ứNg dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CÔNG NGHỆ RNA
INTERFERENCE VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI
GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH
Macrobrachium Rosenbergii
(De Man, 1879)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị An.
Cán bộ hướng dẫn : Th.S Bùi Thị Liên Hà.
MSSV: Lớp: 08DSH4

Đồ án tốt nghiệp
1
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là loài tôm
nước ngọt có giá trị quan trọng và đóng vai trò lớn trong nghề nuôi trồng thủy sản ở
nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong những năm gần đây, việc nuôi tôm
càng xanh ở Việt Nam đang phát triển một cách mạnh mẽ, đặc biệt là những khu
vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông đang mở rộng hơn 8000 ha và
sản lượng đã đạt 10000 tấn trong năm 2010 (Hai, 2010). Do đó nhu cầu về con
giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn.
Tuy nhiên, nghề nuôi tôm càng xanh đã và đang gặp nhiều khó khăn do
những đặc điểm sinh học của chúng. Những con tôm càng xanh đực thường lớn
nhanh gấp bốn hoặc năm lần tôm cái trong cùng quần thể và thời gian nuôi, điều
này dẫn tới sự cạnh tranh về thức ăn, môi trường sống và gây ra hiện tượng ăn thịt
đồng loại. Thông thường, sự khác nhau về kích thước của tôm có thể thấy bằng mắt
trong giai đoạn trưởng thành về giới tính, con cái ngưng phát triển và tập trung
dưỡng chất cho việc sinh sản (Cohen, 1984), trong khi đó con đực vẫn tiếp tục phát
triển và đạt kích thước lớn hơn so với con cái khi trưởng thành. Những vấn đề này
ảnh hưởng tới sản lượng thu hoạch và lợi ích kinh tế do kích thước tôm càng lớn thì
giá thành càng cao.
Việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái
hay đực và cái trong cùng quần thể (Sagi và Ra’anan, 1988). Khối lượng trung bình
của mỗi quần thể lần lượt là 473 g/m2
, 248 g/m2
và 260 g/m2
. Những nhà khoa học
Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi
tôm toàn đực, toàn cái và hỗn hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997). Điều này thể hiện
rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và
mang lại lợi nhuận cao hơn việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái. Vì thế, việc
nghiên cứu và phát triển một số kỹ thuật tạo quần thể tôm càng xanh toàn đực là
nhu cầu cần thiết hiện nay.

2
Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một
công cụ hiệu quả để hiểu rõ về chức năng của những gene quy định tính trạng bằng
cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008). Ý
tưởng tạo ra con cái giả bằng cách làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến
đực insuline–like của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin–like
androgeneic gland, Mr–IAG) bằng RNA mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện
thành công tại quy mô phòng thí nghiệm (Ventura và ctv, 2009). Kể từ đó, kỹ thuật
bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn
đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương mại.
Chính vì những lý do đó mà đề tài “Ứng dụng thử nghiệm công nghệ iRNA
vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii”
được tiến hành.
1.2. Mục đích của đề tài.
Mục đích của việc nghiên cứu này là ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA để tạo
ra con cái giả phục vụ cho công tác tạo tôm càng xanh toàn đực với Mr–IAG là
gene mục tiêu.
1.3. Nội dung của đề tài.
Nghiên cứu công nghệ bất hoạt RNA thông qua quy trình tổng hợp double
stranded RNA theo bộ Kit của hãng Promega và Ambion.
Kiểm tra hiệu quả của sợi đôi dsRNA trong thực nghiệm chuyển đổi giới tính
của tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii.

3
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về tuyến đực trên tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii.
2.1.1. Phụ bộ đực.
Phụ bộ đực là cơ quan giao cấu ở tôm càng xanh đực nó xuất hiện ở chân bơi
thứ hai.
Chồi của phụ bộ đực bắt đầu xuất hiện vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi
sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38g; tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94
ngày tuổi thì phụ bộ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006).
Hình 2.1. Chân bơi thứ 2 của tôm càng xanh đực.
2.1.2. Tuyến đực.
Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong
tôm nước ngọt Cambarus montanus (Faxon, 1884). Tuyến hormon đã được xác
định sau đó ở giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953 và mô đó được gọi là
tuyến đực (Charniaux–Cotton, 1953). Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn
về tuyến đực, nó là một lớp mô mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước
ngọt Procambarus blandingii, P. viaeviridis, Camb. bartonni và Camb. diogenes
(Puckett, 1964). Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua Scylla
serrata (King, 1964).
Ở giáp xác tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormon là tuyến
đực. Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục (tinh sào) có hai chức
năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở tôm càng xanh và có
thể ở nhiều động vật giáp xác thuộc bộ mười chân Decapoda khác hai chức năng

4
này thực hiện bởi hai cơ quan riêng lẻ. Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo tinh,
còn tuyến đực (androgenic gland) – một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra
hormon, tham gia vào sự biệt hoá giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục
thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng (Sagi, 2001).
Ở những tôm đực lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ. Đó
là một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh. Cũng như
tuyến sinh dục và ống dẫn tinh, tuyến đực chịu sự ức chế của một tuyến nội tiết nằm
ở cuống mắt tôm.
Hình 2.2. Tuyến đực ở tôm càng xanh có hình kim tự tháp ở cuối ống dẫn tinh.
Sự tồn tại của tuyến đực được xác nhận ở nhiều loài giáp xác, chúng tiết ra
hormon có tác động lên sự biệt hoá giới tính (Chaniaux–Cotton và Payen, 1985;
Katakura, 1989).
Tuyến AG có vai trò lên sự biệt hóa giới tính và quá trình lột xác.
Charniaux– Cotton đã chứng minh rằng việc cắt bỏ tuyến AG ở Orchestia
gammarella làm giảm sự sinh tinh trùng ở con đực (Charniaux–Cotton, 1954).
2.1.3. Hormon tuyến đực.
Hormon tuyến đực tinh chế đã được tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều
Armadilidium vulgare là một protein gồm có ba chuỗi peptid A (chứa 29aa), B
(44aa), và C (45aa), ngoài ra trên chuỗi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm
carboxyl (Martin và ctv, 1999). Trọng lượng phân tử hormon khoảng 16.570 Da.
Khi tiến hành tiêm hormon tuyến đực cho con cái còn nhỏ, sau này con cái này phát
triển thành con đực, khi cho giao vĩ với con cái thì có chức năng sinh sản cho ra thế
hệ con.

5
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực (Martin và ctv, 1999).
2.1.4. Tác động của tuyến đực lên sự phân hóa giới tính ở tôm càng xanh.
Tuyến androgenic (AG) là cơ quan nội tiết của con đực, có vai trò quan trọng
trong việc hình thành giới tính và các đặc tính sinh dục thứ cấp (Ohs và ctv, 2006).
AG nằm cuối ống dẫn tinh, gần lỗ mở sinh dục và liên kết lõng lẻo với ống dẫn tinh.
AGH là hormon điều khiển biệt hóa giới tính thành con đực và phát triển các đặc
điểm sinh dục đực thứ cấp. Sự tiết GSH và GIH được cho là do quy định của một số
chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào buồng trứng của con cái. Ở con
đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự điều khiển AG và sau đó giảm tiết
AGH. Hormon kích thích tuyến sinh dục là cần thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong
tinh hoàn (Fingerman, 1997).
AG tham gia vào quá trình biệt hóa giới tính ở con đực thông qua việc tiết
hormon. AGH là tín hiệu ban đầu của tất cả các bước cần thiết trong quá trình biệt
hóa giới tính và phát triển đặc điểm của con đực (Ohs và ctv, 2006). Nếu không có
AG hoặc sự tiết AGH không đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục
cái (Sagi và ctv, 1995). Sự phát triển của AG được cho là dấu hiệu của tín hiệu di
truyền (Ohs và ctv, 2006). Sự cắt bỏ tuyến androgenic ở tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii giai đoạn còn non có thể gây đảo giới hoàn toàn, với sự
cái hóa các tính trạng sinh dục sơ cấp và thứ cấp và con vật có thể sinh sản như con
cái (Sagi và ctv, 1990; Sagi và ctv, 1997).

6
2.2. Công nghệ chuyển đổi giới tính tôm càng xanh.
2.2.1. Cơ sở lý thuyết tạo dòng tôm càng xanh toàn đực.
Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con
cái là dị giao tử (WZ). Để tạo dòng đơn tính toàn đực (100% tôm đực ZZ) thì cần
có tôm bố và tôm mẹ có cùng NST ZZ. Để tạo dòng toàn đực việc cần thiết để tạo
tôm cái giả mang NST ZZ.
Male: ♂ (ZZ) X Female: ♀ (ZZ)
100% ♂ (ZZ)
Hình 2.4. Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực.
Sagi và Cohen đã cho biết khi cho những con cái chuyển giới khoẻ mạnh khi
lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dòng con toàn đực (Sagi, Cohen, 1990).
2.2.2. Các phương pháp tạo tôm càng xanh cái giả.
2.2.2.1. Vi phẩu loại bỏ tuyến đực.
Tôm chưa trưởng thành có thể thực hiện vi phẫu loại bỏ tuyến androgene ở
tôm đực, dẫn đến sự tạo trứng, sự phát triển của vòi trứng và lỗ sinh sản của con cái
trong con đực đã chuyển giới trong giai đoạn phát triển còn non nhất. Tôm đực sau
đó sẽ phát triển thành con cái. (Nagamine và ctv, 1980). Việc loại bỏ AG ở con đực,
làm mất AGH gây nên hiện tượng: con đực thành con cái mang NST ZZ. Kỹ thuật
vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực hiện lần đầu tiên bởi Sagi (Sagi và ctv,
1990). Ở Việt Nam, kỹ thuật vi phẫu đã được thực hiện và thành công năm 2004
(Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004).
Kỹ thuật vi phẫu là kỹ thuật tạo ra tôm cái giả để sản xuất tôm toàn đực phổ
biến hiện nay. Tuy nhiên kỹ thuật này cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần
nhiều người để sản xuất một số lượng tôm cái giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tôm
vi phẫu thành tôm cái giả có thể sinh sản được thì không ổn định. Vì vậy, cần tìm ra
các phương pháp mới để cải thiện các hạn chế của kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn
tôm toàn đực để tăng sản lượng cho người nuôi.

7
2.2.2.2. Cấy tuyến đực vào tôm cái.
Sự biệt hóa giới tính ngược của con cái isopod Armadillidiumvulgare, được
gây ra do việc cấy AG vào trong con cái, sau đó đã bắt đầu biệt hóa hình thái giới
tính. Ở tôm càng xanh, việc cấy AG của con đực trưởng thành vào trong con cái
chưa trưởng thành, kết quả là con cái đã biệt hóa ngược thành con đực (Nagamine
và ctv, 1980). Tuy nhiên, khả năng sống sau khi cấy AG thấp (Ohs và ctv, 2006).
2.2.2.3. Sử dụng hormon.
Hiện nay, steroid được sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá khi ngâm
hoặc tiêm hoặc qua chế độ ăn trước khi biệt hóa giới tính. Điều này mang lại hy
vọng trong việc sử dụng hormon để điều khiển giới tính ở động vật giáp xác. Điều
khiển chế độ ăn chứa hormon được xem là phương pháp thiết thực nhất trong quy
mô thương mại. Tuy nhiên, phương pháp này mang lại những thách thức do khả
năng mất các hormon do sự rò rỉ từ các viên thức ăn hoặc từ sự cố tiêu hóa, đặc biệt
là mất do sự thay đổi của thức ăn chế biến trước khi tiêu thụ (Ohs và ctv, 2006).
Dewi và cộng sự đã dùng hormon 17β–estradiol bổsungvào thứcăn để điều
khiển giới tính tôm càng xanh. Kết quả thu được là 17β–estradiol không ảnhhưởng
đến tỷ lệ đực cái ở tôm càng xanh (Dewi và ctv, 2006).
Baghel và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khichoấu
trùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α–methyltestosterone, dạng
steroid của động vật có xươngsống,kết quảchothấy17α–methyltestosteronecó tác
dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực (Baghel và ctv,
2004). Nhưng sau đó, Ohs và cộng sự dùng 17α–methyltestosteron bổ sung vào
thức ăn để chuyển giới tính tôm càng xanh. Tuy nhiên, kết quả lại cho thấy 17α–
methyltestosteron không có tác dụng trong việc chuyển đổigiớitính tômcàng xanh
(Ohs và ctv, 2006). Như vậy, 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới
tính ở tôm càng xanh là chưa xác định.
Ohs và cộng sự cho hậu ấu trùng của tôm càng xanh thường (50% đực, 50%
cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15 ppm trong vòng
60 ngày (Ohs và ctv, 2006). Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tôm cái là 62,6%,

8
trong khi đó 3 nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15;
1,5 và 15 mg/kg có tỷ lệ tôm cái lần lượt là: 80,9%; 88%; và 71%. Kết quả cho thấy
có sự chênh lệch đáng kể giữa nhóm không và có cho ăn thức ăn có bổ sung
dopamine. Thử nghiệm đã tạo ra một tiềm năng sử dụng dopamine để tạo ra tôm
càng xanh toàn đực phục vụ cho sản xuất.
2.3. Giới thiệu cộng nghệ iRNA và ứng dụng trong tạo tôm càng xanh cái giả.
2.3.1. Giới thiệu về iRNA.
Công nghệ iRNA gây bất hoạt gene là một công cụ đầy hứa hẹn và là cơ chế
điều khiển hoạt hóa gene phổ biến ở các cơ thể sống nhân thực. iRNA là quá trình
làm bất hoạt gene một cách đặc thù, nó chỉ làm bất hoạt một gene (gene đích) có
trình tự tương đồng với các tác nhân gây bất hoạt gene (các sợi RNA ngắn khoảng
21–27 nucleotide). iRNA có thể tham gia điều khiển hoạt hóa gene ở giai đoạn
phiên mã gene – ngăn cản sinh tổng hợp RNA hoặc ở giai đoạn sau phiên mã –
phân hủy mRNA và làm triệt tiêu sinh tổng hợp protein (Đỗ Năng Vịnh, 2007).
Can thiệp RNA (iRNA) là sợi đôi RNA (dsRNA), nó có tác động đặc hiệu
với một trình tự mục tiêu, thúc đẩy sự phân hủy và ngăn chặn sự biểu hiện của trình
tự mục tiêu (Chen và ctv, 2003). Sự can thiệp RNA thông qua trung gian dsRNA là
một cơ chế bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) và bảo tồn trong suốt quá trình phát
triển. Nó cũng có thể biểu hiện ở mức độ phiên mã hoặc dịch mã của quá trình sao
chép nội sinh và ở mức nhiễm sắc bằng cách hình thành vùng chất nhiễm sắc thể
trong nhân (Hannon, 2002).
iRNA là một hiện tượng trong Neurospora crassa, trình tự RNA tương đồng
có khả năng chế ngự gene nội sinh (Romano và Macino, 1992).
Dựa trên thành tựu của chương trình Geneomics trình tự của hầu hết các
gene quan trọng đều có thể xác định, từ đó thiết kế các dsRNA tương đồng để gây
bất hoạt mọi gene đích. Công nghệ iRNA có thể tạo ra cuộc cách mạng trong nghiên
cứu y sinh và chữa bệnh. Ý nghĩa khoa học và tiềm năng ứng dụng to lớn của công
nghệ iRNA đã được nhiều tác giả đề cập, họ cho đây là “một công nghệ đầy uy
lực”, “cuộc cách mạng iRNA” (Archana, 2003; Ajit, 2007). Năm 1998, hai nhà

9
khoa học Mỹ Fire và Mello đã xuất bản công trình nghiên cứu đột phá về cơ chế
gây bất hoạt gene bởi iRNA đăng trên tạp chí Nature (Fire và Mello, 1998).
2.3.2. Lịch sử nghiên cứu iRNA.
Trong lịch sử, sự can thiệp RNA hay iRNA được biết đến với những tên gọi
khác như : RNA silencing, quelling, cosuppresion, RNA inteference . . .
Lần đầu tiên, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng RNA sense có hiệu quả
cũng như là RNA antisense trong việc ức chế sự biểu hiện gene ở loài giun với tên
khoa học là C. elegans (Guo và Kemphues, 1995).
Nghiên cứu iRNA được mô tả là một hiện tượng trong C.elegans, bằng cách
tiêm dsRNA vào trong C. elegans đã dẫn đến sự bất hoạt trình tự gene đặc hiệu và
tạo ra thuật ngữ “iRNA – Can thiệp RNA” (Fire và ctv, 1998).
Nghiên cứu quá trình bất hoạt gene hậu phiên mã (PTGS) ở thực vật được
báo cáo bởi Hamilton và Baulcombe (Hamilton và Baulcombe, 1999).
Phát hiện hiện tượng PTGS ở cây trồng và khả năng kháng virus được gây ra
bởi dsRNA. Hiện tượng bất hoạt gene sau dịch mã trong cây có tương quan với
phân tử RNA nhỏ (mỗi phân tử có chiều dài khoảng 21–25 nucleotide). Trong quần
thể các phân tử RNA nhỏ có cả các trình tự sense RNA và antisense RNA
(Hamilton và Baucombe, 1999).
Quá trình xử lý dsRNA mạch dài thành những đoạn ngắn 21–23 nucleotide
là nhờ enzyme Dicer RNase III ở ruồi giấm Drosophila (Zamore và ctv, 2000).
Lần đầu tiên mô tả iRNA trên tế bào động vật có vú (Tuschl và ctv, 2001).
Nghiên cứu những đoạn RNA ngắn có cấu trúc kẹp tóc (shRNAs) là nguyên
nhân gây ra sự bất hoạt trình tự đặc hiệu ở những tế bào động vật có vú (Paddison
và ctv, 2003; Sui và ctv, 2003; Paul và ctv, 2003).
Bài báo cáo đầu tiên cho rằng những đoạn iRNA nhỏ được sử dụng trong
chữa bệnh ở động vật có vú (Song và ctv, 2003).
Những đoạn iRNA nhỏ có khả năng bất hoạt gene ở mức độ phiên mã thông
qua methyl hóa DNA de novo ở người (Kawasaki, Taira và ctv, 2004).

10
iRNA kiểm soát hoạt hóa gene ở giai đoạn phiên mã (TGS – transcriptional
gene silencing), các phân tử siRNA ngăn cản phiên mã khống chế số lượng phân tử
mRNA. Cơ chế này xảy ra trong nhân tế bào và mục tiêu tác động là DNA (Matzke
và ctv, 2004; Huettel và ctv, 2007).
Ở tế bào sinh vật nhân thực, iRNA là một bộ máy sinh hóa quan trọng đóng
vai trò điều hòa hoạt hóa gene và bảo vệ cơ thể (Hannon, 2002; Mello và ctv, 2004;
Meister và Tuschl, 2004; Hammond, 2005).
Giải thưởng Nobel trong sinh học và y học trong việc khám phá cơ chế
iRNA (Andrew Fire và Craig Mello, 2006).
Nghiên cứu những đoạn dsRNA nhỏ tạo ra sự hoạt hóa gene phiên mã “hoạt
hóa RNA” (Li và ctv, 2006).
Chứng minh được siRNA giúp con người có thể sản xuất một gene đặc hiệu
làm giảm lượng mRNA và protein nhờ cơ chế hoạt động của iRNA (Davis và cộng
sự, 2010).
2.3.3. Cơ chế bất hoạt gene của iRNA.
Nghiên cứu hóa sinh iRNA ở ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) đã
được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21–23 nucleotide (Tuschl và ctv,
1999). Họ cho rằng các phân tử dsRNA ngắn (siRNA–small interfering RNA) đóng
vai trò phân hủy mRNA. Sau đó, nhóm Fire và Mello; Parrish và cộng sự đã xác
minh rằng dsRNA dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn khoảng 25 nucleotide và
tiếp theo siRNA gây ra sự phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA
(Fire, Mello và ctv, 2000).
 Cơ chế bất hoạt gene được mô tả như sau:
RNA sợi kép (dsRNA) bị cắt thành những mảnh nhỏ (siRNA) bởi một
endonuclease gọi dicer. Sau đó, sợi kép ngắn lại được mở xoắn để tạo ra 2 sợi đơn
ngắn và 1 trong 2 sợi đó là sợi antisense (sợi đối nghĩa). Sợi antisense ngắn
(siRNA) được nạp vào phức hợp RISC. Sau đó, phức hợp RISC có gắn antisense
RNA này bắt cặp với mRNA bằng liên kết tương đồng giữ các base. Phần dư ra của
sợi mRNA sẽ bị RISC phân cắt. Điều này có nghĩa sợi mRNA thông tin bị phân hủy

11
và kết quả là protein được dịch mã từ mRNA này không được tổng hợp. Quá trình
dịch mã gene bị bất hoạt.
Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của iRNA [68].
A. Trong tế bào, quá trình sao chép nội sinh và ngoại sinh mở đầu cho hoạt
động của những sợi dsRNA dài, chúng được xem như là một chất kích hoạt quá
trình can thiệp RNA (iRNA).
B. Đây là quá trình đầu tiên mà dsRNA được xử lý dưới tác dụng của
enzyme RNase III và ATP.
C. dsRNA dài bị cắt thành những đoạn siRNA có kích thước 21–23
nucleotide với 2 nucleotide nhô ra ở đầu 3’. siRNA cũng có thể được tổng hợp bên

12
ngoài tế bào và sau đó được đưa vào trong tế bào nhờ quá trình lây nhiễm hoặc
xung điện.
D. siRNA kết hợp với phức hợp phản ứng lại kích thích iRNA (RISC). Phức
hợp này chứa thành phần chính là Agronaute (Argo), Ago gắn vào siRNA, tách và
loại bỏ sợi sense của siRNA để RISC hoạt động.
E và F. Còn lại là sợi antisense của siRNA mạch kép, được xem là sợi chỉ
dẫn, hướng dẫn RISC bám vào và bắt cặp với mRNA có trình tự tương đồng với
nó, phân hủy mRNA đích. Kết quả là không có mRNA cho quá trình giải mã tổng
hợp protein hay hormon của gene đó.
2.3.4. Vai trò của iRNA.
iRNA kìm hãm tổng hợp protein và điều hòa sự phát triển của cơ thể sinh
vật. Hiện nay đã phát hiện khoảng 500 gene ở người và động vật có vú tổng hợp
khoảng 500 phân tử miRNA khác nhau có chiều dài khoảng 21 nucleotide và
khoảng 30% tổng số gene được điều khiển bởi các phân tử miRNA (Ajit, 2007).
iRNA là cơ chế bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm của virus. Các công trình
nghiên cứu công bố năm 1997 cho thấy cây trồng có hàng rào bảo vệ hiệu quả
chống lại sự xâm nhiễm của virus dựa trên cơ chế PTGS (Covey và ctv, 1997;
Ratcliff và ctv, 1997). Bộ máy dsRNA có thể nhận biết được RNA của virus xâm
nhập và ngăn chặn RNA virus bằng cách phân hủy RNA virus, nhận biết sự xâm
nhập của sinh vật ký sinh, tạo ra các phản ứng gây bất hoạt gene ban đầu và sau đó
khuếch đại phản ứng để loại bỏ hoàn toàn các nhân tố bên ngoài xâm nhập.
iRNA bảo đảm sự bền vững của genome thông qua sự bất hoạt gene nhảy
(Fire, Melo và ctv, 1998). Các gene nhảy gây ra rất nhiều các đột biến bất lợi trong
cơ thể sống. Trong vùng chứa gene nhảy của genome, cả hai sợi DNA được sao
chép, dsRNA được tạo thành và dẫn đến quá trình iRNA loại bỏ những sản phẩm
không mong muốn từ gene nhảy. Những phần tử dsRNA ngắn tác động trực tiếp lên
sợi nhiễm sắc và ngăn chặn sự dịch mã (Tabara và ctv, 1999). Cơ chế bất hoạt gene
iRNA tạo nên hệ thống miễn dịch của genome (Plasterk, 2002).

13
2.3.5. Các nghiên cứu ứng dụng của iRNA trong nuôi trồng thủy sản.
Can thiệp RNA (iRNA) là một hiện tượng bất hoạt đặc hiệu của gene trong
các sinh vật đa bào gồm Drodophia, Caenorhabditis elegans, động vật có vú và ký
sinh… Công nghệ iRNA là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả về chức năng
gene trên động vật thủy sản, điển hình trên cá ngựa vằn Danio rerio,…[71]
iRNA đã được nghiên cứu trên luân trùng Brachionus plicatilis nhằm tăng
cường khả năng đánh giá những tính năng di truyền đặc biệt quan trọng ảnh hưởng
đến vòng đời của chúng (Snell và ctv, 2010).
Cơ chế của iRNA là làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức năng này của nó
trong tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại sự nhiễm trùng virus ở đa số loài. Kết quả
là làm bất hoạt gene của Dicer–1 của virus trong tôm sú (Penaeus mondon) làm
tăng tỷ lệ chết của virus, cơ chế iRNA hoạt động mạnh mẽ và có chức năng miễn
dịch tốt trên tôm (Su, Oanh, Lyons và ctv, 2008). Mức cao hơn là các Dicer ở tế bào
bạch cầu nó đóng vai trò làm miễn dịch tự nhiên ở trong tôm (Zhang, Song, Zhao và
ctv, 2010).
Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer–2 bao gồm miễn dịch
không đặc hiệu chống lại virus (Chen, Jia, Zhao và ctv, 2011). Dicer–2 góp phần
vào chức năng miễn dịch không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của
iRNA (Kim, Behlke và ctv, 2005).
Ứng dụng siRNA trong nghiên cứu ức chế TFV (tiger frog virus) trong tế
bào cá, cung cấp tiềm năng trong điều trị bệnh do virus trong nuôi trồng thủy sản
(Junfeng Xie và ctv, 2004). iRNA còn được nghiên cứu để bất hoạt gene của virus
gây bệnh đốm trắng (WSD–white spot disease) ở tôm biển (Krishn và ctv, 2009).
iRNA đặc hiệu (21bp) được ứng dụng để ức chế gene mã hóa protein vỏ (VP28)
của virus WSSV trong cơ thể tôm Penaeus japonicas.
Làm bất hoạt gene đích và có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại
virus đốm trắng (WSSV) hoặc virus Taura ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương
(Penaeus vannamei) bằng cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc
protein của virus. Sử dụng dsRNAs tác động vào gene mục tiêu của virus đầu vàng

