1. 1
Kisela fosfataza
Predavanja iz Kliničke enzimologije
Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska
biohemija
Školska 2014/2015. godina
2. Biohemijski markeri remodelovanja kostiju
Enzimski markeri stvaranja kostiju ALP
Enzimski markeri razgradnje – resorpcije kostiju ACP
• Izoenzimi i izoforme markeri remodelovanja kostiju
– BALP Bone alkaline phosphatase Koštana alkalna fosfataza
– TRACP tartarat rezistentna kisela fosfataza
2
3. 3
Kisela fosfataza
• Uloga i karakteristike enzima
• Distribucija enzima u organizmu
• Izoenzimi i izoforme
• Klinički značaj
• Tartarat rezistentna kisela fosfataza
• Analitika ACP i TR-ACP
• Preanalitičke varijacije
• Referentne vrednosti
4. 4
Kisela fosfataza
• Skraćenica: ACP acid phosphatase ili KF
• Enzimski broj: EC 3.1.3.2, ortofosforna- monoestar fosfohidrolaza (kiseli
optimalni pH)
• Klasa hidrolaza
• Grupa enzima koja hidrolizuje ortofosfatne monoestre
• Ortofosfatni monoestar + H2O → alkohol + H3PO4
• Obuhvata sve fosfataze sa optimalnim pH ispod 7
• Deluje na prirodne i sintetičke supstrate
• Izoenzimi ili izoforme kiselih fosfataza razlikuju se po rasprostranjenosti u
tkivima, hromozomskom poreklu, molekulskoj masi, homologiji
aminokiselina, dužini sekvence amino kiselina, rezistenciji na tartarat i
fluorid.
5. 5
Kisela fosfataza
Ćelijska lokalizacija
• Lizozomalna ACP
– ACP je prisutna u lizozomima, a to su organele prisutne u svim ćelijama izuzev
eritrocita.
• Ekstralizozomalna ACP je prisutna u mnogim ćelijama
Distribucija u tkivima
• Najveća koncentracija ACP je u prostati, kostima (osteoklastima),
slezini
Distribucija kisele fosfataze u krvi
• Eritrociti, trombociti i leukociti
6. 6
Kisela fosfataza
• Na osnovu svojstava inhibicije L-(+)-tartaratom podeljene su na
• Tartarat osetljive kisele fosfataze
– lizozomalna i prostatična ACP su jako inhibirane tartaratnim jonom
• Tartarat rezistentne kisele fosfataze
– eritrocitna i koštana ACP
• Serumska kisela fosfataza
– Najveći deo aktivnosti ACP u normalnom (nehemolizovanom)
serumu je tartarat rezistentna forma TR-ACP i potiče iz osteoklasta
7. 7
Izoenzimi i izoforme kisele fosfataze
Pet tipova kisele fosfataze (4 izoenzima)
Elektroforetska pokretljivost na PAAG
1. Lizozomalna LAP tip 3
– Mast ćelije
2. Prostatična kisela fosfataza PACP tip 2b
– Prostata, mozak, slezina, jetra, trombociti
3. Eritrocitna EACP tip 1
– Eritrociti
4. A. Makrofagna MACP tip 5a
– Makrofage jetre, slezine i pluća
B. Osteoklastna OsACP tip 5b
– Osteoklasti kostiju
8. 8
Kisela fosfataza
• 4 gena za kiselu fosfatazu.
• Gen za eritrocitnu - hromozom 2
• Gen za TR-ACP osteoklasta i makrofaga - hromozom 19
• eksprimira se u osteoklastima i makrofagama drugih tkiva
– makrofage alveola i Kupferove ćelije (tip 5 ACP)
– Izoenzim 5 se sastoji iz dve strukturno slične izoforme koje se razlikuju
u sadržaju ugljenih hidrata.
• Tip 5a makrofage i dendritske ćelije
• Tip 5b više specifičan za osteoklaste
• Geni za lizozomalni izoenzim - hromozom 11
• Gen za prostatičnu ACP – hromozom 13
• Lizozomalni i prostatični gen pokazuju homologiju
9. 9
Svojstva kisele fosfataze
• Stabilnost kisele fosfataze – nestabilna
– Na temperaturi preko 370C
– Nestabilna u alkalnoj sredini, pH >7,0
– Neke forme u serumu su labilne i više od 30 % ACP aktivnosti se gubi
tokom 3 sata na sobnoj temperaturi
– Acidifikacija seruma na pH ispod 6,5 pomaže u stabilizaciji enzimske
aktivnosti.
• Uticaj jona, aktivatora i inhibitora
– Na aktivnost ne utiču joni Mg 2+ i Zn 2+.
– Aktivnost ACP stimulišu hidroksilna jedinjenja - akceptori fosfata
– Izoenzimi ACP se međusobno razlikuju i po osetljivosti prema
inhibitorima kao što su etanol, formaldehid, L-(+)-tartarat, gvožđe, bakar
i fluorid.
10. 10
Lizozomalna kisela fosfataza
• Deficijencija LACP
• Autozomalno recesivno oboljenje
• Poremećaji u metabolizmu
Prostatična kisela fosfataza
• Serumski marker kancera prostate
• U semenoj tečnosti
• Marker u forenzici za seksualne delikte
• Ranije se prostatična ili tartarat osetljiva kisela fosfataza koristila za praćenje
karcinoma prostate ali sada je u potpunosti zamenjena sa prostata- specifičnim
antigenom (PSA).
• Novija ispitivanja prognostičkog značaja PACP
• Vrednosti su višestruko povećane kod karcinoma prostate
Eritrocitna kisela fosfataza
• EACP pokazuje genetski polimorfizam
• Utvrđivanje očinstva
• Poremećaj hemolitički favizam
Izoenzimi kisele fosfataze
12. 12
Osteoklastna kisela fosfataza
Tartarat rezistentna kisela fosfataza
• Osteoklasti produkuju i izlučuju
tartarat rezistentnu kiselu fosfatazu
u toku resorpcije kostiju
• Svojstva tartarat rezistentne kisele fosfataze
– Glikoprotein 35 KDa,
– Aktivan centar binuklearno gvožđe
– Aktivnost ACP u serumu je merena brojnim metodama, ali one ne mogu
da razdvoje dve izoforme TRACP 5b iz osteoklasta i TRACP 5a iz
inflamatornih makrofaga i dendritskih ćelija.
13. 13
Osteoklastna kisela fosfataza
Tartarat rezistentna kisela fosfataza
Svojstva izoformi TRACP
– Izoforme se razlikuju u sadržaju ugljenih hidrata
– ACP 5a sadrži sijalinsku kiselinu i manozu, a ACP5b samo
manozu.
– Forma 5b je dimer dok je 5a monomer
Sintetiše se u inaktivnoj formi
Aktivacija dejstvom cistein proteinaze
– u serumu se javljaju dve forme
– aktivna i neaktivna forma
– 10 % TR-ACP cirkuliše u enzimski aktivnoj formi
– 90 % u vidu neaktivnih fragmenata
15. 15
Klinički značaj tartarat rezistentne kisele fosfataze
• Dejstvo TR-ACP
– Deluje na prirodne i sintetičke fosfatne supstrate
– Fosfoproteine matriksa kostiju osteopontin i koštani sijaloprotein
• TR-ACP je potencijalno važan marker u stanjima značajne
osteolitičke aktivnosti.
• TR-ACP je važna za dijagnozu, praćenje i tretman patologije
resorpcije kostiju
• Aktivnost osteoklasta povećava sintezu i sekreciju ACP
• Broj osteoklasta se povećava u bolestima kostiju
• Broj osteoklasta se snižava kod antiresorptivne terapije
• Primena lekova
– bifosfonata i
– selektivnih modulatora estrogenskih receptora SERM
16. 16
Klinički značaj tartarat rezistentne kisele fosfataze
Blaga ili umerena povećanja serumske TR-ACP
1. Pagetova bolest
2. Hiperparatioridizam sa manifestacijama na kostima
3. Malignim invazijama na kostima pri kanceru dojke kod žena
4. Osteoklastoma tumor giant ćelija - osteoklastna neoplazma
5. Osteopetrosis – mermerna bolest kostiju gde osteoklasti ne mogu
da resorbuju kost
17. 17
Među bolestima kostiju umeren porast
se dobija kod Pagetove bolesti
(osteitis deformans)
Rezultat dejstva osteoklastnih ćelija
Povećana aktivnost u prvoj fazi, ali specifičnije
je povećanje ALP
Rentgenski snimak
Osteolitička mesta na delu osteoklastne
resorpcije kostiju
Sklerotična mesta na delu aktivnosti
osteoblasta
Kisela fosfataza u Pagetovoj bolesti
18. 18
Klinički značaj tartarat rezistentne kisele fosfataze
• Visoka koncentracija TR-ACP u serumu pacijenata je proporcionalna broju
osteoklasta
• TR-ACP pokazuje male dinamične promene u poređenju sa drugim
markerima disocijacije kostiju kao što su markeri metabolizma kolagena tipa I
– Enzim se oslobađa u mikrookolinu osteoklasta, a ne direktno u cirkulaciju
19. 19
Klinički značaj tartarat rezistentne kisele fosfataze
• Prednost određivanja TR-ACP u odnosu na druge markere resorpcije
kostiju
• Za razliku od ostalih markera resorpcije kostiju (C-telopeptid I kolagen) TR-
ACP nije pod uticajem renalne disfunkcije.
• Diurnalna varijacija je minorna jer je poluživot TR-ACP 5b duži nego drugih
markera resorpcije
20. 20
Primena tartarat rezistentne kisele fosfataze za praćenje
efekta terapije kod osteoporoze
Efekat terapije bifosfonatima (alendronat) sniženje 40 % u poređenju sa
ostalim parametrima urinarni telopeptidi 49 do 69% i CTX 75 %.
