Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Proteoliticki enzimi 2014

2,530 views

Published on

Published in: Health & Medicine
  • Be the first to comment

Proteoliticki enzimi 2014

  1. 1. 1 Pankreasni enzimi Proteolitički enzimi Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina
  2. 2. 2 Pankreasni enzimi • Amilaza • Lipaza • Proteolitički enzimi - zimogeni enzimi – Tripsin – Himotripsin – Elastaza
  3. 3. 3 Proteolitički enzimi • Peptidaze • Endopeptidaze i egzopeptidaze • Endopeptidaze ili proteaze – Serin proteaze – Cistein proteaze – Aspartat proteaze – Metalo-proteaze • Egzopeptidaze – Karboksipeptidaze – Aminopeptidaze – Dipeptidaze
  4. 4. 4 Mesta delovanja proteolitičkih enzima Podela proteolitičkih enzima 1. Intracelularni 2. Sekretorni
  5. 5. 5 Intracelularni proteolitički enzimi Lokalizacija u ćeliji • Lizozomi – Katepsini – Katepsini B,D i L • Tumor markeri – Katepsin S • Proaterogena svojstva • Proteozomski kompleks
  6. 6. 6 Varenje u želucu Pepsin Varenje u duodenumu Tripsin Himotripsin Elastaza Karboksipeptidaze A i B Varenje u tankom crevu Endopeptidaze Aminopeptidaze Dipeptidaze Sekretorni proteolitički enzmi Uloga proteolitičkih enzima u varenju proteina
  7. 7. Varenje proteina: enzimi Aminopeptidaze Karboksipeptidaze  Egzopeptidaze  Endopeptidaze
  8. 8. Varenje u želucu: Pepsini • Enzim: Pepsin A (karboksil-proteaza) • Proenzim: Pepsinogen A • Aktivatori: – Autoaktivacija (pepsinogen, pH < 5) – Autokataliza (pepsin) • Specifičnost (R): – Phe – Tyr CO NHCHCO NHCHCO R R’
  9. 9. Varenje u tankom crevu: Pankreasni enzimi • Enzim: Tripsin (serin-proteaza) • Proenzim: Tripsinogen • Aktivatori: – Enteropeptidaza – Tripsin • Specifičnost (R): – Arg – Lys CO NHCHCO NHCHCO R R’
  10. 10. CO NHCHCO NHCHCO • Enzim: Himotripsin (serin-proteaza) • Proenzim: Himotripsinogen • Aktivator: – Tripsin • Specifičnost (R): – Tyr, Trp, Phe, Met, Leu • Enzim: Elastaza (serin-proteaza) • Proenzim: Proelastaza • Aktivator: – Tripsin • Specifičnost (R): – Ala, Gly, Ser CO NHCHCO NHCHCO R R’ CO NHCHCO NHCHCO R R’
  11. 11. • Enzim: Karboksipeptidaza A Proenzim: Prokarboksipeptidaza A • Aktivator: – Tripsin • Specifičnost (R): – Val, Leu, Ile, Ala • Enzim: Karboksipeptidaza B • Proenzim: Prokarboksipeptidaza B • Aktivator: – Tripsin • Specifičnost (R): – Arg, Lys CO NHCHCOO- R CO NHCHCOO- R
  12. 12. Varenje u tankom crevu: Membranski enzimi mikrovila enterocita • Endopeptidaze – Endopeptidaza 24.11 (hidrofobne aminokiseline) • Aminopeptidaze – Aminopeptidaza A (kisele aminokiseline) – Aminopeptidaza N (neutralne aminokiseline) – Leucin-aminopeptidaza • Dipeptidaze
  13. 13. Varenje proteina: Rezime endopeptidaza aminopeptidaza dipeptidaza enzimi mikrovila tankog creva Polipeptidi Aminokiseline (40%) Oligopeptidi (60%) Aminokiseline Dipeptidi Tripeptidi pepsin tripsin himotripsin elastaza karboksipeptidaza A i B želudačni i pankreasni enzimi
  14. 14. 14 Serin proteaze • Serin proteaze su članovi familije proteolitičkih enzima • Sve one imaju u svom aktivnom centru serin što je ključno za funkciju ovih enzima • Sve one cepaju peptidnu vezu sličnim mehanizmom • Razlikuju se u svojoj specifičnosti i regulaciji
  15. 15. 15 Serin proteaze U serin proteaze spadaju: 1. Pankreasne proteaze: tripsin, himotripsin i elastaze. 2. Razne intracelularne proteaze poput elastaze leukocita 3. Prohormon konvertaza (PC) 4. Faktori koagulacije su enzimi - serin proteaze 5. Fibrinolitički enzimi plazmin i njegovi aktivatori 6. Neki enzimi sistema komplementa
  16. 16. 16 Specifičnost serin proteaza Aromatične aminokiseline Aminokiseline sa malim bočnim hidrofobnim lancima Arginin i lizin
  17. 17. 17 Svojstva serin proteaza 1. Samo jedan ostatak serina je katalitički aktivan u molekulu serin- proteaza i sudeluje u hidrolizi peptidne veze 2. Analiza X-zracima je ukazala na prisustvo histidina i asparagin koji su uvek vezani sa aktiviranim serinskim ostatkom Katalitička trijada Ser 195, His 57 i Asp 102
  18. 18. 18 Mehanizam dejstva serin proteaza • Mehanizam dejstva serin proteaza je sledeći: katalitička trijada (Asp...His....Ser) konvertuje serin u vrlo snažni oksianjon. • U tom oksianjonskom đepu olakšano je stvaranje tetrahedralnog tranzicionog stanja. Acilacijom serina aktivnog centra stvara se kovalentni intermedjer. Tetrahedralno tranziciono stanjeOksianjonsko mesto
  19. 19. 19
  20. 20. 20 Svojstva serin proteaza 3. Eukariotske serin proteaze pokazuju veliku analogiju u sekvenci aminokiselina i strukturi 4. Geni koji kodiraju serin proteaze su slično organizovani 5. Egzon-intronski uzorak je takav da se tri aminokiseline katalitičke trijade nalaze na odvojenim egzonima 6. Katalitička jedinica SP ima dva strukturna domena podjednake veličine. Aktivno mesto je u procepu između ova dva domena 7. Serin proteaze koje intereaguju direktno sa površinom membrane imaju dodatni domen 8. Prirodni supstrati i inhibitori se ekstremno čvrsto vezuju pomoću specifičnog mesta
  21. 21. 21 •Specifičnost potiče od prisustva jednog đepa blizu aktivnog centra •Vezuje bočne lance aminokiselina supstrata •Struktura ovog đepa varira od jednog enzima do drugog Mehanizam dejstva serin proteaza Specifičnost serin proteaza
  22. 22. 22 Specifičnost potiče od prisustva jednog đepa blizu aktivnog centra koji vezuje bočne lance aminokiselina supstrata. Struktura ovog đepa varira od jednog enzima do drugog. Mehanizam dejstva serin proteaza Specifičnost serin proteaza
  23. 23. Svojstva serin proteaza 8. Sinteza u vidu zimogena – inaktivna forma enzima 9. Aktivacija zimogena proteolitičkom hidrolizom Aktiviraju se kada se mali delovi polipeptidnog lanca uklone Hormoni, Digestivni enzimi, Faktori koagulacije
  24. 24. 24 Svojstva serin proteaza 9. Aktivacija zimogena proteolitičkom hidrolizom 10. Sposobnost autolize ili samo-hidrolize Zimogeni enzimi pankreasa • tripsinogen • himotripsinogen • proelastaza • prokarboksipeptidaza Tripsinogen Tripsin enteropeptidaza
  25. 25. 25 Zaštita od razgradnje proteina tkiva, pankreasa. Prerana aktivacija zimogena se sprečava (3 varijante): 1. Sintezom enzima u vidu zimogena 2. Čuvanjem ovih zimogena u vezikulama rezistentnim na dejstvo proteaza 3. Prisustvom pankreasnog tripsin inhibitora (PTI) • Pankreasni tripsin inhibitor (PTI) • mali protein 6K • Čvrsto vezan za aktivno mesto kao supstrat ali se ne razlaže. Značaj sinteze proteolitičkih enzima u vidu zimogena
  26. 26. 26 Proteolitički enzimi pankreasa Zimogeni enzimi • tripsinogen • himotripsinogen • proelastaza • prokarboksipeptidaza (inaktivan) U pankreasu (aktivan) u intestinumu
