex LH20 làm pha tĩnh với dung môi chạy cột là MeOH hoặc CH2Cl2:MeOH với tỉ lệ CH2Cl2<10%. 2.4. Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp và phân tích những số liệu thu được từ các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1 H-1 H-COSY, NOESY). 2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học ▪ Thực hiện ở Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các tế bào ung thư KB ở người được cung cấp bởi ATCC Các tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370 C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn (phương pháp Monks). Cách thử độc tế bào như sau: Cho 200 μL dung dịch tế bào ở nồng độ 3,104 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào