2. 2
Holinesteraza
• Skraćenica: cholinesterase CHE ili HE
2 tipa holiesteraze
1. Acetil holinesteraza
EC 3.1.1.7 acetilholin acetilhidrolaza
– Eritrocitna ili prava holinesteraza ili holinesteraza I
2. Pseudoholinesteraza
EC 3.1.1.8 acilholin acilhidrolaza
– serumska holinesteraza ili butirilholinesteraza ili
holinesteraza II
3. 3
Acetilholinesteraza
• Eritrocitna ili prava holinesteraza ili holinesteraza I
• Distribucija
– Prisutna u eritrocitima, plućima, slezini, na nervnim završecima i
sivoj masi mozga
• Uloga:
– Trenutna hidroliza acetilholina na nervnim završecima
5. 5
Serumska holinesteraza
Pseudoholinesteraza
EC 3.1.1.8 acilholin acilhidrolaza
– serumska holinesteraza ili butirilholinesteraza ili holinesteraza II
– prisutna u jetri, pankreasu, srcu, beloj masi mozga i serumu
– prisutna u organizmu više od CHE I (3 x veća aktivnost)
– CHE II ima klinički značaj
– uloga tačna se ne zna
– uloga u metabolizmu ? deaktivacija oktanoil grelina
6. 6
HN
Struktura holinesteraza
Trp 86
Estarsko mesto
O
N
CH3
CH3
CH3
O
OH
Ser 203
Phe 338
Anjonsko mesto
C
O
OGlu 327
N
H
N
His 440
Aktivni centar holinesteraze: estarsko i anjonsko mesto
Katalitička trijada: glutamat, histidin i serin
7. 7
O
O
HN
Trp 86
Ser 203
Phe 338
HO
N
CH3
CH3
CH3
C
O
OGlu 327
N
H
N
His 440
Hidroliza acetilholina sa acetilholinesterazom
Anjonsko mesto
Estarsko mesto
8. 8
O
O
HN
Trp 86
Ser 203
Phe 338
HO
N
CH3
CH3
CH3
holin
C
O
OGlu 327
N
H
N
His 440
Hidroliza acetilholina sa acetilholinesterazom
Anjonsko mesto
Estarsko mesto
9. 9
O
O
HN
Trp 86
Ser 203
Phe 338
C
O
OGlu 327
N
H
N
His 440 H
O H
Hidroliza acetilholina sa acetilholinesterazom
Anjonsko mesto
Estarsko mesto
10. 10
OH
HN
Trp 86
Ser 203
Phe 338
OH
O
acetat
C
O
OGlu 327
N
H
N
His 440
Hidroliza acetilholina sa acetilholinesterazom
Anjonsko mesto
Estarsko mesto
11. 11
Obe holinesteraze katalizuju sledeću reakciju
Kinetičke karakteristike holinesteraza
Razlika u specifičnosti na supstrate
CHE II - benzoilholin
CHE I - deluje samo na holinestre, a ne deluje na alkil i aril estre
12. 12
Kinetičke karakteristike acetilholinesteraze i
holinesteraze
• Inhibicije holinesteraza
• Inhibicija supstratom
– CHE I sa acetilholinom u konc 10 -2 mol/L
– CHE II nije inhibirana supstratom
1. Reverzibilna inhibicija
– oba enzima
– alkaloidima: prostigminom i fizostigminom
– kvarternerni azot u strukturi
2. Ireverzibilna inhibicija
– oba enzima
– organofosfatna jedinjenja: diizopropilfluorofosfat
– fosfatna grupa se vezuje za mesto gde se normalno vezuje acil grupa
– morfin, kinin, tercijalni amini, fenotijazini, pirofosfat, žučne kiseline, citrati,
floridi i borati
14. 14
HN
Inhibicija ACHE sa neostigminom
Trp 86
OH
Ser 203
Phe 338
N
ON
O
Glu 327
His 440
Estarsko mesto
Anjonsko mesto
15. 15
2. Ireverzibilni inhibitori
holinesterazaO P
O
O
F
Isofluorophate; DFP
(Floropryl)
H3C
NH3C
CH3
CH2 CH2 S P
O
OC2H5
OC2H5
I-
Echothiophate
(Phospholine Iodide)
• Organofosfatna jedinjenja
• Vezivanje za estarsko mesto
• Kovalentna modifikacija
acetilholinesteraze
• Duže deluju
16. 16
HN
Trp 86
OH
Ser 203
Phe 338
O P
O
F
O
Glu 327
His 440
Inhibicija ACHE sa organofosfatima
Estarsko mesto
Anjonsko mesto
17. 17
Dejstvo reverzibilnih i ireverzibilnih inhibitora na
acetilholinesterazu
Brza hidroliza
u mikrosekundama
Spora hidroliza
u satima-danima
Spora hidroliza
u minutama
18. 18
Izoforme CHE i genetski polimorfizam
• Elektroforeza razdvaja CHE II na 7 – 12 traka
• Razlike u Mm i stvaranje agregata bazične jedinice
• Genetske varijante
• Dva genska lokusa E1 i E2
– Alelne forme genskog lokusa E1: Eu, Ea, Ef i Es
– Genotipovi ukupno 10:
– jedan normalan UU
– 9 abnormalna UA, UF, US, AA, AS, AF, FF, FS, SS
– Drugi genski lokus E2 ukupno 40 formi CHE II
19. 19
Izoenzimi CHE i genetski polimorfizam
Aloenzimi
1. Normalni uobičajeni fenotip je EuEu (UU) U uobičajeni
2. Atipični Ea
– Homozigoti EaEa (AA) slabo aktivni prema većini supstrata
– rezistentnost na inhibiciju dibukainom
3. Fluorid rezistentni Ef
- smanjena aktivnost i povećana rezistencija na fluorid
4. Tihi ili silent Es
- potpuno odsustvo enzimske aktivnosti ili
- prisutan protein,ali minimalne katalitičke aktivnosti
20. 20
Genetski polimorfizam serumske holinesteraze
• Mutacije Ea i Ef dovode do promene u strukturi aktivnog
centra i snižene aktivnosti
– aloenzimi su manje efektni katalizatori od uobičajenih formi
– redukovan afinitet prema sustratima Km je povećan
– snižen je afinitet prema kompetitivnim inhibitorima dibukainu i
fluoridu
• Učestalost aloenzima
– Homozigoti AA ili FF 0,3-0,5 % kod Belaca
– Kod Crnaca manje
• Povećane aktivnosti CHE u nekim familijama
– uzrok – povećana sinteza uobičajenih aloenzima
21. 21
Klinički značaj holinesteraze
• Određivanje aktivnosti CHE u serumu se koristi:
1. Test za funkciju jetre
sintetske funkcije jetre
2. Indikator trovanja insekticidima
3. Detekcija pacijenata sa atipičnom formom enzima koje
su podložne produženom odgovoru na izvesne
mišićne relaksanse koji se upotrebljavaju u hirurškim
procedurama.
22. 22
Testovi za ispitivanje sintetske funkcije jetre
Albumin
Faktori koagulacije
Protrombinsko vreme
Serumska
holinesteraza Ureja
Lipidi
Sinteza
23. 23
Klinički značaj holinesteraze
1. Ispitivanje sintetske funkcije jetre
• Senzitivan indikator sintetskog kapaciteta jetre
• Svako sniženje aktivnosti CHE u odsustvu inhibitora i
genetskih uzroka reflektuje sintezu enzima u jetri
• Serijsko merenje CHE ukazuje na prognozu kod pacijenta
obolelog od neke bolesti jetre
• Praćenje funkcije jetre posle transplantacije jetre
24. 24
Klinički značaj holinesteraze
2. Indikator trovanja insekticidima
• Paration, sarin, i tetraetilpirofosfat
• Radnici i hemijskoj industriji i u poljoprivredi
• Obe CHE su inhibirane
• Brži pad aktivnosti serumske holinesteraze
• Pad od 40% pre prvih simptoma
• Pad od 80% pojava neuromuskularnih efekata
• Davanje enzimskih reaktivatora
• Posle 3-5 dana povećanje CHE za 15 do 20%
25. Klinički značaj holinesteraze
3. Detekcija pacijenata sa atipičnom formom enzima
• Podložne produženom odgovoru na izvesne mišićne relaksanse koji se
upotrebljavaju u hirurškim procedurama.
• Sukcinildiholin (suxametonium) i mivacurim lekovi se koriste u hirurgiji kao
mišićni relaksansi i oni se hidrolizuju sa holinesterazom i njihov farmakološki
efekat je normano prisutan dok teče hirurška intervencija.
• Kod pacijenata sa malom aktivnošću holinesteraze ili kod onih sa varijantom
slabe aktivnosti, razgradnja leka se ne odvija dovoljno brzo i pacijenti mogu
da uđu u apneju ili produženu paralizu respiratornih mišića. U tom slučaju je
potrebno primeniti mehaničku ventilaciju sve dok se lek ne razgradi.
• Preoperativni skrining aktivnosti CHE se preporučuje u cilju identifikacije
pacijenata kod kojih bi primena ovog leka dovela do komplikacija.
• Stepen osetljivosti na lek varira u zavisnosti od fenotipa pacijenta.
25
26. Klinički značaj holinesteraze
3. Detekcija pacijenata sa atipičnom formom enzima
• Najveća aktivnost je kod pacijenata homozigota sa uobičajenim alelom
• Progresivno je niža aktivnost kod pacijenata heterozigota i imaju jedan
normalan i drugi alel neku varijantu.
• Homozigoti za neuobičajeni alel ili heterozigoti sa oba različita alela i oni
koji imaju oba silent alela nemaju nikakvu aktivnost.
• Osobe heterozigoti koji imaju jedan uobičajen alel obično produkuju dovoljno
dovoljno enzima da zaštite sebe od suksametonijumske aktivnosti, dok oni
koji su heterozigoti ili homozigoti za neuobičajene varijante pokazuju različitu
osetljivost.
• Fenotipovi koji su osetljiviji na apneju su:
• AA, AS, FF, FS, SS, AF i donekle UA.
• Merenje ukupne aktivnosti CHE i određivanje dibukainskog i fluoridnog broja
je potrebno da bi se u potpunosti okarakterisali fenotipovi CHE. 26
27. 27
Klinički značaj acetilholinesteraze
• Indikator trovanja insekticidima – organofosfatnim jedinjenjima
• Aktivnost se određuje u eritrocitima
• Određivanje aktivnosti ACHE u amnionskoj tečnosti
• Prisustvo ACHE kod defekta neuralne tube – spina bifida
28. 28
Metode određivanja aktivnosti serumske holinesteraze
• Supstrati:
– Soli joda acetiltioholina, propioniltioholina, butiriltioholina,
benzoiltioholina i sukciniltioholina
• Indikatorska reakcija
– Oslobođeni tioholin reaguje sa
– DNTB – Elmansovim reagensom.
– 5,5’-ditio-bis(2-nitrobenzoat)
• Proizvod reakcije
– 5-merkapto-2-nitro benzoik (5-MNBA)
– 410 nm
30. 30
Određivanje dibukainskog broja
• Kalow i Genest su koristeći kao supstrat benzoiltioholin ukazali na
kvalitativne razlike holinesteraze.
• Prema osetljivosti na inhibiciju lokalnim anestetikom dibukainom oni su
postavili metodu za jednostavnu identifikaciju osoba tj tipova
holinesteraze uobičajeni, intermedijarni i atipični.
• Dibukainski broj
– pri koncentraciji dibukaina od 10-5 mol/L
– uobičajena CHE je inhibirana 80 %,
– atipična svega 20 %
– heterozigoti sa normalnim i atipičnim alelom imaju 60 % inhibicije CHE.
• Za identifikaciju ostalih fenotipova koristi se natrijum fluorid.
31. 31
Određivanje dibukainskog i fluoridnog broja
• Dibukainski broj DB ili fluoridni broj FB
1-enzimska aktivnost sa inhibitorom
DB = 100 X -------------------------------------------------
Enzimska aktivnost bez inhibitora
• Fenotipizacija holinesteraze zasnovana na određivanju
dibukainskog (DB) i fluoridnog (FB) broja
Zaključci:
• DB i FB ukazuju na procenat inhibicije
enzimske aktivnosti prema specifičnim
supstratima u prisustvu standardnih
koncentracija dibukaina i fluorida.
• Genotipizacija ovih mutacija bi
potvrdilo ove abnormalnosti CHE gena.
Fenotip DB FB
UU ≥77 ≥ 55
UF 72-76 ≥53
UA 48-72 ≥44
AF 45-59 <44
FF 64-69 <44
AA <35 -
32. 32
Referentne vrednosti
Biološki materijal
Metoda sa sukcinilditioholin/DTNB na 37oC
Uobičajeni fenotip (UU)
Ž 33 – 76 U/L
M 40 – 70 U/L
Heterozigoti (UA)
medijana 22 U/L (opseg 5 do 35 U/L
Homozigoti atipični (AA)
medijana 1,5 U/L (opseg 1 – 4 U/L)
Vrednost < 23 U/L se javljaju 5 x češće kod sukcinildiholin osetljivih osoba
nego kod (UU)
Serum je uzorak izbora
Enzimska aktivnost u serumu je stabilna nekoliko nedelja na 4oC
nekoliko godina na -20oC.
Blaga hemoliza ne smeta ukoliko je uzorak centrifugiran i uklonjene
eritrocitne membrane
33. 33
Uticaj starosti
•Pri rođenju CHE je niža za 50 % nego kod odraslih
•Onda raste aktivnost od 3-6 godine i ona je za 30 % veća nego
kod odraslih.
•Posle 5 godine opada i stabilizuje se na nivo odraslih u
pubertetu.
•Značajno sniženje i do 30 % u toku trudnoće i ranog
puerperiuma se objašnjava hemodilucijom.