  27. 27. 27 Aktivacija zimogena • Inaktivni prekurzor enzima zimogen se aktivira selektivnom proteolizom prekurzora koji dovodi do konformacionih promena i aktivacije ovih enzima. • Konformacione promene (2 mehanizma) – formiraju aktivni centar enzima ili – izlažu aktivni centar supstratu • Kaskadne su reakcije • Aktivacije enzima u određeno vreme i na određenoj lokaciji
  28. 28. 28 Aktivacija zimogena Kaskadne reakcije
  29. 29. 29 Proces koagulacije Aktivacija zimogena Kaskadne reakcije
  30. 30. 30 Zimogeni enzimi Aktivacija zimogena Enteropeptidaze se nalaze vezane za membrane intestinalnog epitela Hidroliza veze lizina i izoleucina Tripsinogen → N-terminalni heksapeptid + tripsin
  31. 31. 31 Aktivacija tripsinogena Dva mesta proteolitičkog razlaganja tripsinogena: •Autokatalitičko •Razlaganje enteropeptidazom i tripsinom
  32. 32. 32 Aktivacija himotripsinogena
  33. 33. 33 Inhibitori proteaza Serpini • SERPIN (serine protease inhibitor) • Inhibiraju serin proteaze pošto one završe svoje dejstvo
  34. 34. 34 Humani proteini inhibitori serin proteaza • α1-proteinaza inhibitor • α1-antihimotripsina • Inter- α - tripsin inhibitor • α 2-antiplazmin • Antitrombin III • C1 inhibitor • Α2makroglobulin • Proteaza neksin I • Proteaza neksin II • Inhibitor aktivatora plazminogena I • Inhibitor aktivatora plazminogena II
  35. 35. 35 Proteolitički enzimi u dijagnostici oboljenja pankreasa • Tripsin • Himotripsin • Elastaza-1 Klinički značaj proteolitičkih enzima: • Neinvazivni testovi za ispitivanje egzokrine funkcije pankreasa • Diferencijalna dijagnoza pankreasne insuficijencije i malapsorpcije • Enzimi u fecesu: • Himotripsin • Elastaza-1
  36. 36. 36 Tripsin • EC 3.4.21.4; nema sistemsko ime; • Skraćenica TRY • Serin proteaza • Pankreasna serin proteaza • U aktivnom centru je prisutan serin i histidin i oba sudeluju u katalitičkom procesu – TRY hidrolizuje peptidnu vezu između karboksilne grupe lizina ili arginina sa drugim amino grupama – Estri i amidi koje grade ove aminokiseline se mnogo brže raskidaju od peptidne veze CO NHCHCO NHCHCO R R’
  37. 37. 37 Tripsinogeni • Acinarne ćelije humanog pankreasa sintetišu dva različita tripsina (1 i 2) u formi neaktivnih proenzima (ili zimogena), tripsinogen-1 i -2. • Zimogeni se deponuju u zimogenim granulama • Sekrecija u duodenum pod stimulacijom: – nerva vagusa ili – intestinalnog hormona - holecistokinin-pankreozimin. • Oba dva tripsinogena sačinjavaju oko 19 % od ukupnih proteina u pankreasnom soku • Tripsinogen-1 je prisutan oko 4 puta više od tripsinogena-2. • U oboljenjima pankreasa ovaj odnos je obrnut
  38. 38. 38 Tripsin • U intestinalnom traktu, tripsinogen prelazi u aktivan enzim tripsin dejstvom duodenalne enteropeptidaze ili autokatalitički • Hidroliza veze lizin – izoleucin • Kada tripsinogen pređe u tripsin oslobađa se mali peptid koji predstavlja odcepljeni N-terminalni region tripsinogena • (TAP- trypsinogen activation peptide) . • Određivanje urinarnog TAP daje korisne informacije o težini akutnog pankreatitisa TAP
