Фітьо А.І. - Основи методу Fish
- 1. Основи методу FISH,досвід використання в лабораторії CSD Біолог Фітьо Анастасія Київ – 2021
- 2. FISH - Fluorescencein situ Hybridization Гібридизація in situ – базовий метод молекулярно-цитогенетичних досліджень. ● дозволяє виявити специфічну послідовність нуклеїнової кислоти (ДНК чи РНК) в клітині. ● Принцип методу полягає у комплементарному зв’язуванні нуклеотидного зонду (проби) із послідовністю ДНК чи РНК досліджуваного зразка. Гібридизація in situ Формування гібридів (ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК) В умовах фіксованого субстрату, в клітині ДНК зразка Зонд
- 3. Класифікація зондів ● Зонд(проба) – це коротка нуклеотидна послідовність (оптимально 50-300 пар основ), комплементарна досліджуваній послідовності нуклеїнової кислоти. За місцем приєднання: a) локусспецифічні (LSI - Locus Specific Identifier) b) центромерні (CEP) c) теломерні d) до всієї хромосоми (WCP - Whole chromosome painting) За будовою: a) дволанцюгові ДНК-зонди, b) одноланцюгові антисенс-РНК-зонди (рибопроби), c) одноланцюгові ДНК-зонди, d) синтетичні олігодезоксинуклеотидні зонди та олігорибозонди
- 4. За способом мічення: Зонди Зрадіоактивною міткою З нерадіоактивною міткою P32, S35, H3 Біотин Дигоксигенін (DIG) Флуорохром мітки fluorescein rhodamine coumarin Texas Red SpectrumOrange SpectrumGreen
- 5. Види гібридизації insitu ISH Радіоактивний (авторадіографія) BRISH Bright field in situ hybridization (світлова мікроскопія) СISH Chromogenic in situ hybridization SISH Silver in situ hybridization інші FISH Fluorescent in situ hybridization (флуоресцентна мікроскопія) Rainbow-FISH Raman-FISH ReD-FISH Reverse-FISH RING-FISH RNA-FISH RxFISH Split-Signal FISH T-FISH 3-D FISH Zoo-FISH ACM-FISH armFISH CARD-FISH catFISH CB-FISH CO-FISH COBRA-FISH COD-FISH COMBO-FISH Comet-FISH Cryo-FISH D-FISH DBD-FISH e-FISH Fiber-FISH Flow-FISH Fusion-Signal FISH Halo-FISH Harlequin-FISH Immuno-FISH LNA-FISH M-FISH Multilocus or ML-FISH PCC-FISH PNA-FISH Q-FISH QD-FISH
- 6. Принцип та основніетапи методу FISH/CISH (на прикладі гістологічного матеріалу) Парафіновий блок з фіксованою у формаліні тканиною Виготовлення зрізів товщиною 2-3 μm Депарафінізація у ксилолі Дегідратація у серії спиртів в порядку зменшення їх концентрації Ферментативний протеоліз (найчастіше з використанням пепсину) Додавання міченої проби Денатурація (82 °С, 5 хв) Гібридизація 37 °С (18 год) Постгібридизаційна відмивка Детекція Пряма (проба, мічена флуорохромом, FISH метод) Непряма (проба, мічена біотином або дигоксигеніном, СISH метод) Контрфарбування з 4’,6-діаміно-2- феніліндолом (DAPI)
- 7. Принцип методу CISH HRP –Horseradish peroxidase (пероксидаза хрону) DAB – Diaminobenzidine – субстрат для HRP EBV (CISH)
- 8. ● Проводиться задопомогою флуоресцентного мікроскопа. ● Аналіз і підрахунок клітин відбуваєтсья при великому збільшенні (10х100) з використанням імерсійної олії для флуоресцентного мікроскопа (Type FF) Інтерпретація результатів FISH DAPI Green/orange фільтр
- 9. a) Single colorprobe b) Dual color probe c) Multi color probe d) Dual color Break apart probe e) Dual color Fusion probe Dual Color Probe Multi color probe Dual color Fusion probe Dual Color Break Apart Probe Опис (карта) проби
- 10. Практичне застосування FISH(CISH) в медицині ● Виявлення вірусних геномів (EBV, HPV) ● Виявлення генетичних порушень на метафазних хромосомах або в інтерфазних ядрах клітин (хромосомні аберації, транслокації, делеції, ампліфікації тощо) ● Диференційна діагностика в онкології ● Визначення чутливості до таргетних препаратів в онкології ● Визначення груп ризику в онкології ● Пренатальна діагностика
