Ekstraksi DNA dan kuantifikasi merupakan tahap penting dalam analisis DNA forensik. Ada beberapa metode ekstraksi DNA seperti chelex 100, silika, dan fenol kloroform. Setiap metode memiliki kelebihan dan kekurangan tergantung jenis sampel. Kuantifikasi DNA dilakukan untuk mengukur jumlah dan kualitas DNA sehingga hasil PCR optimal. Kuantifikasi dapat dilakukan menggunakan visualisasi gel agarosa atau spektroskopi UV.

1. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
IV. Ekstraksi DNA dan Kuantifikasi
“Wajar sih dalam belajar ada bagianyang dipahami dan ada bagian yang belum
bisa dipahami. Segalanya memangbutuh proses. Atau kadang merasa untuk apa
menambah ilmu yang terlihat tidak berguna. Banyak alasan untuk menjawabnya,
bisa saja sekedar kesenangan atau karena suka. Lanjutkan apa saja yang kita sukai,
jika tidak bisa bermanfaat setidaknya jangan jadi orang yang merepotkan ”
Ekstraksi DNA memiliki dua tujuan utama. Pertama, efisiensi mengekstrak
cukup DNA untuk mengetahui profil DNA sehingga sangat penting tiap sampel DNA
yang digunakan. Kedua, mengekstrak DNA yang cukup murni yang sangat
bergantung dari sifat sampel. Setelah ekstraksi DNA pengukuran DNA secara akurat
diperlukan dalam tahap selanjutnya.
Ekstraksi DNA
Banyak metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA. Pemilihan metode
bergantung pada banyak factor seperti jenis dan kuantitas sampel, waktu, dan
kemampuan optimasi prosedur ekstraksi. Tingkat keberhasilan ditentukan saat
mengekstraksi DNA dan dalam waktu yang sama mengatasi factor penghambat PCR.
Sebagia laboratorium menghindari penggunaan bahan kimia berbahaya juga harga
prosedur yang semurah mungkin. Tentunya juga factor manusia, sebagai teknisi
harus memiliki pengalaman dan kemampuan yang cukup.
Prinsip Umum Ekstraksi DNA
Tahap umum ekstraksi dapat dibagi menjadi tiga tahap. Pertama, merusak
membrane sel sehingga sel menjadi lysis atau pecah. Kedua, denaturasi protein.
Ketiga, pemisahan DNAdari protein terdenaturasi dan komponen sel lainnya.
Chalex 100 resin
Chalex 100 merupakan metode pertama dalam ekstraksi DNAyang diadopsi dari
komunitas forensic.Chelex 100 merupakan resin yang mengandung stirena-
divinilbenzen.

2. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
Dari gambar diatas menunjukkan langkah kerja chelex 100. Ekstraksi dapat
dilakukan cepat dan mudah. Pertama, materi sel dimasukkan dalam wadah dan
ditambah 1 ml TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris:pH 8.0) kemudian diinkubasi pada suhu
kamar selama 10-15 menit. Kedua, tabung disentrifugasi hingga dihasilkan pellet,
sementara supernatant dapat dipisahkan. Ketiga, pellet disuspensi kembali pada
tabung dengan menambahkan 5% larutan chelexdan diinkubasi pada suhu 56 oC
selama 15 hingga 30 menit, kemudian dipanaskan dengan penangas air selama 8
menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan tinggi selama 2-3 menit
untuk mendapatkan pellet protein. Terakhir supernatant yang dihasilkan
dilanjutkan dengan proses PCR.
Keuntungan menggunakan metode tersebut hanya membutuhkan waktu 1 jam
dengan langkah sederhana. Tidak melibatkan pergerakan cairan dalam tabung
sehingga mengurangi kemungkinan tercampurnya sampel, bahan kimia yang
digunakan tidak berbahaya. Hasilnya dapat diterima untuk berbagai sampel forensic
walaupun ekstrak DNA yang dihasilkan relative kasar tetapi cukup untuk
menghasilkan profil DNA yang diinginkan.
Ekstraksi DNA berbasis silica
Pada umumnya dalam biologi molecular sudah umum metude penggaraman.
Langkah pertama adalah inkubasi dan pemecahan bahan seluler dalam larutan
buffer yang mengandung bahan detergent dengan proteinase K. bahan detergent
yang digunakan biasanya SDS ( sodium dedocyl sulfate), tween 20, triton X-100 dan
nonidet P-40. Buffer lisis bertujuan mendestabilkan membrane sel sehingga terjadi
kerusakan struktur sel. Penambahan garam chaotropic seperti 6-M guanidine
thiocyanate atau 6-M natrium klorida selama atau setelah sel pecah bertujuan
mengganggu struktur protein pada ikatan hydrogen, ikatan van der waals, dan
ikatan hidrofob. Protein seluler dengan adanya chaotropic tidak akan larut sehingga
dapat dipisahkan dengan filtrasi ataupun sentrifugasi. Kelarutan protein berkurang
diakibatkan kelebihan ion garam sehingga secara efektif menghidrasi protein.
Umumnya telah tersedia peralatan komersial seperti Qiagen kit yang
menggunakan prosedur ini. Metode yang dilakukan setelah proses penggaraman bisa
bervariasididasarkan sifat pengikatan silica atau partikel kaca. DNA akan berikatan
dengan silica dengan afinitas tinggi akibat garam chaotropic. Setelah komponen lain
dipisahkan DNA dapat dilepas dengan merendam dalam air. Tanpa hadirnya garam
chaotropik DNA akan mudah dilepaskan. Keuntungan metode ini yaitu dihasilkan
DNA yang lebih baik dibandingkan metode chelex 100 walaupun prosesnya lebih
lama, bahan yang digunakan sangat aman dan tidak beracun, tetapi ada
kemungkinan pencampuran atau kontaminasi silang dengan proses yang
memerlukan lebih dari satu penggantian tabung.

3. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
Ekstraksi DNA Berbasis Fenol Cloroform
Ekstraksi dengan metode ini sangat banyak digunakan tetapi pada
pertengahan 90’an mulai ditinggalkan karena sifat fenol yang beracun.
Penggunaannya dalam bidang forensic masih dapat ditemui terutama dalam analisa
sampel tulang dan tanah. Langkah kerjanya hamper sama dengan metode
sebelumnya. Fenol chloroform ditambahkan pada sel lisis untuk mendenaturasi
protein. Larutan kemudian disentrifugasi dan protein yang mengendap akan
membentuk pelikel diantara fase fenol chloroform dan fase air, langkah ini diulang 2-
3 kali sampai tidak ada pelikel yang terlihat. Kemudian DNA dimurnikan dengan
presipitasi etanol atau sentrifugasi filter. Metode ini menghasilkan DNA yang bersih
tetapi perlu diingat kekurangannya yaitu fenol yang beracun, prosedur yang tidak
sederhana dengan kemungkinan terjadinya kontaminasi yang cukuo besar.
Kertas FTA
Sudah dijelaskan pada materi sebelumnya bahwa FTA paper digunakan dalam
pengumpulan dan penyimpanan sampel berupa buccal sel atau sampel darah. Sampel
dapat stabil dalam temperature ruang untuk beberapa lama. Sel akan pecah karena
adanya kontak dengan FTA paper dan menempel pada kertas. Untuk mengestraknya
yaitu dengan mengambil kertas yang menempel sampel kemudian taruh di tabung
dan bersihkan komponen non DNA sehingga hanya menyisakan materi DNA yang
menmpel pada kertas. Kertas yang telah dicuci dan tersisa materi DNA dapat
langsung diuji PCR sehingga metode ini lebih mudah, tidak perlu banyak langkah
dan penggantian tabung sehingga menghindari terjadinya kontaminan.
Tantangan Ekstraksi DNA dari Beberapa Sampel
Beberapa sampel seperti darah dan sel epitel dapat dilakukan ekstraksi DNA
dengan cara diatas, tetapi beberapa sampel perlu penanganan khusus untuk
melakukan ekstraksi.
Semen : cairan seperma yang didalamnya mengandung sperma merupakan sampel
yang sering ditemui dalam analisa forensic. Ekstraksinya dipersulit dengan struktur
sperma yang dilindungi akrosom pelindung seperti yang terlihat dalam gambar.
DNA pada sperma terletak di bagian kepala dan kandungan akrosom dengan asam
amino sistein berjembatan disulfide yang terbentu antara sistein dan akrosom
sehingga proteinase K kesulitan memutus ikatan disulfide yang mengurangi efisiensi

4. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
dalam ekstraksi. Perlu ditambahkan dithiothreithol (DTT) untuk mereduksi ikatan
disulfide. Masalah ain dalam sperma juga sering ditemukan sel epitel, sehingga
akrosom cukup menguntungkan karena bisa dilakukan lisis deferensial sehingga sel
epitel dapat dipecah dan spermatozoa dapat dipisahkan secara efektif dari epitel lisis.
Rambut = batang rambut yang lengkap dengan akarnya kaya akan bahan seluler
DNA yang dapat langsung diekstraksi dengan metode yang telah dibahas. Umumnya
memang bagian akar dengan kandungan DNA sebesar 0,5 mikrogram. Rambut
rontok yang berada pada fase telogen istirahat seringkali tidak mengandung materi
genetic di sekitaran akar. Kandungan rambut adalah keratin, jejakl logam, udara,
dan pigmen fragmen sel, DNA biasanya terjebak dalam matriks rambut dan
menyediakan cukup sumber sampel DNA. Namun, dalam banyak hal sangat sulit
untuk menganalisa rambut dan hanya mungkin berhasil untuk profil DNA
mitokondria.
Batang rambut mengandung akromosom sama halmnya pada sampel sperma yang
tersusun oleh jembatan disulfide sehingga dibutuhkan penggilingan mekanis dan
penambahan zat pereduksi dithiotheriol yang memutus ikatan disulfide sehingga
proteinase K dapat bereaksi dengan sempurna. Setelah DNA diekstrak dapat
dilanjutkan dengan metode penggaraman ataupun fenol chloroform. Karena batang
rambut memiliki sedikit bahan DNA maka banyak sekali kontaminan dalam proses
ekstraksinya tetapi masih bisa diatasi dengan proses pencucian sebelum memulai
proses ekstraksi. Proses pencucuian bisa dengan detergent encer, air, atau etanol dan
dengan menggunakan lisis ringan seperti proses ekstraksi deferensial cairan semen.
Jaringan Keras = Untuk penyelidikan pada sampel yang telah terfragmentasi seperti
pada kasus terorisme, pembunuhan, jaringan otot menyediakan sumber DNA selama
jangka kematian tidak terlalu lama. Namun, ketika sampel sudah terdekomposisi
sehingga kualitas DNA menurun akibat kerja enzim dan kontaminasi bakteri, sel
ostiosit tulang, odontoblas dalam dentin gigi dan fibroblast dapat digunakan sebagai
sampel. Jaringan keras tubuh seperti tulang dan gigi memberi perlindungan DNA
lebih tinggi dari kerusakan. Selain hambatan fisik karena adanya
hidroksiapatit/apati mineral penyusun jaringan keras yang menstabilkan DNA
karena terikat erat dalam struktur mineralnya serta membatasi kerja enzim
pendegradasi.

5. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
Jaringan keras memiliki keunggulan dari sampel sel lain karena permukaannya
dapat dibersihkan dari kontaminan dengan menggunakan detergent yang
dilanjutkan dengan abrasi fisik dengan natrium hipoklorit serta paparan ultraviolet.
Setelah dibersihkan jaringan keras ini biasanya digiling menjadi serbuk dengan
penambahan nitrogen cair. Selanjutnya bahan didekalsifikasi menggunakan 0,5 M
EDTA baik sebelum atau saat proses lisis lisis. Ekstraksi DNA dapat menggunakan
metode silica atau fenol-kloroform dan proses ekstraksi jaringan keras ini biasanya
memerlukan waktu lebih lama dibandingkan sampel jenis lainnya.
Quantifikasi DNA
Kuantifikasi dilakukan setelah proses ekstraksi untuk mengukur jumlah DNA
juga kualitas DNA sehingga dalam proses PCR menghasilkan hasil yang baik.
Menambahkan DNA terlalu banyak atau terlalu sedikit mempengaruhi profil yang
dihasilkan sehingga dapat menyulitkan pada proses interpretasi. Biasanya tetap
menggunakan sampel reference sebagai standar analisis. Jumlah DNA yang dapat
diekstraksi bergantung pada jenis sampel. Sel berinti mengandung 6 pg DNA, darah
cair mengandung 5000-10000 sel berinti per mililiternya, permililiter sperma
mengandung 66 juta sel sperma. Dalam praktiknya sampel di TKP tidak dalam
keadaan murni dan banyak sel epitel yang rusak sehingga jumlah DNA yang dapat
dipulihkan sangat rendah dan sulit untuk diukur.
Visualisasi pada Gel Agarosa
Kuantitas dan kualitas DNA dapat divisualkan pada gel agarosa. Biasanya
dibentuk dalam gel mini sekitar 10 cm, gel direndam dalam buffer elektroforesis dan
DNA di sematkan berbentuk garis dan arus listrik dialirkan melalui gel yang
membuat DNA negative bermigrasi menuju anoda. Gel agarosa membentuk matrik
berpori sehingga molekul DNA kecil bergelak lebih cepat dibandingkan molekul DNA
berukuran besar. Pewarna dibubuhkan seperti etidium bromidasebelum atau sesuah
elektroforesis, kuantitas DNA sebanding dengan tebal tipisnya warna yang
dihasilkan. Bisa juga menggunakan alternative DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)
yang diberikan sebelum elektroforesis dan divisualisasikan pada transiluminator
yang memancarkan UV pada panjang gelombang 260 nm. Ukuran molekul DNA
dapat diidentifikasi dengan noda untuk molekul kecil danpita tunggal pada molekul
besar, keunggulan metode ini yaitu cepat dan mudah dibawa juga memberikan
indikasi ukuran molekul DNA. Kekurangannya adalah kuantifikasi bersifat subjektif
berdasarkan intensifitas pita, sulit mengukur DNA terdegraasi.

6. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
Spektroskopi UV
DNA dapat menyerap panjang gelombang maksimal 260 nm. Hal ini dapat
digunakan untuk mengukur kuantitas DNA pada panjang gelombang 220-300 nm,
juga memungkinkan menghitung jumlah karbohidrat (absorbansi 230 nm) dan
protein dengan absorbansi 280 nm. Perlakuannya sewajarnya menggunakan
spektrofotometer dengan menggunakan kuvet dan larutan standar. Gambar dibawah
menunjukkan kurva hasil analisiss ekstrak DNA yang murni.
Dapat dilihat rasio absorbansi 260 dan 280 nm harus berada diantara 1,8 dan, 2,0.
Biasanya spektrofotometer UV digunakan di laboratorium biologi dan belum banyak
diadopsi pada metode forensic. Alasannya sulitnya mengukur DNA dalam jumlah
yang kecil dan adanya kontaminasi warna serta asam pada sampel tulang dapat
mempengaruhi analisis.
Spektroskopi Flourescence
Beberapa jenis pewarna seperti Ethidium bromide/DAPI (4,6-diamidino-2-
phenylindole) dapat digunakan untuk memviualisasikan DNA dalam agarosa. Selain
pewarna agarosa pewarna florosen dapat digunakan sebagai alternative
spekrofotometer UV untuk melakukan kuantisasi DNA. Pewarna picogreen spesifik
untuk DNA rantai ganda. Pewarna ini sangat sensitive dan merupakan teknik yang
baik untuk kuantisasi DNA tetapi tidak spesifik pada sampel sel manusia sehingga
memungkinkan bereaksi pada sampel tumbuhan atau zat lainnya.
Hibridisasi
Teknik hibridisasi telah dikenalkan dan dikembangkan sejak tahun 90’an
terutama penggunaan kit Quantiblot. Ekstrak DNA diletakkan pada membrane nilon
bermuatan positif dan diproses menggunakan sebuah slot atau dot blot. DNA tersebut
diuji dengan DNA manusia yang spesifik. Biasanya yang digunakan adalah
pengulangan alpa satelit D17S1, yaitu kromosom manusia ke 17 dalam 500-1000
salinan. Probe dari alat dapat dianalisa dengan kolorimetri dan chemiluminescant.
Berbagai standar diterapkan pada membrane sehingga hasil sangat spesifik sebagai
DNA manusia. Kekurangannya kepekaan yang kurang sehingga interpretasi hasil

7. @Rimbasadewo 15042021 Catatan Belajar IV (Forensic Goodwin)
Goodwin, Wiliam. Linacre, Andrian. &, Hadi, Sibte. 2007. An Introduction To Forensic Genetics.
England : John Wiley & Son Ltd.
bias tiap analisator dan langkah pengerjaan yang rumit sehingga lebih disarankan
penggunaan PCR.
Real-time PCR
Saat membuat profil DNA biasanya analisa PCR dlakukan pada akhir setelah
siklus 28-34. Tapi sangat mungkin untuk memonitor siklus PCR secara langsung.
Umumnya menggunakan ethidium bromide. Setiap siklus mengalami perubahan dan
peningkatan florosensinya dapat diamati langsung dan direkam tahap demi tahap.
Gambar diatas menunjukkan kerja PCR hingga bisa menghasilkan florosensi yang
dapat diamati. Beberapa tes telah dikembangkan seperti system SYBR, Green and
the TAqMan. Semakin banyak produk PCR yang dihasilkan makin banyak pula
molekul florosensi yang dilepaskan dengan kelebihan sensitive dengan langkah yang
tidak rumit.
DNA IQTM system
Kuantifikasi DNA juga dapat dilakukan dengan produk tersebut dengan
metode isolasi salting-out dan pengikat silica sehingga DNA yang terikat lebih
maksimal. Kelebihan dari alat ini adalah mengkombinasikan metode ekstraksi dan
kuantifikasi walaupun belum spesifik untuk sampel DNA manusia.
See you…… @Rimbasadewo (15042021)