14
(YHV) sẽ thu được hiệu quả miễn dịch đặc hiệu giống như ở virus trên tôm sú
Penaeus monodon (Vincent, Breland và Lotz, 2004).
dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết các quá trình phiên mã gene, làm bất
hoạt gene. Chức năng của gene có thể được nghiên cứu trong các sinh vật dưới
nước bằng cách sử dụng iRNA. Kỹ thuật iRNA đã được ứng dụng trong 2 sinh vật ở
dưới nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti)
Đại Tây Dương. Kết quả đã chứng minh iRNA được sử dụng như là công cụ để
nghiên cứu chức năng sinh học của các gene có liên quan đến sự phát triển của cá
ngựa vằn Danio rerio. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu ích của
dsRNA trong cơ thể tôm trưởng thành. Hơn nữa, khả năng dsRNA ức chế chức
năng của hormon hyperglycemic (CHH) trong tôm Đại Tây Dương cũng đã được
nghiên cứu (Estrada và ctv, 2007).
Ảnh hưởng iRNA trong tôm được giải thích bằng các thí nghiệm in vivo
bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonad inhibiting
hormon (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis. dsRNA làm giảm sự biểu hiện của
GIH (Guan, Mark, Chan và ctv, 2004).
Công nghệ iRNA đã được nghiên cứu trên động vật thân mềm hai mảnh, nó
quyết định chức năng của gene ở sò Crassostrea gigas. Việc tiêm dsRNA tương
ứng với gene Oyster vasa–like gene (Oyvlg) vào trong tuyến sinh dục sẽ làm ức chế
quá trình giảm phân và làm bất hoạt sự sản sinh các tế bào phôi ở sò Crassostrea
gigas (Fabioux và ctv, 2009).
iRNA có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo cơ ở các tua khác nhau trên loài bạch
tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi và ctv, 2004).
Nghiên cứu tiêm dsRNA vào tôm Macrobrachium rosenbergii ngăn cản sự
phát triển đặc điểm sinh dục thứ phát “gai phụ sinh dục đực” và giảm thông số tăng
trưởng vốn thể hiện mạnh ở con đực (Ventura, 2009).

15
2.3.6. Phương pháp chuyển dsRNA, shRNA, siRNA vào trong tế bào.
2.3.6.1. Phương pháp chuyển không cần virus.
Phương pháp này sử dụng những siRNA bình thường và siRNA biến đổi bằng
phương pháp hóa học, được sao chép trong môi trường in vitro. siRNA, shRNA,
dsRNA được biểu hiện bởi plasmid đóng vai trò là vector. Chuyển bằng cách sử
dụng liposome, lipid, protein–antibody, peptide … Các cách trên được phân ra
thành hai dạng: hệ thống và cục bộ (Aigner, 2007).
Những phương pháp chuyển cục bộ chỉ cần một lượng nhỏ siRNA để tránh
việc chuyển nhầm đến những bộ phận khác và giảm thất thoát do sự bài tiết của
thận.
Phương pháp chuyển hệ thống có thể thực hiện nhiều cách như gắn siRNA vào
liposome, lipoplexe, và cationic lipid, tiêm siRNA, xung điện (Aigner, 2007).
Cũng có thể chuyển siRNA hay dsRNA vào vật chủ bằng phương pháp ngâm
như trứng của loài Drosophila melanogaster hấp thu được siRNA/dsRNA trong
những giai đoạn phát triển sớm (Tabara và ctv, 1998; Timmons và ctv, 1998).
2.3.6.2. Phương pháp chuyển bằng plasmid.
Chuyển shRNA hay siRNA vào trong plasmid, khi đó, plasmid này sẽ mã
hóa shRNA, siRNA với hai mạch sense và antisense riêng biệt, có thể biểu hiện
dưới sự kiểm soát của promoter được chọn.
Promoter có thể là RNA polymerase II (pol–II)–dependent hay RNA
polymerase III (pol–III)–dependent.
U6 là Pol–III promoter được biểu hiện trong hầu hết các tế bào. Quá trình
sao chép của nó bắt đầu tại chính xác một điểm và kết thúc tại nucleotide uredine.
Một chuỗi nhiều hơn bốn thymidine cũng có thể được xem như là điểm kết thúc.
Việc này rất có lợi trong việc biểu hiện những đoạn gene ngắn như shRNA nhằm
tránh những nucleotide không mong muốn tại điểm kết thúc.
Pol–II promoter có nhiều ưu điểm trong việc biểu hiện shRNA. Những
promoter này có thuận lợi trong việc điều chỉnh sự bất hoạt RNA một cách nhất
thời, tùy thuộc vào tính chất của chúng. Những promoter hoạt hóa như tetracycline

16
promoter và metallothionine promoter được sử dụng để hoạt hóa và kiểm soát quá
trình iRNA nhưng những sản phẩm của pol–II promoter không kết thúc tại vị trí
chính xác. Vì vậy, những mạch sao chép sẽ có nhiều nucleotide dư thừa tại điểm kết
thúc. Chúng có thể can thiệp vào quá trình hoạt hóa đoạn RNA đích. Những đoạn
dư thừa này có thể làm cho quá trình iRNA không nhận biết được đoạn gene mục
tiêu.
Do tác dụng phụ gây độc khi siRNA/shRNA bị biểu hiện quá mức nên
promoter phải được lựa chọn cẩn thận dựa vào chiều dài của chúng để tránh tác
dụng gây độc.
Peng và cộng sự đã phát triển một hệ thống kết hợp những thuận lợi của của
hai phương pháp trên (sự chính xác của của T7 RNA polymerase và điều chỉnh sự
biểu hiện bằng pol–II promoter). Họ tạo ra một plasmid cấu trúc có thể biểu hiện
shRNA bằng T7–RNA polymerase promoter và pol–II promoter kiểm soát sự biểu
hiện của T7–RNA polymerase, nên T7 RNA polymerase có thể được điều chỉnh bởi
pol–II promoter. Kết quả là shRNA được chỉnh sửa biểu hiện trong tế bào. Một
trong những nhược điểm của quá trình này là hiệu quả của phương pháp chuyển có
sự khác biệt giữa những tế bào và các điều kiện thí nghiệm khác nhau (Singh và ctv,
2009).
Quá trình iRNA có thể thực hiện bằng cách chuyển dsRNAs vào vi khuẩn. Vi
khuẩn có thể biểu hiện dsRNA dưới sự kiểm soát của T7 RNA polymerase
promoter. Khi tế bào chủ hay sinh vật hấp thụ chúng, dsRNA được biểu hiện trong
vi khuẩn có thể kích hoạt quá trình iRNA trong từng tế bào chủ hay sinh vật tương
ứng (Singh và ctv, 2009).
2.3.6.3. Phương pháp chuyển nhờ virus.
Thế mạnh của việc chuyển siRNA/shRNA bằng virus là có thể chuyển vào
những tế bào mà khó bị nhiễm bởi những phương pháp khác và ngay cả những tế
bào không phân chia. Vector của virus tải nạp vào tế bào một cách tự nhiên và hiệu
quả cao hơn so với cảm nhiễm hay bất kì những cách chuyển không dùng virus.
Những virus vector được sử dụng phổ biến nhất để chuyển shRNA bao gồm:

17
Adenovirus, Adeno Associated Virus (AAV), Lentivirus, Retrovirus, Herpes và
Baculovirus vector (Singh và ctv, 2009).

18
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Thời gian thực hiện từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng 07 năm
2012.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản 2, 116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đa Kao, quận 1, thành phố Hồ
Chí Minh.
3.2. Vật liệu.
3.2.1. Vật liệu sinh học.
Tôm càng xanh trưởng thành khoảng 18–30 g: 2 con đực và 2 con cái, mục
đích tách chiết tuyến đực để thu RNA. Địa điểm thu mẫu: Cái Bè (Tiền Giang).
Tôm PL25: 60 con sử dụng cho thí nghiệm tiêm sợi dsRNA, thu ở Cái Bè
(Tiền Giang).
Chủng E.coli JM 109 khả nạp được thương mại hóa (Promega).
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm.
3.2.2.1. Primer.
Bảng 3.1. Trình tự của các primer trong nghiên cứu.
Thứ
tự
Primer
Sequence primer
Forward (5’3’) Reverse(5’3’)
1 Mr–IAG
TCCCGTCCCTGTCCTATAC
TTG
CGGTGATTTGACTTTGAGCAT
C
3
Mr–IAG
Sense
T7PATGGGATACTGGAATG
CCGG
CTGGAACTGCAGGTGTTAAG
4
Mr–IAG
Antisense
ATGGGATACTGGAATGCC
GAG
T7PCTGGAACTGCAGGTGTTA
ACG
3.2.2.2. Hóa chất dùng trong ly trích RNA tổng số.
 Trizol (phenol pH8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate).

19
 Chloroform.
 Isopropanol lạnh (bảo quản ở –250
C).
 Ethanol 70% lạnh (bảo quản ở –250
C).
 Nước DEPC (nước khử RNase).
3.2.2.3. Hóa chất dùng trong phản ứng RT–PCR, PCR.
 Buffer 5X.
 dNTP 10mM.
 MgCl2 25mM.
 Primer F 100pmol/µl.
 Primer R 100pmol/µl.
 Flexi Taq 5U/µl.
 AMV 10U/µl.
 Nước.
3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di agarose.
 Agarose (Bio basic).
 Dung dịch TBE 0,5X.
 Gel red.
 6X DNA Loading Dye (Promega).
3.2.2.5. Hóa chất dùng trong tổng hợp Mr–IAG dsRNA.
 5X colorless buffer.
 dNTP 10 mM.
 MgCl2 25 mM.
 Flexi Taq 5 U/ μl.
 Nuclease free water.
 Nước DEPC.
 RNase A: phân hủy RNA mạch đơn.
 RNase III: phân hủy RNA mạch đôi.
 DNase: phân hủy DNA.
 Primer Mr–IAG sense (T7P) forward và reverse.

20
 T7 enzyme mix.
 10X T7 Reaction Buffer.
 TURBO DNase.
 RNA nồng độ 10 ng/ μl.
 RiboMAXTM
Express T7 2X Buffer.
 Enzyme Mix T7 Express.
3.2.3. Dụng cụ – thiết bị thí nghiệm.
 Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml.
 Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow).
 Micropipet các loại (Bio – rad).
 Đầu tip các loại.
 Bộ dụng cụ vi phẩu.
 Máy ly tâm lạnh.
 Máy luân nhiệt (Bio – rad).
 Máy điện di (Bio – rad).
 Máy chụp ảnh điện di DNA – RNA (Bio – rad).
 Lò vi sóng (Electrolux – Thụy Điển).
 Tủ mát, tủ âm (–250
C, –800
C) (Sanyo – Nhật).

