3. 3
Lipaza
• EC 3.1.1.3; triacilglicerol acilhidrolaza; skraćenica LPS
• Lipaza je glikoprotein sa jednim lancem i Mm od 48000 i izoelektričnom tačkom
5,8.
• Gen za LPS je na hromozomu 10
• Koncentracija LPS u pankreasu je
• 5000x veća od koncentracije u drugim tkivima
• Koncentracioni gradijent između
pankreasa i seruma je 20 000x
4. 4
Lipaza
• Za punu katalitičku aktivnost i veliku specifičnost neophodno je prisustvo
žučnih soli i kofaktora koji se naziva kolipaza
• Kolipaza mali peptid (10 000) se sekretuje iz pankreasa prema potrebama
• Humana LPS se može u potpunosti aktivirati in vitro pomoću kolipaze i iz
drugih vrsta (na primer kolipaza svinje)
• Važno je kod određivanja ovog enzima
• Reagens rastvor: kolipazu i deoksiholat
5. 5
Mehanizam dejstva lipaze
• Lipaza je hidrolaza koja katalizuje reakciju hidrolize estara glicerola i to
masnih kiselina dugih lanaca
• Samo estarske veze na položaju 1 i 3 (alfa-pozicija) su podložne hidrolizi i
produkt reakcije su 2 mola masne kiseline i 1 mol 2-acilglicerola (beta-
monoglicerid) po molu supstrata
• Monoglicerid je rezistentan
na hidrolizu
• Uzrok sterne smetnje
• Spontana izomerizacija
u alfa formu (3-acilglicerol)
• Hidroliza treće masne kiseline
spora hidtroliza
6. 6
Lipaza
• Lipaza deluje samo ukoliko je supstrat emulgovan na međupovršini između
vode i supstrata
• Brzina dejstva lipaze zavisi od veličine te površine dispergovanog supstrata
• Žučne soli omogućavaju da ta površina bude slobodna od drugih proteina,
uključujući i lipolitičke enzime, oblaganjem površine nesolubilnog supstrata i
vodenog medijuma
• LPS prihvata višak supstrat na sledeći način:
• kolipaza se vezuje za micele žučnih soli
• stvara se kompleks kolipaza-žučna so
• rekonfiguracija strukture kolipaze sa ekspozicijom strane sa velikim afinitetom
i visokom specifičnošću za LPS
• privlači LPS i vezuje je za površinu supstratu, omogućavajući na taj način
delovanje enzima
9. 9
Lipaza
• Poreklo lipaze u serumu
– najveći deo aktivnosti potiče iz pankreasa
– manji deo iz pljuvačnih žlezda i mukoze želuca, pluća i
intestinuma
• LPS je mala molekula koja se filtrira u glomerulima, ali se
potpuno reapsorbuje u tubulima i normalno se ne detektuje u
urinu.
• Pankreasna lipaza pokazuje dve izoforme
• Postoji i potpuni nedostatak lipaze, kongenitalno oboljenje koje
je praćeno malapsorpcijom i teškom steatorejom.
10. 10
Klinički značaj lipaze
• Određivanje lipaze u serumu se koristi u dijagnozi akutnog
pankreatitisa.
• Klinička senzitivnost: 80-100 % zavisno od izabrane cutoff vrednosti.
• Klinička specifičnost: 80-100 % zavisno od grupe pacijenata koja se
ispituje.
• Nakon napada akutnog pankreatitisa:
– aktivnost serumske lipaze se povećava u toku 4 do 8 sati
– pik posle 24 sata
– smanjuje se posle 8 do 14 dana
– koncentracija ostaje povišena duže od amilaze
– povećanje od 2 do 50x URL
– povećanje u LPS aktivnosti nije proporcionalno težini napada
11. 11
Klinički značaj lipaze
• Dijagnoza akutnog pankreatitisa je nekada teška, zato što se mora izvršiti
diferencijalna dijagnoza od drugih akutnih intraabdominalnih bolesti sa
sličnim kliničkim nalazima, kao što je perforacija ulcera na želucu ili
dvanaestopalačnom crevu, opstrukcija intestinalna ili vaskularna-
mezenterična.
• U diferencijalnoj dijagnozi pankreatitisa
• Povećanje LPS u serumu veće od 3x URL
– Ukoliko je isključeno oštećenje bubrega
• Poređenje lipaze i amilaze
– Veča dijagnostička specifičnost lipaze u odnosu na povećanje aktivnosti amilaze
u serumu
– Koncentracija LPS ostaje duže povišena nego AMY
– Preporuka je da LPS zameni amilazu kao inicijalni dijagnostički test za akutni
pankreatitis u urgentnim odeljenjima
12. 12
Klinički značaj lipaze
Dinamika promena lipaze i amilaze nakon akutnog
pankreatitisa
1. Veće vrednosti lipaze 3x URL
2. Duže ostaju povišene vrednosti u serumu
13. 13
• Opstrukcija pakreasnog duktusa sa kalkulusom ili karcinomom
povećava aktivnost LPS
• Povećanje zavisi od mesta opstrukcije i od mase preostalog
funcionalnog tkiva pankreasa
• Kod pacijenata sa smanjenom glomerularnom filtracijom, aktivnost
serumske lipaze je povećana
• Posebnu pažnju treba obratiti u interpretaciji rezultata vrednosti
serumske LPS kod renalnih bolesnika.