  39. 39. 39 Tripsin • Elektroforetska pokretljivost tripsina: – TRY-1 je katjonski – TRY-2 je anjonski – Katjonski enzim dominira i bolje je opisan • Razlike između TRY-1 i TRY-2 – TRY-1 i TRY-2 imaju molekulske mase 25800 i 22900 – TRY-1 pI 4,6 do 6,5 – TRY-2 pI > 6,5 – TRY-2 se razlikuje od TRY-1 po tome što brzo podleže autolizi pri neutralnom ili alkalnom pH – Ca2+ ne stabilizuje enzim TRY-2 od autolize – Pošto ova dva tripsina pokazuju malu ukrštenu reaktivnost postoje specifični imunoeseji za svaki od ovih enzima
  40. 40. 40 Tripsin • Materijali kao što je soja, pasulj i belance jajeta sadrže prirodne inhibitore TRY • Inhibitori tripsina: • Serumski • α1-antitripsin (α1-proteaza inhibitor) i α2-makroglobulin • Inhibitori se kombinuju sa TRY ireverzibilno i inaktiviraju ga tako što blokiraju aktivni centar. • Pankreasni sok • Slični nediazibilni TRY inhibitori su prisutni u pankreasu, pankreasnom soku • Pancreatic secretory trypsin inhibitor- PSTI • Tripsin inhibitori štite plazmu i druge proteine od hidrolize sa drugim proteazama ukoliko izvesne količine ovog enzima prodru u vaskularni sistem • Odsustvo α1-antitripsina je povezana sa povećanom tendencijom ka panlobularnim emfizemima u ranom životu – efekat neinhibirane proteaze na tkiva našeg organizma
  41. 41. 41 Mehanizmi sekrecije, aktivacije i inhibicije tripsina Rezime
  42. 42. 42 Klinički značaj tripsina Tripsin-1 katjonski tripsin • Kod zdravih osoba slobodan tripsinogen-1 je glavna forma prisutna u serumu • Posle akutnog napada pankreatitisa, serumski TRY-1 se povećava paralelno sa aktivnošću amilaze • Maksimalno dostignute vrednosti su 2 do 400 puta veće od URL • Distribucija razlićitih formi TRY-1 je povezana sa tipom i težinom akutnog pankreatitisa • U blagoj formi AP 80-99% TRY-1 postoji kao tripsinogen-1 sa manjim proporcijama vezanog TRY-1 • U težim oblicima AP gde je mortalitet 20% pa i do 50 %, proporcija slobodnog tripsinogena je niza i do 30 % od ukupnog • Postoje i odgovarajuće proporcije α1 antitripsina i α2-makroglobulina vezanog za TRY-1.
  43. 43. 43 Klinički značaj tripsina Tripsin-1 katjonski tripsin • TRY-1 je povećan kod hroničnog oštećenja bubrega, kao što je povećana AMY i LPS. Bubrežno oštećenje se mora uzeti u obzir pri interpretaciji povećanih vrednosti • Hronični pankreatitis • Bez steatoreje – Nema promena plazmatske koncentracije TRY-1 • Sa steatorejom – Vrlo niska koncentracija tripsina. • U povratnoj fazi hroničnog pankreatitisa plazmatski TRY može biti značajno povećan. • U karcinomu pankreasa TRY koncentracije mogu biti normalne, visoke ili niske. • U poređenju sa merenjem P-AMY i LPS, merenje TRY-1 je teže izvodlijivo, i duže. Merenje tripsina se ne može rutinski primeniti kod akutnog pankreatitisa, ovaj test ima limitiranu kliničku vrednost.
  44. 44. 44 Klinički značaj tripsina Tripsin-1 katjonski tripsin • Cistična fibroza je genetsko oboljenje koje primarno zahvata pluća i digestivni trakt • Rezultira produkcijom gustog mukosa koja blokira duktus pankreasa, i na taj način se sprečava normalan transport tripsinogena • U ovim uslovima plazmatska koncentracija TRY je visoka kod novorođenčadi, a pošto bolest napreduje aktivnost opada • Skrining novorođenčadi se radi merenjem imunoreaktivnog tripsinogena, i u suvim uzorcima krvi (mrlje krvi). • Deca sa visokim koncentracijama TRY moraju da se prate i da se ponovi test posle 1 i 3 nedelja ili inicijalno iz kapi krvi da se utvrdi specifična DNK mutacija.