21
3.3. Phương pháp nghiên cứu.
Tổng hợp cDNA mạch khuông của gene M.rosenbergii insulin–like androgeneic
gland (Mr–IAG)
Trizol
RT–PCR
RT–PCR
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu.
Tổng hợp cDNA mạch khuôn cho gene Macrobrachium
rosenbergii insulin–like androgen gland (Mr–IAG).
Tổng hợp Mr–IAG dsRNA bằng phương pháp in vitro.
Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tôm PL25.
Tôm càng xanh đực trưởng thành (18–30) g
Tách chiết RNA tổng số
Kiểm tra sản phẩm có kích thước 163 bp
Phương pháp 2 bước Phương pháp 1 bước
Nồng độ 5 µg Mr–IAG dsRNA/g
Dòng hóa và giải trình tự cDNA
Dòng hóa sản phẩm PCR
Giải trình tự 2 chiều cDNA
cDNA mạch khuôn

22
3.3.1. Tổng hợp cDNA mạch khuôn cho gene Macrobrachium rosenbergii
insulin–like androgene gland (Mr–IAG).
3.3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ tuyến đực của tôm càng xanh.
RNA được tách chiết từ tuyến đực bằng phương pháp tách chiết phenol –
chloroform (Trizol – Invitrogene, California, Mĩ).
Hình 3.2. Sơ đồ tách chiết RNA tổng số từ tuyến đực tôm càng xanh bằng Trizol –
phenol.
Phần gốc chân bò số 5 (150–200 mg)
1 ml Trizol, vortex, ủ 5 phút
Loại bỏ dịch nổi, thêm 1 ml ethanol 70%,
vortex
200 µl Chloroform, vortex, ủ 3 phút
Làm tan cặn RNA trong 100 µl nước
DEPC
Loại bỏ dịch nổi, làm khô cặn RNA bằng block nhiệt ở 550
C
Ly tâm 7500 vòng/phút trong 5 phút, ở 40
C
Ly tâm 12000/phút trong 15 phút, ở 40
C
Thu hết dịch nổi
Thêm isopropanol lạnh (–200
C)
Ủ ít nhất 10 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40
C
Bảo quản –250
C
Tôm đực/cái trưởng thành (khoảng 30 g)

23
 Tiến hành.
Mẫu: 2 con tôm đực và 2 con tôm cái trưởng thành có trọng lượng khoảng 30
g. Tiến hành vi phẩu lấy tuyến đực – gốc chân bò số 5 hoặc có thể cắt lấy phần mô
– khu vực tương đương ở con cái, cho vào 2 eppendorf sạch 1,5 ml, đánh dấu
eppendorf chứa mẫu tôm đực và tôm cái.
Tiến hành ly trích RNA: dùng micropipette loại 100 – 1000 µl, hút 1000 µl
trizol cho vào mỗi eppendorf đã chứa mẫu, tiến hành vortex, ủ ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút. Khi đó, trizol sẽ được hòa trộn trong mẫu giúp phá vỡ màng tế bào.
Sau đó, tiếp tục thêm vào 200 µl chloroform giúp tạo micel phân tán và tiếp xúc đều
với dung dịch chất tẩy rửa tăng hiệu quả biến tính protein, đem vortex mạnh trong
20 giây để tách rời các thành phần, rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Đem
các eppendorf này đi ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, ở 40
C. Sau
ly tâm, hỗn hợp sẽ tách thành 3 pha: lớp dưới cùng có màu đỏ gồm phenol–
chloroform, lớp giữa là lớp hữu cơ và lớp dung dịch không màu chứa RNA ở trên
cùng. Ly tâm xong tiến hành thu hết dịch nổi (khoảng 500 µl) cho vào eppendorf
1,5 ml khác. Tiếp tục cho 500µl isopropanol lạnh vào các eppendorf chứa dịch nổi
vừa thu được, đảo nhẹ 6 – 7 lần. Sau đó, đem các eppendorf này đi ủ ở nhiệt độ
phòng ít nhất 10 phút. Tiến hành ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40
C. Sau
khi ly tâm, tiến hành loại bỏ dịch nổi và hòa tan cặn lóng RNA bằng 1 ml ethanol
70% lạnh, rửa loại muối và isopropanol. Đem các eppendorf này đi vortex, sau đó
tiếp tục ly tâm 7500 vòng trong 5 phút. Sau ly tâm, cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm
khô cặn RNA bằng cách đun trên block nhiệt 550
C khoảng 5 – 10 phút. Cuối cùng,
thêm 100 µl nước cất 2 lần vào mỗi eppendorf và đem bảo quản ở –250
C.
3.3.1.2. Kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số bằng cặp mồi đặc hiệu Mr–IAG
khuếch đại cho sản phẩm 163 bp.
Sau khi tách chiết RNA tổng số, tiến hành chạy RT–PCR với cặp mồi đặc hiệu
cho tuyến đực Mr – IAG khuếch đại đoạn sản phẩm 163 bp. Nếu vật liệu mẫu chứa
sản phẩm có kích thước 163 bp thí chứng tỏ rằng mẫu RNA tổng số tách chiết được

24
có chứa tuyến đực. Mục đích kiểm tra đảm bảo chất lượng mẫu vật liệu trước khi sử
dụng để thực hiện các bước tiếp theo.
 Chu trình luân nhiệt.
∞
Hình 3.3. Chu trình luân nhiệt của RT–PCR với cặp mồi đặc hiệu Mr–IAG khuếch
đại sản phẩm 163 bp.
 Tiến hành.
Hút 2 µl dịch ly trích RNA vào ống chứa sẵn 48 µl hỗn hợp phản ứng (Bảng
3.2).
Bảng 3.2. Thành phần mix cho phản ứng RT–PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Mr–
IAG.
Thứ tự Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)
1 Buffer 10X 10 µl
2 dNTP 10 mM 1 µl
3 MgCl2 25 mM 4 µl
4 Mr–IAG F 50 pmol/µl 1 µl
5 Mr–IAG R 50 pmol/µl 1 µl
6 Go Taq 5 U/µl 0,25 µl
7 AMV 10 U/µl 0,5 µl
8 Nước DEPC 30,25 µl
9 RNA 2 µl
Total 50 µl
550
950
950
450
720
720
40
30’
3’
2’
30’’
45’’
10’
1X 35X 1X

25
3.3.1.3. RT–PCR tổng hợp cDNA mạch khuôn.
 Nguyên tắc của phương pháp tổng hợp cDNA bằng quy trình RT–PCR.
Áp dụng quy trình RT–PCR, sử dụng hóa chất trong bộ hóa chất thương mại
của hãng Promega. Quy trình RT–PCR gồm 2 bước được thực hiện trong cùng 1
eppendorf 0,2 ml bằng máy luân nhiệt iCycle (BioRad).
Bước 1 Reverse Transcriptase (RT): RNA được phiên mã ngược thành
cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược AMV Reverse. Enzyme hoạt động ở 45o
C
trong 30 phút với mồi reverse Mr–IAG sense (T7P). Tất cả các trình tự RNA của
Mr–IAG trong mẫu sẽ được phiên mã ngược thành cDNA.
Bước 2 PCR: Nguyên tắc giống phản ứng PCR thông thường, cDNA
được khuếch đại thành hàng triệu bản sao nhờ Flexi Taq DNA polymerase. Cặp mồi
phát hiện đặc hiệu trình tự nucleotide của Mr–IAG là Mr–IAG sense forward and
reverse. Kết thúc phản ứng RT–PCR sản phẩm thu được là đoạn trình tự nucleic
acid của Mr–IAG dài khoảng 550 bp.
 Chu kỳ luân nhiệt.
Hình 3.4. Chu trình luân nhiệt của RT–PCR với cặp mồi Mr–IAG khuếch đại sản
phẩm 518 bp.
 Tiến hành.
Hút 2 µl dịch ly trích RNA vào ống chứa sẵn 48 µl hỗn hợp phản ứng (Bảng
3.3). Đối chứng âm chỉ có hỗn hợp phản ứng.
∞
570
950
950
450
720
720
40
30’
3’
2’
30’’
1’
10’
1X 35X 1X

26
Bảng 3.3. Thành phần mix cho phản ứng RT–PCR sử dụng cặp mồi Mr–IAG sense.
1 Buffer 5X 10 µl
2 dNTP 10 mM 1 µl
3 MgCl2 25 mM 3 µl
4 Mr–IAG sense (T7P) F 50 pmol/µl 0,5 µl
5 Mr–IAG sense R 50 pmol/µl 0,5 µl
6 Flexi Taq 5 U/µl 0,25 µl
7 AMV 10 U/µl 0,5 µl
8 Nước DEPC 32,25 µl
9 RNA 2 µl
Total 50 µl
3.3.1.4. Tinh sạch cDNA mạch khuôn.
Sau khi có kết quả chạy điện di trên gel agarose 1,5%, phần gel chứa cDNA
template sẽ được cắt ra và tinh sạch bằng Wizard® SV Gel and PCR Clean–Up
System Kit (Promega, Mĩ).
 Tiến hành.
Cho phần gel bị cắt vào 1 eppendorf 1,5 ml sạch và được hòa tan hoàn toàn
bằng dung dịch Membrane binding solution (cứ 1 mg tương đương 1 µl dung dịch),
đun ở 65o
C trong 10 phút. Sau đó phần dung dịch được chuyển vào ống SV mini–
column và để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút,
loại bỏ phần dịch bên dưới ống SV. Cho 700 µl Membrane wash solution vào ống
SV để rửa DNA, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút và tiếp tục đổ bỏ phần dịch
bên dưới ống. Sau đó, cho thêm 500 µl Membrane wash solution vào ống SV, tiếp
tục ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút để rữa DNA một lần nữa. Đổ bỏ phần dịch
bên dưới ống và ly tâm tiếp 14.000 vòng/phút trong 1 phút để bay hơi hết

27
Membrane wash solution. Sau đó cẩn thận chuyển ống SV mini–column vào một
eppendorf 1,5 ml vô trùng. Cho 50 µl nuclease–free water vào trực tiếp chính giữa
màng lọc của cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút
để thu DNA. Bỏ ống SV mimi–column và bảo quản DNA trong eppendorf ở –20o
C.
3.3.2. Dòng hóa và giải trình tự cDNA.
 Nguyên tắc.
Một lượng cDNA sau khi tinh sạch sẽ được nối với vector pGEM–T Easy và
chuyển vào E.coli JM109. Giải trình tự 2 chiều của đoạn cDNA được dòng hóa sau
khi vector được tinh sạch và kiểm tra kết quả trên Genebank.
3.3.2.1. Chuyển sản phẩm PCR vào plasmid pGEM–T Easy.
Tạo vector tái tổ hợp (pGEM–T chứa sản phẩm PCR). Thành phần phản ứng
nối được mô tả theo bảng sau.
Bảng 3.4. Thành phần mix của phản ứng nối sản phẩm PCR vào plasmid pGEM–T
Easy.
Số thứ tự Thành phần Thể tích
1 cDNA tinh sạch 4 µl
2 pGEMT Easy 2 µl
3 T4 ligase Buffer 10X 1 µl
4 T4 DNA ligase 0,5 µl
5 Nước 2,5 µl
Total 10 µl
3.3.2.2. Chuyển vector pGEM–T Easy mang sản phẩm PCR vào tế bào vi khuẩn khả
nạp E.coli JM 109.
Sử dụng phương pháp hóa biến nạp.
 Nguyên tắc.
Dựa sự lõng lẻo của màng tế bào khả nạp JM 109 khi bị xử lý với dung dịch
CaCl2 cùng sự thay đổi nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt) sẽ tạo điều kiện cho đoạn

28
vector pGEM–T Easy chứa đoạn trình tự Mr–IAG di chuyển vào trong tế bào chất.
Sau khi được phục hồi, vector mang gene được nhân lên cùng sự phân chia của tế
bào vi khuẩn.
 Tiến hành.
 Lấy tế bào khả nạp E.coli JM 109 ra khỏi tủ –800
C, ủ đá 10 – 20 phút để rã
đông từ từ.
 Cho 2 µl vector pGEM–T Easy chứa đoạn trình tự Mr– IAG vào eppendorf
1,5 ml giữ trên đá.
 Hút 50 µl vi khuẩn khả nạp E.coli JM 109 cho vào ống eppendorf chứa
vector tái tổ hợp, búng nhẹ vào thành ống để hòa tan hỗn hợp.
 Giữ hỗn hợp trong đá 20 phút.
 Sốc nhiệt ở 42o
C trong 45 giây. Lập tức đưa ống trở lại đá và giữ yên 2 phút.
 Thêm 950 µl dung dịch Soc medium (bảo quản ở nhiệt độ phòng), trộn đều
để tế bào phục hồi.
 Ủ ống eppendorf chứa hỗn hợp ở 370
C và lắc 280 vòng/ phút trong 90 phút.
 Sau đó, trải hỗn hợp trên môi trường LB thạch chứa kháng sinh Ampicilin
với nồng độ (100 µg/ml). Trải 2 đĩa với thể tích khác nhau (100 µl và 900 µl). Ủ
37o
C qua đêm.
3.3.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E.coli JM 109 mang vector tái tổ hợp.
Một phản ứng PCR được thiết kế nhằm mục đích kiểm tra dòng tế bào E.coli
JM 109 có chứa vector pGEM–T Easy hay không và vector có mang đúng trình tự
Mr– IAG hay không.

