1. CHƯƠNG IV
CÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN
XUẤT ENZYM TỪ VI SINH VẬT

2. MỤC TIÊU
• Nắm được những phẩm chất ưu việt của
enzym được áp dụng trong sản xuất
• Nắm được các nguồn thu nhận enzym từ
đó đưa ra kết luận về nguồn cung cấp
hữu hiệu nhất là vi sinh vật
• Nắm được công tác về giống và các yêu
tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

3. NỘI DUNG
I. Tổng quan về enzym
1. Tính chất ưu việt của enzym.
2. Các nguồn nguyên liệu để thu enzym.
3. Khả năng sử dụng enzym tư vsv
II. Qui trình sản xuất enzym từ vsv
1. Tuyển chọn giống.
2. Cải tạo giống.
3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym
4. Chuẩn bị môi trường

4. 1. Tính chất ưu viêt của enzym:
- Có tính chuyên hóa cao
- Cường lực xúc tác lớn
- Tác dụng trong một điều kiện êm dụi
- Enzym không độc hại

5. 2. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym trong tự nhiên
* Động vật:
- Tụy tạng chứa nhiều enzym amylaza, maltaza, proteaza, esteraza, lipaza,
- Dạ dày chứa nhiều enzym pepxin, xellulaza, renin
- Gan là cơ quan chứa rất nhiều enzym .
- Ruột chứa chủ yếu là enterokinaza có khả năng phá vỡ các liên kết peptid
Không thể thu nhận enzym từ động vật ở quy mô công
nghiệp được vì thời gian nuôi quá dài và không kinh tế.

6. * Thực vật
• Trong chè có nhiều enzym oxy hóa khử như polyphelonoxydaza
• bromelain từ dứa
• amylaza từ malt
• Plazmin: làm tiêu máu đông trong họ ficus (sung, vả….)
• Trong các họ đậu có chứa ureaza
• papain trong đu đủ
Thu enzym từ thực vật cũng không kinh tế vì tốn diện tích đất
trồng và mất nhiều chi phí cho phân bón và công sức chăm sóc.

7. * Vi sinh vật
+ Từ vi sinh vật có thể thu nhận được nhiều loại enzym khác
nhau trong đó có những loại mà không thể thu nhận được từ
động vật hoặc thực vật
+ Bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy hoặc dùng tác nhân
điều chỉnh người ta có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp
enzym của vi sinh vật theo ý muốn.
+ Vi sinh vật có khả năng sinh sản và phát triển nhanh, vượt
xa các enzym từ các nguồn khác
+ Vi sinh vật có khả năng sinh sản , phát triển và tổng hợp
enzym trên môi trường dinh dưỡng đơn giản, dễ kiếm, và rẻ tiền

8. Loại enzym Vi sinh vật Sử dụng
Bacillus Subtilis, Bacillus
Bia và rượu (phân hủy tinh bột thành đừong
Stearotheroophilus. Asp. Niger
Amylaza lên men, sản xuất nha), bánh mì, bánh
Asp. oryzae
ngọt
Asp. Niger
Sản xuất glucoza, bia (làm giảm hàm lượng
Glucoamylaza Asp. Oryzae
dextrin)
Endomycopsis bispora
Asp. Niger
Sản xuất và làm trong dịch quả, các chế
Pectinaza Asp. Oryzae
phẩm rau cho dinh dưỡng trẻ sơ sinh.
Sclerotinia libertina
Công nghiệp thực phẩm (làm tan thành tế
Các xellulaza Trichodema viride bào thực vật ở rau), rượu (thu nhận
đường từ xellulaza).
Dịch hóa đường để làm kẹo, sản xuất mật
Invectaza Saccharomyces serevisiae
ong nhân tạo.
Bacillus Subtilis, Bacillus Cereus,
Bổ sung vào bột giặt để loại protein, làm
Bacillus Stearotheroophilus,
Các proteaza mềm thịt, chất trợ tiêu hóa, dùng trong công
Streptomyces griseus,
nghệ làm phim.
Asp. Oryzae.
Enzym làm đông sữa Mucor pusillus Sản xuất phomát
Keratinaza Streptomyces Fradiac Ngành da (khử lông)
Bảo quản thực phẩm (loại O2), Xác định
β-galactozidaza Asp. Niger, Pen. Notatum
glucoza (chuẩn đoán bệnh đái đường

9. 3. Tuyển chọn giống
Mỗi loại enzym có thể thu nhận được từ nhiều chủng vi sinh
vật khác nhau và ngược lại một loại vi sinh vật cũng có khả
năng sinh nhiều loại enzym.
Khả năng sản sinh enzym của các chủng vi sinh vật không giống
nhau và khác nhau ngay cả trong cùng một chủng khi ta thay đổi
điều kiện của môi trường.
Tìm kiếm
Phân lập

10. 4. Cải tạo giống
Gây đột biến:
+ Làm mất đi cơ chế điều hòa hoạt tính enzyme bằng sản phẩm
cuối cùng: làm hỏng trung tâm dị lập thể.
+ Làm sai hỏng cơ chế điều hòa tổng hợp enzym:
- Làm hỏng gen điều hòa
- Làm mất khả năng gắn kết của O với chất ức chế.