• Istraživanje bilijarnih puteva endoskopijom, pankreatografija ili tretman
opijatima (koji dovode do kontrakcije Odijevog sfinktera) mogu povećati
aktivnost serumske LPS
• Makrolipaza
Klinički značaj lipaze
14. 14
Određivanje aktivnosti lipaze
• Postoji veći broj metoda određivanja aktivnosti lipaze koje koriste kao
supstrat: trigliceride i ne-trigliceride (sintetičke supstrate)
Principi ovih metoda:
• Titrimetrijske, turbidimetrijske, spektrofotometrijske, fluorimetrijske i
imunološke tehnike
• Generalno metode koje koriste trigliceride sa masnim kiselinama dugih
lanaca pokazuju bolju korelacije sa kliničkim stanjima u odnosu na druge
metode
15. 15
Određivanje aktivnosti lipaze
Titrimetrijske metode
Cherry-Crandall-ova metoda
• LPS katalizuje hidrolizu masnih kisaelina iz emulzije maslinovog
ulja ili oleinske kiseline
• Titracija oslobođenih masnih kiselina sa razblaženim alkalijama
• Kinetičke verzije koriste automatski potenciometrijski titrator
(instrument koji se naziva pH-stat)
• Količina upotrebljene alkalije se beleži u funkciji vremena i služi
za merenje stvorene količine masnih kiselina u toku reakcije
• Referentna metoda
16. 16
Određivanje aktivnosti lipaze
Turbidimetrijske metode
• U ovoj metodi LPS hidrolizuje masne kiseline iz emulzije
oleinske kiseline sa simultanim sniženjem turbiteta reakcione
smese.
• Apsorbancija se meri na 340 nm
• ∆A/min mera enzimske aktivnosti LPS
• Kalibrator
• Ponekad apsorbancija umesto da opada raste tj turbiditet se
povećava
– U slučaju prisustva reumatoidnog faktora
• Linearnost metode je ograničena 3x URL
– Primeniti razblaživanje seruma
• Gornja granica RV na 300C je 150 U/L
17. 17
Određivanje aktivnosti lipaze
Spektrofotometrijske metode
• Veći broj supstrata i kompleksi pomoćnih i indikatorskih enzima se
koriste u spektrofotometrijskim metodama
• Orto dijagnostika slide method
• Sintetički supstrat 1-oleoil-2,3-diacetilglicerol i emulgator je
dodecilbenzen sulfonat
• LPS aktivnost se meri sa kompleksom pomoćnih i indikatorskih
enzima i produkuje obojeni proizvod koji se meri na 540 nm
• Substrat je više specifičan za intestinalnu nego pankreasnu lipazu
• Interferencije postheparinske lipaze i pankreasne karboksilesteraze
• Gornja referentna vrednost je 200 U/L na 300 C.
18. 18
Određivanje aktivnosti lipaze
TOOS - sodium N-etil-N-(2-hidroksil-3-sulfopropil)-m-toluidin
oksidacija → intenzivno obojeno jedinjenje (550 nm)
Gornja RV je 45 U/L na 37o C.
19. 19
Novi sintetički supstrat (1,2-0-dilauril-rac-glicero-3-glutarna kiselina-(4-metil-rezorufin)
estar, sadrži dve glicerol etarske i jednu estarsku vezu.
LPS hidrolizuje estarsku vezu u alkalnoj sredini u nestabilni estar dikarbonske kiseline i
spontano hidrolizuje pri čemu nastaje glutarna kiselina i metilrezorufin.
Određivanje aktivnosti lipaze
Količina stvorenog metilrezorufina je direktno
proporcionalna aktivnosti LPS u uzorku
Gornja granica referentnih vrednosti je
38 U/L na 37o C bez razlika u odnosu na pol i god
U poređenju sa drugim LPS spektrofotometrijskim
metodama, princip ovog eseja se zasniva na
direktnoj reakciji i ima povećanu specifičnost za LPS
20. 20
Stabilnost enzima:
• aktivnost LPS u serumu je stabilna na sobnoj temperaturi
nedelju dana
• serum se može čuvati 3 nedelje u frižideru
• nekoliko godina zamrznut
Imunohemijske metode
• određivanje koncentracije lipaze
• ELISA test
Određivanje aktivnosti lipaze