29
Hình 3.5. Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi T7 promoter khuếch
đại sản phẩm 518 bp.
 Tiến hành.
Chọn các khuẩn lạc rời mọc to tròn để chạy phản ứng PCR kiểm tra kết quả
vector (đánh số cho từng khuẩn lạc rời).
Phản ứng PCR gồm chứng âm, chứng dương (cDNA mạch khuôn được tổng
hợp ở phần 3.3.1.3) và mẫu vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp. Dùng đầu tip sạch vô
trùng chấm một phần khuẩn lạc cho vào eppendorf chứa sẵn hỗn hợp phản ứng,
đánh số theo đúng thứ tự khuẩn lạc cho vào.
Bảng 3.5. Thành phần mix cho phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vector tái tổ
hợp sử dụng cặp mồi sense.
1
2
3
4
5
6
7
8
Colorless buffer
dNTP
MgCl2
Mr–IAG sense (T7P) F
Mr–IAG sense R
Flexi Taq
Nước DEPC
Khuẩn lạc
5X
10 mM
25 mM
100 pmol/µl
100 pmol/µl
5 U/µl
10 µl
1 µl
3 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
34,75 µl
Total 50 µl
570
940
940
720
720
40
3’
30’’
30’’
1’
10’
1X 35X 1X
∞

30
3.3.2.4. Nhân sinh khối tế bào E.coli JM 109 chứa vector tái tổ hợp mang trình tự
nucleotide của Mr–IAG.
Sau khi ủ qua đêm, các khuẩn lạc mọc được trên môi trường LB thạch chứa
Ampicilin (100 µg/ml) sẽ được kiểm tra bằng PCR. Chọn các khuẩn lạc mang
pGEM–T mang Mr–IAG cho kết quả dương tính với vạch tín hiệu khoảng 550 bp
đem tăng sinh.
Dùng que cấy lấy sinh khối của khuẩn lạc dương tính cấy vào 4 ml môi trường
LB lỏng bổ sung 4 µl Ampicilin (100 µg/ml). Nuôi cấy lắc qua đêm ở 370
C, 24 giờ.
Hút 815 µl dịch vi khuẩn đã nuôi cấy trộn đều với 185 µl glycerol 80%, giữ chủng ở
–80o
C, phần còn lại ly tâm (4.000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4o
C) thu sinh khối
tách vector pGEM–T mang Mr–IAG.
3.3.2.5. Tinh sạch vector tái tổ hợp.
Vector pGEM–T mang Mr–IAG được tinh sạch theo bộ Kit Wizard®Plus SV
Minipreps của Promega.
 Nguyên tắc.
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khả năng phá hủy các liên kết
peptide của protease trong môi trường kiềm và khả năng kết dính của DNA với
màng silica trong môi trường muối có nồng độ thích hợp.
Tiến hành.
Sinh khối vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp được tinh sạch bằng cách:
 Cho 250 µl dung dịch huyền phù cell resuspension solution, hòa tan hoàn
toàn sinh khối để tách rời các tế bào.
 Tiếp tục, cho 250 µl dung dịch cell lysis solution vào, đảo trộn đều 4 lần. Ủ
1–5 phút đến khi dịch tế bào trong suốt, dung dịch này có độ kiềm cao sẽ làm DNA
tách mạch.
 Thêm 10 µl alkalin protease đảo trộn 4 lần, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng để phá
vỡ các liên kết peptide làm vụn các thành phần của tế bào, giải phóng DNA.
 Tiếp đó, cho 350 µl neutralization solution, đảo trộn đều 4 lần ngay sau đó.
Dung dịch này giúp môi trường trung hòa, DNA tái kết cấu sẽ vón cục lại.

31
 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chứa DNA và bỏ phần
vụn tế bào vi khuẩn bị kết tủa dưới đáy eppendorf.
 Hút dịch chuyển sang màng silica trên ống SV, để 1 phút ở nhiệt độ phòng.
 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút, DNA sẽ giữ lại còn các thành phần
khác sẽ đi qua màng, đổ bỏ phần dịch phía dưới.
 Rửa DNA bằng 700 µl dung dịch rửa màng membrane wash solution vào
ống SV. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch phía dưới. Cho 500 µl
membrane wash solution vào ống SV ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ
phần dịch bên dưới ly tâm lại với tốc độ 14000 vòng/ phút trong 1 phút (không cho
thêm dung dịch nào ở bước này).
 Cẩn thận chuyển ống SV mini column vào eppendorf 1,5 ml sạch. Cho 50 µl
nuclease–free water trực tiếp vào giữa column, ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly
tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút để tách rửa DNA ra khỏi màng.
 Bỏ ống SV mini column, bảo quản dịch DNA ở – 200
C.
3.3.2.6. Giải trình tự 2 chiều cDNA.
Sau khi tinh sạch vector pGEM–T Easy mang đoạn trình tự Mr–IAG được giải
trình tự tại công ty Khoa Học Nam Khoa (Việt nam) bằng cặp mồi: Mr–IAG sense
forward và reverse. Phân tích trình tự bằng phần mềm BLAST và so sánh kết quả
trên Genebank.
3.3.3. Tổng hợp Mr–IAG dsRNA bằng phương pháp in vitro.
3.3.3.1. Phương pháp 2 bước.
Đây là phương pháp truyền thống để tồng hợp dsRNA bằng cách lai hai mạch
đơn RNA lại với nhau (Ongvarrasopone và ctv, 2007; Ventura và ctv, 2009).
 Nguyên tắc.
Tổng hợp 2 mạch đơn RNA sense và antisense có mang T7 promoter. Sau đó
lai 2 mạch này lại với nhau thành dsRNA.
 Tiến hành.
 Tổng hợp 2 mạch khuôn cDNA bằng 2 cặp mồi sense và antisense.

32
+ Chuẩn bị 2 ống dung dịch PCR để tổng hợp 1 trình tự cDNA template có
gắn T7 ở cuối đầu forward và 1 trình tự cDNA template gắn T7 ở cuối đầu reverse.
Để khuếch đại đoạn gene mục tiêu có gắn T7 promoter ở cuối mỗi mạch.
Bảng 3.6. Thành phần mix cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi sense.
1
2
3
4
5
6
7
8
Colorless buffer
dNTP
MgCl2
Mr–IAG T7P sense F
Mr–IAG sense R
Flexi Taq
Nước DEPC
pGEM–T mang Mr–
IAG
5X
10 mM
25 mM
100 pmol/µl
100 pmol/µl
5 U/µl
10 µl
1 µl
3 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
32,75 µl
2 µl
Total 50 µl
Bảng 3.7. Thành phần mix cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi antisense.
1
2
3
4
5
6
7
8
Colorless buffer
dNTP
MgCl2
Mr–IAG antisense F
Mr–IAG T7P antisense R
Flexi Taq
Nước DEPC
pGEM–T mang Mr–IAG
5X
10 mM
25 mM
100 pmol/µl
100 pmol/µl
5 U/µl
10 µl
1 µl
3 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
32,75 µl
2 µl
Total 50 µl

33
Giống phần 3.3.2.3.
 Tiến hành.
+ Sau đó tinh sạch sản phẩm PCR (phần 3.3.1.4.) để có được Mr–IAG sense
và antisense dùng làm mạch khuôn.
+ Tổng hợp 2 mạch đơn RNA từ Mr–IAG sense và antisense cho mỗi phản
ứng có thể tích 20 μl như sau:
Bảng 3.8. Thành phần mix cho phản ứng tổng hợp mạch đơn sense và antisense
theo bộ Kit T7 Megascript (Ambion – Mỹ).
Thứ tự Thành phần Thể tích (µl)
1
2
3
4
5
6
7
8
T7 Reaction Buffer
Nuclease–free water
ATP
CTP
UTP
GTP
T7 Enzyme Mix
Mr–IAG cDNA
2 µl
4 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
4 µl
Total 20 µl
Đem ủ ở 37o
C qua đêm khoảng 16 giờ. Cho 1 μl TURBO DNase vào mỗi
phản ứng để loại bỏ cDNA mạch khuôn. Ủ 37o
C trong 15 phút. Thu được các RNA
mạch đơn.
 Lai 2 mạch đơn sense và antisense có gắn T7 promoter để tổng hợp dsRNA
bằng bộ Kit T7 Megascript (Ambion–Mỹ).
Hai mạch đơn RNA được tổng hợp từ Mr–IAG cDNA đều có T7 promoter ở
đầu 3’ của mạch Mr–IAG sense forward và antisense reverse được lai lại với nhau

34
bằng cách đun nóng ở 70o
C trong 10 phút để tổng hợp Mr–IAG dsRNA có T7
promoter ở 2 đầu, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Xử lý Mr–IAG dsRNA
bằng RNase A có nồng độ 10ng/μl để loại bỏ hết những RNA mạch đơn còn sót lại
sau phản ứng lai. Lấy 1 lượng nhỏ Mr–IAG dsRNA chạy điện di trên gel agarose
1,5% để xác định nồng độ. Bảo quản ở –20o
C.
3.3.3.2. Phương pháp 1 bước.
Tổng hợp cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu mạch bằng phản ứng
PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu đều có T7 promoter ở đầu 5’ (Ongvarrasopone và
ctv, 2007).
Nguyên tắc: dsRNA được tổng hợp trực tiếp từ cDNA mạch khuôn mang T7
promoter ở 2 đầu sau phản ứng PCR khuếch đại DNA.
 Tổng hợp Megascript T7 Kit.
 Tiến hành.
Để khuếch đại đoạn mạch khuôn cDNA mang T7 promoter ở 2 đầu, chuẩn bị
2 dung dịch phản ứng PCR cho 1 mẫu tổng hợp và 1 mẫu chứng âm.
Bảng 3.9. Thành phần mix cho phản ứng PCR với cặp mồi T7P.
1
2
3
4
5
6
7
8
Colorless buffer
dNTPs
MgCl2
Mr–IAG T7P sense F
Mr–IAG T7P antisense R
Flexi Taq
Nước DEPC
pGEM–T mang Mr–IAG
5X
10 mM
25 mM
100 pmol/µl
100 pmol/µl
5 U/µl
10 µl
1 µl
3 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
32,75 µl
2 µl
Total 50 µl
Đối với mẫu chứng âm thì không cho pGEM–T mang Mr–IAG vào dung dịch
phản ứng.

35
Chu trình luân nhiệt giống phần 2.3.3.1.
Sau khi quá trình khuếch đại kết thúc, sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch bằng
QIAquick Purification Kit. Sản phẩm tinh sạch được dùng để tổng hợp trực tiếp
dsRNA bằng Megascript T7 Kit (Ventura và ctv, 2009). Quy trình tổng hợp đã đề
cập trên phần 2.3.3.1 nhưng chỉ khác là sản phẩm sau quá trình ủ 16 giờ sẽ là
dsRNA nên không cần thực hiện bước lai.
 Tổng hợp T7 Express RiboMax iRNA system Kit (Promega, Mỹ).
Vào năm 2007, Ongvarrasopone và cộng sự đã đề cập đến việc tổng hợp
dsRNA nồng độ cao bằng cách sử dụng T7 Express RiboMax iRNA system Kit
(Promega, Mỹ).
 Tiến hành.
 Chuẩn bị cDNA mạch khuôn.
Khuếch đại đoạn mạch khuôn cDNA mang T7 promoter ở 2 đầu,
chuẩn bị 2 dung dịch phản ứng PCR cho 1 mẫu tổng hợp và 1 mẫu chứng âm.
Giống phần 3.3.3.2.
 Tổng hợp sợi dsRNA từ cDNA mạch khuôn.
Bảng 3.10. Thành phần mix cho phản ứng để tổng hợp dsRNA theo bộ Kit T7
Express RiboMax iRNA system (Promega, Mỹ).
Thứ tự Thành phần Thể tích (µl)
1
2
3
4
RiboMAXTM
Express T7
2X Buffer
Nuclease–free water
Enzyme mix T7
T7 cDNA template
10 µl
4 μl
2 μl
4 μl
Total 20 µl
Ủ qua đêm trong bể ủ nhiệt 370
C. Sau khoảng 24 giờ lấy ra, cho ống
eppendorf vào heat block 700
C, đun trong 10 phút để lai các mạch ssRNA lại với

36
nhau. Tiếp đó, cho vào tủ lạnh 40
C khoảng 5 phút để làm mát dung dịch. Tiếp tục
cho 1 μl Turbo DNase và 1 μl RNase (10 ng/ μl), ủ 370
C trong 5 phút. Cuối cùng
chuyển ống eppendorf này vào block nhiệt ở 700
C trong 10 phút để bất hoạt
enzyme.
Lấy một lượng nhỏ Mr–IAG dsRNA chạy điện di trên gel agarose 1,5% để xác
định nồng độ.
Bảo quản dsRNA ở –20o
C.
3.3.3.3. So sánh hai phương pháp 1 và 2 bước.
Sau khi tiến hành tổng hợp Mr–IAG dsRNA theo 2 phương pháp khác nhau,
để xác định được phương pháp nào có hiệu suất tổng hợp cao hơn và lựa chọn nó
cho thí nghiệm thực nghiệm, tiến hành so sánh nồng độ Mr–IAG dsRNA tổng hợp
được bằng 2 phương pháp, sau đó đem điện di trên cùng bảng gel.
3.3.4. Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tôm càng xanh PL25.
Tôm PL25 đực, giai đoạn này tôm chỉ có dấu hiệu của con đực mà chưa biệt
hóa hoàn toàn thành con đực (chưa mọc gai sinh dục phụ đực) thì mới được sử dụng
cho thí nghiệm. Tôm sẽ được chuyển từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản
Nước Ngọt Nam Bộ (Cái Bè, Tiền Giang) lên phòng thí nghiệm ướt – web lab của
phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. Trước
khi tiến hành thí nghiệm, toàn bộ tôm sẽ được cắt một chân bơi thứ hai ở bên phải
và chân bơi này sẽ được kiểm tra trên kính hiển vi xem có gai sinh dục phụ đực hay
không để đảm bảo chất lượng và tính chính xác của thí nghiệm. Thí nghiệm sẽ được
tiến hành đồng loạt ở một nồng độ tiêm Mr–IAG dsRNA 5μg dsRNA/g trọng lượng
tôm và một lô đối chứng chỉ tiêm nước muối sinh lý 0,9%. Tôm thí nghiệm PL25
được nuôi trong thùng nhựa có diện tích 0,2 m2
. Tôm được kiểm tra tỷ lệ sống hằng
tuần và tỷ lệ chuyển giới sau một tháng.
Thời điểm thu thập số liệu để báo cáo là sau 60 ngày với 25 lần tiêm (3
lần/tuần). Khoảng cách mỗi lần tiêm là 2 ngày.
Cách tiêm: tiêm Mr–IAG dsRNA vào xoang ở góc chân bò thứ 5 của tôm
(Rosen, Sagi và ctv, 2010). Sử dụng kim tiêm Exmire Microsyringe (Fuji, Japan) có