11. 5. Các yếu tố ảnh hưởng tối sự tổng hợp enzym
5.1. Môi trường dinh dưỡng:
Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các môi
trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành
enzym và thành phần enzym được tạo thành cũng khác nhau.
Ví dụ:
Nuôi Asp. Oryzae
amylaza, proteaza, maltaza,
+ trên môi trường cám mì sẽ pectinaza, invectaza, ribonucleaza
thu được
+ trên môi trường Kzapek + α – amylaza
Nitrat + tinh bột

12. 5.2. Độ ẩm
Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường bán rắn: 53 — 65%
5.3. pH môi trường:
Mỗi loại vi sinh vật có dải pH tối thích riêng, và mỗi enzym được tổng hợp ở
một dải pH tối thích khác nhau:
4,5-5,0-amylaza, pectinaza
Saccharomyces cerevisae: 3,5 – 5
Asp. Oryzae: 4,5 – 6,5
Candida famata: 7 - 8 6,0-6,5- proteaza

13. 5.4. Nhiệt độ
Thường vi sinh vật có dải nhiệt độ tối thích: 22 – 320C.
Vi khuẩn cao hơn 32 – 350C
Vi khuẩn suối nước nóng 50 – 700C
5.5. Oxy:
Trong lên sản xuất acid glutamic: 25 - 30 m3 (không khí)/m3/phút
Trong lên men acid citric: 45 – 50 m3 (không khí)/m3/h
5.6. Thời gian nuôi cấy

14. 6. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
6.1. Thành phẩn môi trường:
cacbon, nitơ, hydro. Oxy và các chất khoáng như: Mg, Fe, Ca, p, K....
Các chất kích thích tố sinh trưởng: chủ yếu là vitamin
6.2. Khử trùng môi trường

15. • Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC
• 1-Thùng chứa; 2-Bơm; 3- Bộ đun nóng; 4- Bộ giữ; 5- Bộ lấy mẫu; 6-
Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi; 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm
mát; 8- Thiết bị lên men.

16. I. Phương pháp lên men
I.1. Lên men bề mặt:
Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường
bắn rắn hoặc môi trường lỏng
Đối tượng : VSV kỵ khí, bán kỵ khí và hiếu khí

17. * Quy trình công nghệ:
Môi trường
Phối trộn Hấp Làm ẩm
Đánh tơi và làm nguội
Gieo mốc giống
Vào thiết bị nuôi
Vào phòng nuôi
nuôi mốc Canh trường.

18. *Khử trùng môi trường
• Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC
• 1-Thùng chứa; 2-Bơm; 3- Bộ đun nóng; 4- Bộ giữ; 5- Bộ lấy mẫu; 6-
Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi; 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm
mát; 8- Thiết bị lên men.

19. * Công tác chuẩn bị giống
+ Cấy giống trong phòng thí nghiệm
Lượng dịch trong bình Nồng độ,
pH Nhiệt độ, oC Thời gian,h
%
Trong ống nghiêm 10ml 13-14 - 25 – 32 24
90 ml trong bình 250 ml 13-14 - 25 – 32 18-24
900 ml trong bình 2 lít 13-16 - 25 – 32 18-24
9 lít trong thùng 10 lít 15-18 - 25 – 32 15-18

20. + Nhân giống trong sản xuất
Sơ đồ nuôi cấy giống.
1.Thùng gây men 150 l cấp 1 chứa 100 l dịch; 2.Thùng đường hóa
thêm và xử lý dich đường; 3 và 4. Hai thùng gây men cấp II có dung
tích bằng dung tích thùng đường hóa thêm và đều bằng 10% so với thùng lên men.

22. *Các thông số kỹ thuật cần theo dõi:
• Chất làm xốp như trấu (10 – 20%).
• Quá trình nuôi cấy kéo dài từ 33-48h
• Cần giữ t0 = 28 – 320C
• Giữ Ψphòng = 96 – 100%
• Cung cấp không khí vô trùng
• Trạng thái tế bào vi sinh vật
• pH, mức độ tạp nhiễm…

23. *Ưu và nhược điểm của phương pháp
+ Ưu điểm:
• Cho nồng độ enzym cao hơn so với phương pháp nuôi cấy chìm
• Có thể sấy khô nhanh chóng môi trường (dạng khô) mà không ảnh
hưởng đến hoạt lực của enzym.
• Tránh được sự nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường
• Tốn ít năng lượng.
- Nhược điểm:
• Khó cơ giới hóa
• Hiệu suất thấp
• Tốn nhiều lao động
• Tốn nhiều mặt bằng (diện tích)