  45. 45. 45 Klinički značaj tripsina Tripsin-2 anjonski tripsin • Serumski tripsinogen-2 je viši od tripsinogena-1 u akutnom pakreatitisu 10x • Velike količine tripsinogena-2 se izlučuje putem urina • Određivanje tripsinogena imunofluorimetrijski ili kvalitativnim brzim testom za merenje tripsinogena-2 – visoka senzitivnost – visoka negativna prediktivna vrednost za dijagnozu akutnog pankreatitisa pri prijemu u bolnicu – pozitivna prediktivna vrednost vrlo niska • Stvoreni tripsin je inaktiviran stvaranjem kompleksa sa α1-antitripsinom • Određivanje ovog kompleksa sa TRY-2 ima prednost u odnosu na tripsinogen-2 i AMY u akutnom pankreatitisu • Preliminarna istraživanja
  46. 46. 46 Metode određivanja tripsina • Prve metode katalitičke – interferencija drugih proteolitičkih enzima koji deluju na iste supstrate • Glavni napredak je razvoj imunoeseja za kvantifikaciju TRY u krvi 1. TRY-1 imunoesej detektuje – tripsinogen-1, TRY-1 i kompleks TRY-1- α1-antitripsin – ne detektuju kompleks TRY-1- α2-makroglobulina (drugi esej je potreban) – obično TRY-1 nema slobodnog u krvi već u kompleksu • Komercijalni testovi imunoeseji su dostupni za određivanje TRY-1. Obzirom da ovi eseji nisu strandardizovani nema ni referentnih vrednosti. 2. Brza metoda određivanja tripsinogena-2 u urinu (5 minuta) je dostupna i ona je zasnovana na imunohromatografiji sa monoklonalnim antitelima – Tripsinogen-2 > 50 μg/L javlja se plava traka na test traci i onda se smatra da je test pozitivan.
  47. 47. 47 Himotripsin • Himotripsin sistemski broj EC 3.4.21., • Skraćenica CHY, nema sistemsko ime • Serin-proteaza • Specifičnost (R): – Tyr, Trp, Phe, Met, Leu – aromatične aminokiseline – Specifičnost himotripsina u poređenju sa tripsinom je da on deluje na veze amino grupa aromatičnih aminokiselina – Himotripsin pokazuje i hidrolitičku aktivnost i na druge tipove veza prema sledećem redosledu: – Estri (posebno N-supstituisane tirozinske estre) >amide> peptide CO NHCHCO NHCHCO R R’
  48. 48. 48 Himotripsinogeni • Acinarne ćelije humanog pankreasa sintetišu 2 himotripsina: (himotripsin 1 i 2, pri čemu je broj dva važniji) u vidu inaktivnih proenzima ili zimogena • himotripsinogen-1 i himotripsinogen-2 • Ovi zimogeni se deponuju u granulama i sekretuju u pankreasni kanal kao i tripsinogen • U intestinalnom traktu himotripsinogen se pretvara u himotripsin dejstvom tripsina • Himotripsin je manje podložan razgradnji u GIT u odnosu na tripsin i zato se može određivati i u fecesu • CHY-1 je anjonski a CHY-2 katjonski i dominira katjonska forma • Molekulske mase su istovetne oko 25000 • Postoji imunološka sličnost između himotripsina i himotripsinogena. • CHY kao i TRY je vezan za alfa-1-antitripsin i alfa-2-makroglobulin
  49. 49. 49 Aktivacija himotripsinogena u himotripsin Uklanjanje dipeptida 2 disufidne veze Tri peptida vezani disufidnim mostovima
  50. 50. 50 Klinički značaj himotripsina • Hronična pankreasna insuficijencija • Najveći značaj ima ispitivanje himotripsina u fecesu u cilju ispitivanja hronične pankreasne insuficijencije • CHY u fecesu je obično snižen ispod donje granice referentnih vrednosti kod osoba sa steatorejom, ali nije koristan za identifikaciju osoba sa ranom pankreasnom insuficijencijom • Merenje CHY u fecesu kod osoba sa hroničnom insuficijencijom pankreasa tretiranih suplementima pankreasnih enzimima može da ukaže da li je terapija adekvatna ili je potrebno povećati dozu