- 11. Приклади застосування методуFISH в лабораторії CSD • В 1960 г Peter Nowell та David Hungerford описали специфічну хромосому, яку назвали філадельфійською. • Філадельфійська хромосома (Ph.) – це результат реципрокної транслокації* між ділянками довгого плеча 22 (ділянка 22q11.23, ген BCR) та 9 (ділянка 9q34.12, ген ABL1) хромосоми. • У 90% пацієнтів з хронічним мієлолейкозом і 25% з гострим лімфобластним лейкозом наявна транслокація • BCR/ABL t (9; 22) (q34.1; q11.2). *Реципрокна транслокація - обмін ділянками між двома негомологічними хромосомами Визначення «Філадельфійської хромосоми» (BCR/ABL, t (9; 22) (q34.1; q11.2))
- 12. BCR/ABL - (2R2G) BCR/ABL + (2F1R1G) BCR/ABL+ (1F1R1G) Матеріал: кров або аспірат кісткового мозку Підрахунок мінімум 100 клітин Cut off – 2 % Проба: Dual color Fusion probe Визначення філадельфійської хромосоми BCR/ABL
- 13. Визначення чутливості дотаргетних препаратів Дослідження ампліфікації гена Her2/neu (рак молочної залози, рак шлунка, колоректальний рак) • Ген ERBB2 (Her2/neu) розташований на довгому плечі 17 хромосоми (17q12) • Ген ERBB2 кодує білок 185-190 кДа (Her2/neu), що є рецептором з тирозинкіназною активністю та бере участь в регуляції клітинного росту. • Білок Her2/neu є мішенню для таргетних препаратів, що інгібують дію цього білка та блокують проліферацію (ріст) пухлинних клітин. • Для визначення ефективності дії такого препарату необхідно провести дослідження ампліфікації (збільшення кількості копій) гена Her2/neu.
- 14. Базовий алгоритм проведеннядослідження * Оцінка ступеня експресії Her2/neu (метод ІГХ) Her2/neu (0/+1) негативний Her2/neu (3+) позитивний Her2/neu (2+) сумнівний Ампліфікація гена HER2/neu (FISH) *ASCO–CAP HER2 Test Guideline Recommendations (2018)
- 15. Матеріал: гістологічний (FFPEtissue), парафінові зрізи Підрахунок мінімум 20 клітин інвазивного компоненту пухлини Проба: Dual color probe Дослідження ампліфікації гена HER2/neu (FISH) Базовий алгоритм проведення дослідження * HER2/CEN17 >2, HER2 >6 позитивний HER2/CEP17 <2, HER2 = 4-6 пограничний HER2/CEN17 <2, HER2 <4 негативний *ASCO–CAP HER2 Test Guideline Recommendations (2018)
- 16. ● Ген ALK(Anaplastic lymphoma kinase) розташований на короткому плечі 2 хромосоми ● Ген ALK кодує трансмембранний білок з тирозинкіназною активністю, який є мішенню для дії таргетних препаратів, інгібіторів ALK. ● Транслокація гену ALK спостерігається у 5-7% пацієнтів з недрібноклітинним раком легень (НДРЛ) Визначення чутливості до таргетних препаратів Виявлення транслокації гена ALK (Аденокарцинома легень)
- 17. Матеріал: гістологічний матеріал(FFPE tissue), цитологічний матеріал Підрахунок мінімум 50 пухлинних клітин Проба: Dual color probe (break apart) Рекомендації щодо інтерпретації * *The IASLC Atlas of ALK and ROS1 Testing in Lung Cancer
- 18. Визначення груп ризику Матеріал:кров або аспірат кісткового мозку на EDTA Підрахунок мінімум 100 клітин Cut off – 10 % Проба: Dual color probe Виявлення делеції 17p13.1 (TP53) • Ген TP53 розташований на короткому плечі 17 хромосоми (17p13.1) • Ген TP53 кодує білок 53 кДа (р53), що є транскрипційним фактором та бере участь в регуляції клітинної проліферації, диференціації та апоптозу. Є супресором пухлинного росту. • Делеція 17p13.1 (TP53) зустрічається при багатьох онкогематологічних захворюваннях (ХЛЛ, МДС, множинна мієлома та ін.) і зазвичай асоціюється з несприятливим прогнозом (група високого ризику)
- 19. Отже, ● FISH єважливим методом молекулярно-цитогенетичних досліджень, який дозволяє виявити різні генетичні порушення (транслокації, делеції, ампліфікації тощо) ● Є важливим допоміжним інструментом в 1. діагностиці онкологічних захворювань та підтверджені діагнозу 2. підборі тактики лікування 3. прогнозі перебігу захворювання
- 20.