37
thể tích tối đa là 10µl. Thể tích Mr–IAG dsRNA tùy thuộc vào nồng độ lô thí
nghiệm và trọng lượng của tôm. Đến ngày thứ 60, tất cả tôm được cắt chân bơi thứ
2 ở bên phải đem lên kính hiển vi CH4: OLYPUS (Japan) vật kính 10X để kiểm tra
gai sinh dục phụ đực có mọc lại hay không. Sau đó tính toán tỷ lệ sống và tỷ lệ
chuyển cái của tôm.
Bảng 3.11. Bố trí thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA.
Đây là thí nghiệm nhằm mục đích kiểm tra xem Mr-IAG có ảnh hưởng lên
sự hình thành gai phụ sinh dục đực hay không (có thể nói đây là thí nghiệm “có”
hoặc “không”) nên số lượng tôm ở các lô có thể không bằng nhau.
Lô Thí nghiệm Đối chứng
Số lượng (con) 40 20
Tần suất tiêm (lần/tuần) 3 3
Nồng độ Mr–IAG dsRNA
(µg/g)
5 Nước muối sinh lý 0,9%
Thời gian kiểm tra định kỳ
(ngày)
30 30
Thời gian thí nghiệm
(ngày)
60 60

38
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tổng hợp và kiểm tra trình tự Mr–IAG cDNA mạch khuôn.
4.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ tôm càng xanh.
Sau khi tiến hành tách chiết RNA tổng từ tôm càng xanh đực và cái trưởng
thành thu được kết quả như hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ tôm càng xanh.
Giếng 1: RNA tổng số tách chiết từ tôm càng xanh cái trưởng thành; Giếng 2: RNA
tổng số tách chiết từ tôm càng xanh đực trưởng thành; Giếng 3 (–): đối chứng âm
không chứa mẫu.
Từ kết quả thí nghiệm cho thấy RNA tổng số đều có ở cả 2 giới tôm càng
xanh đực và cái, hay nói cách khác chúng có mặt ở mỗi cá thể.

39
4.1.2. Kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số bằng cặp mồi Mr–IAG khuếch
đại cho sản phẩm 163 bp.
Hình 4.2. Kết quả khuếch đại sản phẩm 163 bp bằng cặp mồi Mr–IAG từ mẫu
RNA tổng số.
Giếng 1 (1): thang; giếng 2 (F): sản phẩm khuếch đại từ RNA tổng số của tôm càng
xanh cái; Giếng 3 (M): sản phẩm khuếch đại từ RNA tổng số của tôm càng xanh
đực; Giếng 4 (–): đối chứng âm.
Từ kết quả điện di cho thấy, sự khác biệt rõ rệt giữa tôm càng xanh đực và
cái. Ở giếng M xuất hiện vạch có kích thước khoảng 163 bp, giếng F không có sản
phẩm. Điều này chứng tỏ ở tôm càng xanh cái không chứa đoạn 163 bp – đoạn gene
đặc hiệu cho tuyến đực và được xem marker quy định tuyến đực. Mẫu tách chiết
RNA tổng số sẽ bị loại bỏ và không được sử dụng trong các thí nghiệm sau. Lí do,
đoạn 518 bp đoạn gen mã hóa cho hormon tuyến đực, chúng nằm trên tuyến đực do
đó nếu mẫu tách chiết RNA tổng không chứa tuyến đực thí sẽ bị loại bỏ.
Ngoài ra, kết quả còn cho thấy rằng vật liệu mẫu sau khi tách RNA tổng số
từ tôm càng xanh đực trưởng thành là đảm bảo chất lượng, chứa đoạn trình tự gene
đặc hiệu cho tuyến đực. Vì vậy, có thể sử dụng mẫu này để tiến hành các thí nghiệm
tiếp theo.

40
4.1.3. Tổng hợp Mr–IAG cDNA mạch khuôn.
Trình tự hoàn chỉnh của Mr–IAG có độ dài 1824 bp (NCBI, GeneBank).
Đoạn cDNA cần tổng hợp mã hóa thành 173 acid amin, có độ dài 518 bp từ
nucleotide 232 đến 750 (Ventura và ctv, 2009). Những vùng dự đoán không có khả
năng dịch mã từ nucleotide 1–233 và 755–1824. Điều này có nghĩa là chỉ có đoạn
trình tự nucleotide từ 232–750 có thể mã hóa thành hormon tuyến đực.
Kiểm tra bằng quy trình RT–PCR, điện di trên gel agarose 1,5%. Dựa vào
kết quả chạy điện di, giếng 1 có xuất hiện 1 vạch, so với thang chuẩn DNA thì vạch
này có kích thước xấp xỉ 550 bp (518 bp của vùng mã hóa và 20 bp của T7
promoter). Như vậy, đoạn Mr–IAG cDNA mã hóa cho hormon tuyến đực được tách
chiết từ tôm càng xanh đực trưởng thành đã tổng hợp thành công.
Hình 4.3. Kết quả chạy điện di cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số tách chiết từ
tôm càng xanh cái và đực.
500 bp

41
Chạy 2 µl mẫu, gel agarose 1,5%, 100V, 45 phút. Giếng 1 (1): cDNA được tổng
hợp từ RNA tổng số của tôm càng xanh đực. Giếng 2 (–): mẫu chứng âm. Giếng 3
(M): thang DNA 50 bp.
4.1.4. Dòng hóa và giải trình tự Mr–IAG cDNA mạch khuôn.
Sau khi tổng hợp cDNA mạch khuôn, tiến hành tinh sạch cDNA dự đoán từ
gel ở mẫu 2, tạo vector tái tổ hợp pGEM–T mang Mr–IAG cDNA. Tiếp đó, chuyển
vector pGEM–T mang Mr–IAG cDNA vào tế bào khả nạp E.coli JM 109, dòng hóa
tế bào E.coli JM 109 đã nhận vector tái tổ hợp.
Kiểm tra lại tế bào đã được dòng hóa trên môi trường LB agar có bổ sung
ampicillin (100 μg/ml).
Kết quả có nhiều khuẩn lạc riêng lẻ mọc trên môi trường, chọn 6 khuẩn lạc
trong số các khuẩn lạc này đánh dấu, chạy phản ứng PCR kiểm tra kết quả vector.
Quá trình kiểm tra các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR
được thể hiện trên hình 4.4.
Hình 4.4. Kiểm tra 6 khóm khuẩn lạc E.coli JM109 nghi ngờ mang trình tự Mr–
IAG cDNA mạch khuôn.
Giếng 1: thang DNA 50 bp. Giếng 3–8: khuẩn lạc được chọn trên môi trường LB
agar/ampicillin. Giếng 2: mẫu đối chứng âm. Giếng 9: mẫu đối chứng dương.
Dựa vào hình 4.4 cho thấy, sản phẩm khuếch đại từ 6 khuẩn lạc (giếng 3–8)
có vạch kích thước ngang với vạch đối chứng dương (khoảng 550 bp). Như vậy

42
chứng tỏ 6 khuẩn lạc được đem kiểm tra có mang trình tự Mr–IAG cDNA mong
muốn.
Chọn 2 khóm khuẩn lạc 1 và 2 (giếng số 3 và 4) chứa trình tự Mr–IAG
cDNA dự đoán nuôi tăng sinh trên môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin để thu
mẫu bảo quản và tinh sạch. Sau khi kiểm tra lại vector tái tổ hợp pGEM–T mang
Mr–IAG cDNA đã tinh sạch bằng phương pháp PCR với cặp mồi Mr–IAG sense
(T7P) forward và reverse, vector tái tổ hợp pGEM–T mang Mr–IAG cDNA được
giải trình tự tại Công Ty Khoa Học Nam Khoa (Việt Nam) và phân tích trình tự
bằng phần mềm BLAST 2.0 và so sánh với trình tự của M. rosenbergii insulin–like
androgeneic gland đã công bố trên Genebank (NCBI). Độ tương đồng đến 99%
(hình 4.5). Có 7 nucleotide không trùng khớp. Nguyên nhân: có thể sai khác về mặt
di truyền (trình tự gene Mr-IAG được công bố trên Genebank có nguồn gốc từ tôm
Macrobrachium rosenbergii của nước ngoài, còn ở Việt Nam do điều kiện khí hậu
môi trường khác nên có thể sai khác ở một số nucleotide); hoặc sự sai khác đó là do
hóa chất (enzyme Taq hoạt động không tốt). Ngoài ra, cũng có thể do sai sót trong
quá trình giải trình tự nhưng nguyên nhân này là rất thấp. Tuy nhiên, chúng không
ảnh hưởng đến trình tự acid amin được mã hóa từ cDNA mạch khuôn do trình tự
acid amine này đã được so sánh với trình tự acid amin được mã hóa từ Mr–IAG
mRNA trên NCBI và nó trùng khớp 100% (hình 4.6). Từ đây có thể sử dụng cDNA
dự đoán để làm mạch khuôn cho quá trình tổng hợp Mr–IAG dsRNA.

44
Hình 4.5. Phần mềm BLAST so sánh trình tự của Mr–IAG cDNA dự đoán với trình
tự của Macrobrachium rosenbergii insulin–like androgeneic gland được công bố
trên NCBI. Query là trình tự của Mr–IAG cDNA, Sbjct là trình tự của
Macrobrachium rosenbergii androgeneic gland specific insulin–like .
Hình 4.6. Phầm mềm BLAST so sánh trình tự amino acid được mã hóa từ Mr–IAG
cDNA mạch khuôn dự đoán với amino acid được mã hóa từ Mr–IAG mRNA được
công bố trên NCBI.
4.2. Tổng hợp Mr–IAG dsRNA theo phương pháp in vitro.
4.2.1. Phương pháp 2 bước.
Mr–IAG dsRNA trong thí nghiệm này sẽ được tạo ra bằng cách lai hai loại
mạch đơn RNA khác nhau (Ventura và ctv, 2009) được tổng hợp từ cDNA mạch
khuôn theo bộ T7 Megascript Kit (Ambion – Mỹ).

45
Hình 4.7. Kiểm tra nồng độ hai mạch đơn sense và antisense RNA và khả năng xử
lý RNA mạch đơn của enzyme RNase.
Giếng 1: thang DNA 50 bp. Giếng 2, 3 và 5, 6: mạch đơn sense và antisense RNA
pha loãng 1:20 và 1:40 bằng nuclease free water. Giếng 4, 7: mạch sense và
antisense RNA ở độ pha loãng 1:20 được xử lý 1 µl enzyme RNase A 10 ng/µl.
Quan sát hình 4.7 ta thấy có nhiều vạch sản phẩm phụ xuất hiện trên gel của
cả 2 mạch sense và antisense RNA. Vấn đề này có thể là do vật liệu dùng làm Mr–
IAG chưa được tinh sạch hoàn toàn. Vì vậy, có nhiều mạch đơn có kích thước ngắn
hơn 550 bp xuất hiện khi dùng bộ Kit T7 Megascript. Kiểm tra nồng độ RNA trên
hình 4.7, nồng độ mạch đơn sense nhiều khoảng gấp 3 lần mạch antisense dựa vào
độ sáng của vạch mẫu và thang DNA. Điều đó chứng tỏ, khi tổng hợp hai mạch đơn
riêng biệt thì hiệu suất tổng hợp mạch sense RNA hiệu quả hơn mạch antisense
RNA. Từ đây liều lượng của hai mạch sense và antisense sẽ được tính toán điều
chỉnh trước khi lai chúng lại với nhau nhằm tiết kiệm hóa chất và giảm bớt nồng độ
sản phẩm phụ. Tuy nhiên, việc xác định nồng độ theo phương pháp này cũng không
hoàn toàn chính xác.
Hiệu suất kiểm tra khả năng xử lý RNA mạch đơn của enzyme RNase A ở
giếng số 4 và 7 cho thấy sản phẩm được tạo ra đúng là RNA mạch đơn.
Kết quả tổng hợp dsRNA bằng Kit T7 Megascript (Ambion – Mỹ).