  51. 51. 51 Značaj određivanja himotripsina i elastaze-1 u fecesu kod praćenja efekta terapije Tretman pankreasnim enzimima uticaj na nivo himotripsina u fecesu Ispitivanja na pacijentima sa cističnom fibrozom i steatorejom
  52. 52. 52 Metode određivanja himotripsina • Sintetički supstrati se koriste • Kinetički osetljiv test koristi: • scc-ala-al-pro-phe-4-nitroanilid kao supstrat • Predhodno se uzorak fecesa tretira sa deterđentom kako bi se oslobodio himotripsin vezan za partikule • Mali uzorak fecesa se homogenizuje, estrakcija se vrši i centrifugira • Ekstrakt se pomeša sa supstratom, koji hidrolizuje CHY i stvara se slobodan 4-nitroanilid koji se meri fotometriski na 405 nm • Aktivnost CHY u stolici ostaje konstantna na sobnoj temperaturi do 7 dana Referentne vrednosti • Donja granica RV aktivnosti CHY u fecesu na 37oC iznosi 12 U/g fecesa
  53. 53. 53 Metode određivanja himotripsina Primer sintetičkog supstrata
  54. 54. 54 Elastaza-1 • Humana elastaza-1 (EC 3.4.21.36;) • nema sistemsko ime; skraćenica E1 • Anjonska proteaza koja pripada familiji serin proteaza • To je karboksiendopeptidaza koja katalizuje hidrolizu nativnog elastina – glavnog strukturnog fibroznog proteina u vezivnim tkivima sa posebnim afinitetom za karboksilne grupe alanina, valina i leucina • Humana E1 se sintetiše u acinarnim ćelijama pankreasa zajedno sa drugim digestivnim enzimima • Sastoji se od 240 aminokiselina i Mm od 26000
  55. 55. 55 Elastaza-1 • Enzim se sintetiše kao preproelastaza. Posle procesuiranja u proelastazu deponuje se u zimogenim granulama i posle se aktivira u elastazu pomoću TRY u duodenumu • Elastaza-1 se minimalno degradira tokom prolaza u crevima • Istorijski, svaka proteaza koja hidrolizuje elastin se naziva elastaza • Kodirajući geni za elastazu su u klasteru na hromozomu 19 • Poznata su tri osnovna tipa enzima: 1. Pankreasna elastaza-1 E1 (EC 3.4.21.36;) 2. Pankreasna elastaza-2 (EC 3.4.21.71) 3. Pankreasna endopeptidaze-3 (EC 3.4.21.70) koja se naziva i holesterol-vezujuća proteaza
  56. 56. 56 Klinički značaj elastaze-1 • Hronična insuficijencija pankreasa • Merenje E1 u fecesu je najrealniji i senzitivniji neinvazivni postupak za dijagnozu insuficijencije hroničnog pankreatitisa • Ovaj test ne može da razdvoji pacijente po težini pankreasne insuficijencije od zdravih osoba • E1 za razliku od CHY u fecesu ne omogućava praćenje terapije
  57. 57. 57 Značaj određivanja enzima u fecesu kod praćenja efekta terapije Tretman pankreasnim enzimima ne utiče na nivo elastaze-1 u fecesu Ispitivanja na pacijentima sa cističnom fibrozom i steatorejom
  58. 58. 58 Neinvazivni testovi za ispitivanje egzokrine funkcije pankreasa Enzimi u fecesu: himotripsin i elastaza-1 Osetljivost i specifičnost
  59. 59. 59 Metoda određivanja elastaze-1 Metoda određivanja elastaze-1 u fecesu Izolovana monoklonalna antitela • ELISA test na mikrotitarskim pločama • Merenje masene koncentracije elastaze-1 u fecesu Stabilnost enzima • Enzim je stabilan u uzorcima stolice do 1 nedelje na sobnoj temperaturi Referentne vrednosti • Donja granica E1 koncentracije u fecesu je 200 μg/g fecesa

×