21. 21
Klinički značaj TR-ACP
• Stanje koje nije vezano za kosti a odlikuje se povišenjem TR-
ACP je Gaucher-ova bolest slezine, lizozomalna bolest
deponovanja
• Izvor TR-ACP su abnormalne makrofage u slezini i drugim
tkivima, u kojima ima prekomerne ekspresije normalnih
sastojaka makrofaga
• Osteoklastna TR-ACP ima značaj i kod leukemije
retikuloendoteliosis i koristi se kao važan histološki marker
– Izoenzim ne prelazi u cirkulaciju
22. 22
Makrofagna kisela fosfataza
Tartarat rezistentna kisela fosfataza tip 5a
• Gaucher-ova bolest
• Poremećaj metabolizma glukocerebrozida
• Recesivno oboljenje
• Deponovanje lipida u mozgu i kostima
• Mentalna retardacija
• Gaucher-ove ćelije –
– makrofagne abnormalne ćelije
– identifikacija ćelija citohemijsko bojenje
• Demineralizacija kostiju
Ćelije kostne srži:
Gaucherove ćelije sa deponovanim
Glukocerebrozidima u lizozomima
duguljastog izgleda
24. 24
• Određivanje aktivnosti ukupne kisele fosfataze u serumu
• Određivanje prostatične kisele fosfataze
• Određivanje neprostatične kisele fosfataze
• Određivanje tartarat rezistetne kisele fosfataze
• Određivanje prostatične kisele fosfataze
• Dodatak tartarata inhibira osetljivu prostatičnu kiselu fosfatazu, a
preostala aktivnost se meri i označava kao neprostatična kisela
fosfataza.
• Iz razlike ukupne i neprostatične kisele fosfataze dobija se vrednost
prostatične kisele fosfataze
Metode određivanja aktivnosti kisele fosfataze
25. 25
Supstrati:
• 4-nitrofenilfosfat, 1-naftil-fosfat i timolftalein-fosfat
• Pojedini izoenzimi ACP pokazuju različitu specifičnost prema supstratima
• 1-naftil-fosfat i timolftalein-fosfat brže se hidrolizuju sa prostatičnim
izoenzimom nego sa ostalim ne-prostatičnim ACP
• Diskontinuirana metoda
– Supstrat: 4-nitrofenilfosfat
4-Nitrofenilfosfat + H2O ↔ fosfat + 4-nitrofenol
– Reakcija se odvija u kiseloj sredini i prekida se dodatkom alkalije
– Meri se apsorbancija 4-nitrofenola na 405 nm
• Kontinuirana metoda
– 1-naftil fosfat i FAST RED TR
Metode određivanja aktivnosti kisele fosfataze
26. 26
Metode određivanja tartarat rezistentne kisele fosfataze
Kontinuirane metode
• Kontinuirane metode Hillman-ova metoda
• Supstrat: 1-naftil-fosfat
• Proizvod reakcije: 1-naftol gradi obojeni produkt koji je stabiliziran sa
diazonijum solima 2-amino-5-hlorotoluen-1,5-naftalen disulfonat (Fast
Red TR)
• Alkoholi poput 1,5 pentandiola ubrzavaju reakciju i povećavaju
senzitivnost jer deluju kao akceptori fosfata u transferu
• Dodatak natrijum tartarata inhibira osetljive izoenzima (prostatičnu i
lizozomalnu ACP)
27. 27
Metode određivanja tartarat rezistentne kisele fosfataze
Imunohemijske metode
• TR-ACP tip 5b se određuje imunoesejom
• Prve metode koriste monoklonalno antitelo koje vezuje ACP za čvrstu fazu
• Posle vezivanja aktivnost TR-ACP se određuje pri optimalnom pH 6,1
• Druge metode koriste dva monoklonalna antitela koja su dobijena sa visoko
prečišćenim koštanim TR-ACP 5b
– Jedno antitelo vezuje intaktnu izoenzimsku molekulu TR-ACP, a drugo antitelo
eliminiše interferencije inaktivnih fragmenata tipa 5b u serumu.
– Posle imunoreakcije vezana aktivnost TR-ACP tip 5b se meri sa specifičnim
supstratom na koji selektivno deluje na TR-ACP 5b i taj supstrat je 2-hlor-4-nitrofenil
fosfat.
• Ova dva eseja imaju sličnu specifičnost za TR-ACP 5b i klinički značaj u
praćenju antiresorptivne terapije.
• FAICEA – fragment absorbed immunocapture enzymatic assay.
28. 28
Metode određivanja tartarat rezistentne kisele fosfataze
Priprema uzoraka
• Serum se mora odvojiti odmah od eritrocita i stabilisati dodatkom 50 μL
sirćetne kiseline (5 mol/L) po mL seruma do pH 5,4 pri kome je enzim
stabilan
• Pod ovim uslovima, TR-ACP ostaje stabilna na ts nekoliko sati do nedelju
dana, ako se čuva na 40C ili 4 meseci na -200C
• Hemolizirani uzorci seruma su kontaminirani sa značajnom količinom TR-
ACP izoenzima i taj se uzorak mora odbaciti
Referentni interval
• Serum zdravih osoba
• TR-ACP na 370C 1,5 do 4,5 U/L
• Deca imaju više vrednosti 3,4 do 9,0 U/L
• Kod dece dečaci između 13 i 17 godina imaju više vrednosti od devojčica u
istoj starosnoj grupi