46
Hình 4.8. Mr–IAG dsRNA sau khi lai sense và antisense RNA và được xử lý
enzyme RNase A.
Giếng 1: Mr–IAG dsRNA không xử lý RNase A ở độ pha loãng 1:20. Giếng 2: Mr–
IAG dsRNA xử lý RNase A ở độ pha loãng 1:20. Giếng 3: thang DNA 50bp. 2µl
Mr–IAG dsRNA cho vào mỗi giếng, gel agarose 1,5%, TBE 0.5X.
Trên hình 4.8, vạch mẫu Mr–IAG dsRNA ở giếng 1 sáng hơn giếng số 2 có
thể do còn nhiều RNA mạch đơn sau phản ứng lai. Mr–IAG dsRNA được xử lý
RNase A ở giếng số 2 chỉ xuất hiện một vạch tại vị trí có kích thước khoảng 550bp
và mờ.
500 bp
200 bp
50 bp

47
4.2.2. Phương pháp 1 bước.
Hình 4.9. Nồng độ Mr–IAG dsRNA được tổng hợp theo phương pháp 1 bước bằng
2 Kit khác nhau.
Giếng 3, 4: sử dụng T7 RiboMax Express IRNA system Kit. Giếng 1: thang DNA
50bp. Giếng 2: Mr–IAG dsRNA không xử lý RNase ở độ pha loãng 1:50. Giếng 3:
Mr–IAG dsRNA không xử lý RNase ở độ pha loãng 1:100. Giếng 4: Mr–IAG
dsRNA xử lý RNase. Giếng 5, 6, 7: sử dụng Megascript T7 Kit. Giếng 5, Mr– IAG
dsRNA không xử lý RNase ở độ pha loãng 1:50. Giếng 6: IAG dsRNA không xử lý
RNase ở độ pha loãng 1:100. Giếng 7: Mr–IAG dsRNA xử lý RNase.
Dựa trên nguyên tắc tổng hợp Mr–IAG trực tiếp từ cDNA mạch khuôn có T7
ở cả 2 đầu mạch. Dựa vào hình 4.9, vạch ở giếng 5 sáng hơn vạch ở giếng 2 nên
hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA trước khi xử lý RNase A bằng T7 Megascript
Kit cao hơn T7 RiboMax iRNA System Kit. Tuy nhiên, sau khi xử lý enzyme
RNase A thì nồng độ Mr–IAG dsRNA được tổng hợp từ T7 RiboMax iRNA
System Kit (giếng 4) lại cao hơn T7 Megascript Kit (giếng 7) cho nên T7 RiboMax
iRNA System Kit sẽ được dùng để tổng hợp Mr–IAG dsRNA theo phương pháp 1
bước.

48
Hình 4.10. Kiểm tra chất lượng RNA mạch đôi (dsRNA).
Giếng 1: chứng âm; Giếng 2: thang DNA; Giếng 3: dsRNA sau khi tổng hợp bằng
nên T7 RiboMax iRNA System Kit; Giếng 4: dsRNA được xử lý bằng DNase;
Giếng 5: xử lý bằng RNase III; Giếng 6: xử lý bằng RNase A.
Sau khi tổng hợp được sợi đôi RNA, tiến hành kiểm tra một lần nữa để đảm
bảo rằng sợi đôi RNA được tổng hợp chính xác là mạch đôi.
Kết quả hình 4.10, cho thấy khi xử lý DNAse – enzyme phân hủy DNA
(giếng 4) hay RNAse A – enzyme phân hủy RNA mạch đơn (giếng 6) đều không
làm ảnh hưởng đến dsRNA được tổng hợp. Riêng ở giếng 5 khi xử lý bằng RNAse
III – enzyme phân hủy RNA mạch đôi thì kết quả là dsRNA bị phân hủy hoàn toàn.
Do đó, giếng 5 không xuất hiện vạch sản phẩm.
Tất cả những điều này cho phép kết luận rằng sản phẩm dsRNA tổng hợp
hoàn toàn là mạch đôi và đủ điều kiện làm vật liệu cho thí nghiệm tiêm dsRNA vào
tôm càng xanh đực PL25.

49
4.2.3. So sánh hai phương pháp 1 và 2 bước.
Kết quả so sánh nồng độ Mr–IAG dsRNA theo phương pháp 1 bước và 2
bước sau khi chạy điện di.
Hình 4.11. So sánh hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA theo phương pháp 1 bước
và 2 bước.
Giếng 1: Mr–IAG dsRNA từ phương pháp 1 bước pha loãng 1:50. Giếng 2: Mr–
IAG dsRNA từ phương pháp 2 bước pha loãng 1:50. Giếng 3: thang DNA 50 bp.
Mỗi giếng cho vào 2µl mẫu, gel agarose 1,5%, 100V, 45 phút, TBE 0,5X.
Dựa vào kết quả hình 4.11, vạch ở giếng 1 sáng và rõ hơn vạch ở giếng 2
chứng tỏ nồng độ Mr–IAG dsRNA được tổng hợp từ phương pháp 1 bước nhiều
hơn so với phương pháp 2 bước. Điều này có thể do bước lai của phương pháp 2
bước không hiệu quả. Phương pháp 1 bước có hiệu quả kinh tế cao hơn do tiết kiệm
được 1 phản ứng trong mỗi lần tổng hợp Mr–IAG dsRNA và bộ T7 RiboMax
Express iRNA System Kit có giá thành thấp hơn nhiều so với T7 Megascript Kit,
đồng thời hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA cũng cao hơn so với phương pháp 2
bước.
500 bp

50
Bảng 4.1. So sánh hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA bằng 2 bộ Kit.
Chỉ tiêu T7 RiboMax Express
IRNA System Kit
T7 Megascript Kit
Số phản ứng 50 40
Nồng độ dsRNA tổng hợp
theo bộ Kit
>5 mg/ml 1,5–3 mg/ml
Nồng độ dsRNA tổng hợp
được từ thực tế
2,5–3 mg/ml 0,5–1 mg/ml
Vì vậy, phương pháp 1 bước là lựa chọn tốt nhất cho việc tổng hợp Mr–IAG
dsRNA.
4.3. Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tôm PL25.
Sau 60 ngày thí nghiệm ta có kết quả số tôm sống và số tôm chuyển cái như
sau.
Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA.
Lô
Thí nghiệm Đối chứng
30 ngày 60 ngày 30 ngày 60 ngày
Nồng độ Mr–
IAG dsRNA
(µg/g)
5 5
Nước muối
sinh lý 0,9 0
/0
Nước muối
sinh lý 0,9 0
/0
Số con sống
(con)
35 31 18 18
Số con chuyển
cái (con)
34 29 0 0

51
Hình 4.12. Tỷ lệ sống của tôm sau 60 ngày tiêm.
Sau 30 ngày thí nghiệm, tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm đạt 87,5% tức có 35
tôm sống trên 40 tôm thí nghiệm. Sau 60 ngày tỷ lệ sống là 77,5% tức 31 tôm sống
trên 40 tôm thí nghiệm. Như vậy, sau 60 ngày thí nghiệm tiêm tổng số tôm chết là 9
con, chiếm 22,5%. Riêng ở lô đối chứng tỷ lệ sống cao hơn đạt 90% hình 4.12. Điều
này có thể do quá trình tiêm làm ảnh hưởng đến sức sống của tôm thí nghiệm.
Ngoài ra, nguyên nhân chết tôm là do không kiểm soát được các điều kiện môi
trường như: vi khuẩn gây bệnh đục thân trên tôm, môi trường nước, kinh nghiệm
nuôi còn hạn chế, quá trình lột xác, tôm ăn nhau …
Tất cả tôm ở các lô thí nghiệm và đối chứng sẽ được cắt chân bơi thứ 2 ở bên
phải xem dưới kính hiển vi để kiểm tra gai sinh dục phụ đực.

52
Hình 4.13. Tác động của Mr–IAG dsRNA lên sự hình thành và phát triển của gai
phụ sinh dục đực ở chân bơi thứ 2 bên phải của tôm càng xanh M. Rosenbergii.
A: chân bơi thứ 2 của tôm đực đối chứng giai đoạn PL25; B: chân bơi thứ 2 của tôm
đực thí nghiệm trước khi tiêm dsRNA; C: chân bơi thứ 2 của tôm đực đối chứng sau
60 ngày; D: chân bơi thứ 2 của tôm thí nghiệm đã chuyển cái; E: chân bơi thứ hai
của tôm thí nghiệm bắt đầu xuất hiện nhú lồi của gai phụ sinh dục đực; D: chân bơi
thứ 2 của tôm thí nghiệm đã xuất hiện rõ gai phụ sinh dục đực. Vị trí mũi tên màu
xanh là gai phụ sinh dục đực.
Từ hình 4.13, cho ta thấy giai đoạn trước thí nghiệm thì chân bơi thứ 2 của
cả tôm thí nghiệm và tôm đối chứng có đặc điểm hình thái giống nhau. Nhưng sau
thời gian thí nghiệm có sự khác biệt rõ rệt giữa tôm đối chứng và tôm thí nghiệm
tiêm Mr–IAG dsRNA: ở thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA thì hầu hết các cá thể đều
không có gai phụ sinh dục đực, chỉ có một vài cá thể có xuất hiện gai phụ sinh dục
D
A
C
B
E F
C

53
đực hoặc xuất hiện nhú lồi sinh dục đực. Riêng tôm đối chứng tất cả tôm đều có gai
phụ sinh dục đực.
Hình 4.14. Tỷ lệ chuyển cái của tôm sau 60 ngày tiêm.
Sau 30 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chuyển cái là 97,1%, tỷ lệ tôm đực chiếm 2,9%
(1 con). Tỷ lệ chuyển cái sau 60 ngày tiêm là 93,5% và tỷ lệ tôm đực là 6,5% (1 con
đực có gai phụ sinh dục đực phát triển rõ và 1 con có dấu hiệu đực, gai phụ sinh dục
đực mới xuất hiện). Ở lô đối chứng tất cả tôm đều là tôm đực. Điều này chứng tỏ
Mr–IAG dsRNA có tác động tích cực đến quá trình ức chế sự hình thành gai phụ
sinh dục đực. Như vậy, sau 60 ngày thí nghiệm có 2 tôm đực và 1 tôm có dấu hiệu
đực. Nguyên nhân có thể do trong quá trình chọn tôm ấu trùng PL25 để tiến hành thí
nghiệm thì lẫn vào tôm quá ngày tuổi nên Mr–IAG dsRNA không còn tác dụng ức
chế gene Mr–IAG của chúng hay trong quá trình tiêm làm thất thoát lượng Mr–IAG
dsRNA hoặc cũng có thể do chưa có kinh nghiệm về kỹ thuật tiêm vì vậy mà tiêm
chưa đúng vị trí nên Mr–IAG dsRNA chưa có tác động ức chế hoặc ức chế không
hoàn toàn các mRNA mã hóa tạo hormon tuyến đực. Từ những số liệu thu thập
được có thể kết luận rằng gene Mr–IAG có ảnh hưởng đến việc mã hóa của
androgeneic gland (AG) specific insulin–like peptides (mRNA) để tạo hormon
tuyến đực cho tôm đực.

54
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Tổng hợp Mr–IAG dsRNA để tạo ra tôm càng xanh cái giả bằng công nghệ
iRNA là mục đích chính của nghiên cứu này. Từ những kết quả thu được thì tổng
hợp Mr–IAG dsRNA bằng T7 RiboMax Express iRNA System Kit theo phương
pháp 1 bước có hiệu quả nhất về mặt chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế. Kết quả
nghiên cứu từ thí nghiệm tiêm dsRNA vào tôm PL25, cho thấy ở nồng độ 5 µg Mr–
IAG dsRNA/g có tác dụng rõ rệt trong việc tạo ra tôm cái giả. Tuy nhiên, cần kéo
dài và mở rộng quy mô nghiên cứu này hơn để xác định chính xác nồng độ và số lần
tiêm để tạo tôm cái giả.
Trong nghiên cứu này tỷ lệ chết là khá cao 22,5%. Do đó, cần tìm ra những
biện pháp khắc phục, khống chế được các yếu tố ngoại cảnh dẫn đến tỷ lệ chết cao ở
tôm như: xây dựng hệ thống sục khí, lưu thông nước, định kỳ vệ sinh dụng cụ nuôi
kiểm soát vi khuẩn gây bệnh. Nâng cao kỹ thuật nuôi, nắm được chu kỳ phát triển
và lột xác của tôm để tránh hiện tượng ăn nhau. Cũng cần nghiên cứu thêm về tần
suất tiêm để giảm bớt số lần tiêm trong tuần nhằm nâng cao sức sống cho tôm…
Kiểm tra lại trình tự Mr–IAG dsRNA sau khi tổng hợp bằng cách giải trình
tự để xác định chính xác trình tự tổng hợp được có phải là Mr–IAG dsRNA hay
không, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm tổng hợp được và tăng hiệu quả bất
hoạt mRNA. Ngoài ra, kỹ thuật tiêm cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình
chuyển đổi giới tính ở tôm.
Nghiên cứu này mở ra một công nghệ mới có thể dùng sản xuất tôm càng
xanh cái giả thay cho phương pháp vi phẫu. Cần nghiên cứu thêm những phương
pháp tổng hợp Mr-IAG dsRNA khác như tổng hợp bên trong tế bào vi khuẩn nhằm
sản xuất Mr-IAG dsRNA với số lượng lớn, tiết kiệm chi phí mà hiệu quả cao.

55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu sách – tạp chí.
Tài liệu tiếng việt.
[1] Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Tuần, Hoàng thị Thủy Tiên, Lâm Quyền, Nguyễn
Đức Minh, Nguyễn Nhứt và Huỳnh Thị Hồng Châu (2004). Kết quả bước
đầu sản xuất giống tôm càng xanh toàn đực, tuyển tập nghề cá Đồng Bằng
Sông Cửu Long. Nhà xuất bản nông nghiệp TP.HCM, trang 159 – 177.
[2] Chung Quang Trí (2006). Thử nghiệm dùng hormon đực ở giáp xác thuộc bộ
mười chân Decapoda để đực hóa hậu ấu trùng tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii de Man. Trường đại học Khoa học Tự Nhiên
TP. HCM.
[3] Đỗ Năng Vịnh (2007). Công nghệ can thiệp RNA (IRNA) gây bất hoạt và tiềm
năng ứng dụng to lớn. Tạp chí công nghệ sinh học 5(3): 265–275.
Tài liệu nước ngoài.
[4] Charniaux–Cotton H. and Payen G. (1985). Sex differentiati. In The biology of
Crustacea. Edited by Bliss D. E. and Mantel L. H. vol. 9, pp. 147–215.
New York: Academic Press.
[5] Cortney, L. Ohs, Louis R. D’Abramo, Lora Petrie–Hanson, Anita M. Kelly
(2006). Apparent control of sexual differentiation of Freshwater Pawn,
Macrobrachium rosenbergii, Through Dietary Administration of Dopamine
Hydrochloride, Journal of Applied Aquaculture, 18: 4, 19 – 32.
[6] Cronin J. et al. (2005). Altering the tropism of lentiviral vectors through
pseudotyping. Curr. Gene Ther. 5, 387–398.
[7] Davis M.E., et al (2010). Evidence of IRNA in humans from systemically
administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 2010 Apr 15;
464(7291):1067–70. Epub 2010 Mar 21.
[8] Eaton B.A. et al. (2002). Dynactin is necessary for synapse stabilization.
Neuron 34, 729–741.

56
[9] Estrada P., Lugo M., Acosta J.l, Carpio Y., Borroto I., Morera Y., Gonzalez
O., Rodriguez T., Ramos L., Huberman A. (2007). Effect of RNA
interference on gene functions of aquatic organisms. Biotecnologia
Aplicada, Vol. 24, No. 2.
[10] Fingerman M. (1997), Role of neurotransmitters in regulating reproductive
hormon release and gonadal maturation in decapods crustaceans,
Invertebrate Reproduction and Development, 31, pp 47– 74.
[11] Galvani A. and Sperling L. (2002). RNA interference by feeding in
Paramecium. Trends Genet, 18, 11–12.
[12] Gao G.P. et al (1996). Biology of adenovirus vectors with E1 and E4 deletions
for liver directed gene therapy. J. Virol. 70, 8934–8943.
[13] Guan, Haoji (2006). Double–stranded RNA induced gene silencing of
neuropeptide genes in sand shrimp, Metapenaeus ensis and development of
crustacean primary cell culture. Trường đại học Hồng Kông.
[14] Guo S. and Kemphues K.J. par–1, a gene required for establishing polarity in
C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically
distributed. Cell. 1995 May 19;81(4):611–20.
[15] Heister T. et al. (2002). Herpes simplex virus type 1/adeno–associated virus
hybrid vectors mediate site–specific integration at the adeno–associated
virus preintegration site, AAVS1, on human chromosome 19. J. Virol. 76,
7163–7173.
[16] Hui J.H.L., Tobe S.S. and Chan S.M. (2008). Characterization of the putative
farnesoic acid O–methyltransferase (LvFAMeT) cDNA from white shrimp,
Litopenaeus vannamei: evidence for its role in molting. Peptides 29: 252–
260.
[17] Hutvagner G. and Zamore P.D. (2002). iRNA: nature abhors a double–strand.
Curr Opin Genetics and Development 12: 225–232.

57
[18] Issa Z. et al. (2005). Development of methods for RNA interference in the sheep
gastrointestinal parasite, Trichostrongylus colubriformis. Int. J. Parasitol.
35, 935–940.
[19] Kafri T. et al. (1997). Sustained expression of genes delivered directly into
liver and muscle by lentiviral vectors. Nat. Genet. 17, 314–317.
[20] Katakura Y. (1989). Endocrin and genetic control of sex differenciation in the
malacostracan Crustacea. Invert. Reprod. Development., 16, 177–182.
[21] Kawasaki H. and Taira K. (2004). Induction of DNA methylation and gene
silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature. 2004 Aug 15.
[22] Kim D.H, Behlke M.A, Rose S.D, Chang M.S, Choi S., Rossi J.J. (2005).
Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance IRNA potency and efficacy. Nat
Biotechnol. 2005 Fed; 23(2):222–6.
[23] King D. S. (1964). Fine structure of the androgeneic gland of the crab,
Pachygrapsus crassipes. General and Comparative Endocrinology, vol. 4,
no. 5, pp. 533–544.
[24] Li et al. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.
Proc Natl Acad Sci USA. (2006). Nov 14;103(46):17337–42. Epub 2006
Nov 3.
[25] Lieber A. et al. (1999). Integrating adenovirus–adeno–associated virus hybrid
vectors devoid of all viral genes. J. Virol. 73, 9314–9324.
[26] Lu L. et al. (2006). Suppression of porcine arterivirus replication by
baculovirus delivered shRNA targeting nucleoprotein. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 340, 1178–1183.
[27] Martin O., Sorokine, Moniatte M., Bulet P., Hetru C., and Dorsselaer A.
(1999). The structure of a glycosylated protein hormon responsible for sex
determination in the isopod, Armadillidium vulgare. European journal of
Biochemistry, vol. 262, no. 3, pp. 727–736.
[28] Nagamine C., Knight W., Maggeneti A. and Paxman, G. (1980).
Masculinization of female Macrobrachium rosenbergii (de Man)

58
(Decapoda, Palaemonidae) by androgeneic gland implantation, General
and comparative endrocrinology, 31(4) , 442–457.
[29] Naldini L. et al. (1996). Efficient transfer, integration, and sustained long–term
expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral
vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11382–11388.
[30] Ohs C.L., D`abramo L.R., Hanson L.P. and Kelly A.M. (2006). Apparent
control of sexual differentiation of freshwater prawn, Macrobrachium
rosenbergii, through dietary administration of dopamine hydrochloride.
Journal of Applied Aquaculture. 18(3) :19–32.
[31] Ohs C.L., D`abramo L.R. and Kelly A.M. (2006). Effect of dietary
administration of 17α–methyltestosterone on the sex ratio of postlarval
freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, during the nursery stage of
culture. Journal of the World Aquaculture Society 37: 34–46.
[32] Ongvarrasopone C., Roshorm Y. and Panyim S. (2007). A Simple and Cost
Effective Method to Generate dsRNA for IRNA Studies in Invertebrates.
Science Asia 33: 35–39.
[33] O’Neal W.K. et al. (2000). Toxicity associated with repeated administration of
first generation adenovirus vectors does not occur with a helper–dependent
vector. Mol. Med. 6, 179–195.
[34] Paddison P.J. et al. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence–
specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948–958.
[35] Palombo F. et al. (1998). Site–specific integration in mammalian cellsmediated
by a new hybrid baculovirus–adeno–associated virus vector. J. Virol. 7,
5025–5034.
[36] Peng Y. et al. (2007). shRNA driven by Pol II/T7 dual–promoter system
effectively induce cell–specific RNA interference in mammalian cells.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 496–500.
[37] Plasterk (2002). RNA silencing: the geneome’s immune system. Science 17
May 2002: Vol. 296 no. 5571 pp. 1263–1265.

59
[38] Raden Roro Sri Pudji Sinarni Dewi, Ikhsan Khasani, Sularto and Wahyu
Pamungkas (2006). Production of female giant freshwater prawn
(Macrobrachium rosenbergii) through hormonal induction. Indonesian
Aquaculture Jounal, 1(1), pp 35 – 38.
[39] Rubinson D.A. et al. (2003). A lentivirus–based systemto functionally silence
genes in primary mammalian cells, stem cells and transgeneic mice by RNA
interference. Nat. Genet. 33, 401–406.
[40] Sachiko Suzuki (1999). Androgeneic gland hormon is a sex–reversing factor
but cannot be a sex–determining factor in the female Crustacean
Isopods Armadillidium vulgare. General and comparartive endrocrinology,
115(3), 370–378.
[41] Samaniego L.A. et al. (1998). Persistence and expression of the herpes simplex
virus geneome in the absence of immediate–early proteins. J. Virol. 72,
3307–3320.
[42] Sanders B.(1983). Insulin–like peptides in the lobster Homarus americanus.I.
insulin immunoreactivity. General and Comparative Endocrinology. 50:
366–373.
[43] Sagi A. and Afalo E.D. (2005). The androgeneic gland and monosex culture of
freshwater prawn Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a
biotechnological perspective. Aquaculture Research.36: 231–237.
[44] Sagi Amir, Cohen Dan, Milner Yoram (1989). Effect of androgene gland
ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of
male Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii, General and
comparative endocrinology, 77, 15 – 22.
[45] Sagi A., Milstein A., Eran Y., Joseph D., Khaila I., Abdu U., Harpaz S. and
Karplis I. (1997a). Culture of the Australian redclaw crayfish (Cherax
quadricarinatus) in Israel, II. Second growout season of overwintered
populations. Israelli Journal of Aquaculture–Bamidgeh. 59:222–229.

60
[46] Sagi A., Khalaila I., Barki I., Hulata G. and Karplus I. (1996). Intersex red
claw crayfish, Cherax quadricarinatu (Von martens): functional males with
pre–viellogeneic ovaries. Biol.Bull 190: 16–23.
[47] Sagi Amir, Snir Eviatar and Khalaila Isam (1995). Sexual differentiation in
decapods crustaceans: role of the androgeneic gland. Invertenrate
Reproduction an Development, 31(1–3), 55 – 61.
[48] Sagi A. and Ra`ana Z. (1988). Morphotypic differentiation of males of
freshwater prawn Macrobrachium rosengergii: changes in the midgut
glands and the reproductive system. Journal of crustacean biology. 8: 43–
47.
[49] Spence R. Malecha, Patricia, Nevin A., Phyllis Ha, Loena E. Barck, Yara
Lamadrid–Rose, Scott Masuno and Dennis Hedgecock (1992). Sex–ratios
and sex–determination in progeney from crosses of surgically sex–reversed
freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture, 105(3–4), pp
201–218.
[50] Starkey J.L. et al. (2009). Hepatitis B virus (HBV)–specific short hairpin RNA
is capable of reducing the formation of HBV covalently closed circular
(CCC).
[51] Stilwell J.L. and Samulski R.J. (2004). Role of viral vectors and virion shells in
cellular gene expression. Mol. Ther. 9, 337–346.
[52] Song E. et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant
hepatitis. Nat Med. 2003 Mar; 9(3):347–51.
[53] Soifer H.S. and Kasahara N. (2004). Retrotransposon–adenovirus hybrid
vectors: efficient delivery and stable integration of transgenes via a two–
stage mechanism. Curr. Gene Ther. 4, 373–384.
[54] Suzuki H. et al. (2008). Suppression of hepatitis C virus replication by
baculovirus vector–mediated short–hairpin RNA expression. FEBS Lett.
582, 3085–3089.

61
[55] Tabara H. Grishok, A., Mello, C. (1998). IRNA in C.elegans: Soaking in the
Geneome Sequence. Science 16 October 1998: Vol. 282 no. 5388 pp. 430–
431.
[56] The Nobel Prize in Physiology ỏ Medicin (2006). RNA interference, pp 1–10.
Aigner A (2007). Nonviral in vivo delivery of therapeutic small interfering
RNAs. Curr. Opin. Mol. Ther. 9, pp 345–352.
[57] Timmons L. and Fire A. (1998). Specific interference by ingested dsRNA.
Nature 395, 854.
[58] Tiu S.H. and Chan S.M. (2007). The use of recombinant protein and
IRNAnterference approaches to study the reproductive functions of a
gonad–stimulating hormon from the shrimp Metapenaeus ensis. T. FEBS J
274: 4385–4395.
[59] Ventura T., Manor R., Aflalo E.D., Weil S., Raviv S., Glazer L. and Sagi A.
(2009). Temporal silencing of an androgeneic gland–specific insulin–like
gene affecting phenotypical geneder differences and spermatogenesis.
Department of Life. General Endocrinology 150: 1278–1286.
[560] Zamore P.D, Tuschl T., Sharp P.A. and Bartel D.P. (2000). IRNA: Double–
stranded RNA directs the ATP–dependent cleavage of mRNA at 21 to 23
nucleotide intervals. Cell. 101: 25–33.
B. Tài liệu từ internet.
Tài liệu tiếng việt.
[61] Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2.
Nghiên cứu các giải pháp điều khiển giới tính tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii (2010).
http://www.vienthuysan2.org.vn/?do=news&act=detail&id=236
[62] Nguyễn Minh Nam. Các RNA không mã hóa protein: một thế giới rộng lớn và
tiềm ẩn (5.2011).
http://vbs.ac.vn/print.php?post=64
Tài liệu nước ngoài.

ứNg dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

ứNg dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to ứNg dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

Similar to ứNg dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879) (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

ứNg dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)