24. I.2. Lên men chìm
Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dịch thể
Đối tượng nuôi cấy là các chủng vi sinh vật hiếu khi, bán hảo
khí và kỵ khí
Quy trình công nghệ:
Nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu + thanh trùng chuẩn bị chế phẩm amylaza
Đường hóa dịch cháo
Nuôi giống
các cấp Lên men
Thu hối sản phẩm

25. * Các thông số cần theo dõi và diều chỉnh:
- Nhiệt độ
- pH
- Áp suất
- Bọt khí
- Độ tạp nhiễm
- Cung cấp không khí vô trùng
- Thời gian kết thúc quá trình lên men
- ….

26. *Các phương pháp lên men chìm
I.2.1. Lên men gián đoạn:
Thùng lên men gián đoạn.
1.ruột gà làm lạnh cần 0,4-
0,5m2/m3 thùng; 2.Ống dẫn dịch
đường và men giống; 3.Ống tháo
sản phẩm; 4.Ống thoát CO2;
5.Cửa quan sát và vệ sinh; 6.Đầu
ống nối hệ thống vệ sinh 7 với
phía trong thùng; 8. Van lấy mẫu;
9. Đầu ống nối hệ thống sục khí
hoặc CO2 và hơi thanh trùng.

29. 2.2.2. Lên men liên tục
Sơ đồ lên men liên tục

30. 2.2.3. Lên men cải tiến (bán liên tục)
Sơ đồ lên men bán liên tục

31. *Ưu điểm của phương pháp:
+ Tiết kiệm diện tích.
+ Dễ cơ giới hóa, tự động hóa
+ Sử dụng hợp lý chất dinh dưỡng, tránh lãng phí.
+ Thu enzym ít tạp chất
+ Đảm bảo vệ sinh, vô trùng nên ít nhiễm vi sinh vật lạ.
*Nhược điểm:
- Nồng độ enzym thấp, cần làm đặc canh trường khi tách nên giá
thành cao
- Tốn năng lượng
- Nếu không đảm bảo vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt.

32. Tách và tinh chế enzym
1. Chiết enzym: Là công đoạn loại enzym ra khỏi canh trường
sau lên men
+ Đối với enzym ngoại: Sử dụng nước cất pha loãng canh trường rồi
loại bỏ sinh khối
+ Đối với enzym nội bào thì phải tiến hành phá vỡ tế bào bằng một
trong các phương pháp sau:
- Phương pháp đồng hóa (nghiền trong máy đồng hóa)
- Nghiền với bột thủy tinh, cát….
- Làm lạnh đông và tan giá lặp di lặp lại nhiều lần
- Nhờ tác động của siêu âm
- Dùng áp suất thẩm thấu cao

33. 2. Tách enzym
Là công đoạn tinh chế và thu hồi enzym ra khỏi hỗn hợp sau khi chiết
II.2.1. Thu hồi enzym kỹ thuật
• Phương pháp dùng nhiệt để cô đặc:
300C - 20g/lit
400C – (30-50)g/lit + chất bảo quản sấy phun với nhiệt độ
không vượt quá 700C.
• Phương pháp dùng dung môi hữu cơ để kết tủa enzym:
etylic, izopropylic, axeton ….

34. Tùy theo tính chất của enzym và dung môi hữu cơ mà mỗi một
loại enzym được kết tủa ở một nồng độ dung môi khác nhau.
Ví dụ: proteaza kết tủa trong etanol 76 – 78%,
α- amylaza kết tủa trong etanol 70%,
glucoamylaza kết tủa trong etanol 45% và trong axeton 70%.

35. •Dùng muối trung tính (diêm tích):(NH ) SO , NaCl….
4 2 4
Ví dụ: α- amylaza thường kết tủa trong (NH4)2SO4 ở nồng độ
0,75% độ bão hòa, glucoamylaza ở nồng độ 0,8-0,9% độ bão hòa.
2.2.Thu nhận chế phẩm tinh khiết
Để thu được chế phẩm enzym tinh khiết cần phải loại bỏ
protein không hoạt động bằng cách làm biến tính những
protein này và sau đó mới dung các phương pháp tách chiết
ở trên để thi nhận enzym tinh khiết

36. CÂU HỎI
• Bài 1: Tại sao nồng độ enzym trong canh
trường của lên men bề mặt lại cao hơn
trong lên men chìm?
• Bài 2: Bạn hãy phân biệt enzym kỹ thuật
và enzym tinh khiết? Lấy ví dụ minh họa

37. CÂU HỎI
• Bài 1: Có ý kiến cho rằng nếu như không có
enzym thì không có phản ứng hóa sinh nào có
thể xảy ra trong cơ thể? Bạn có suy nghĩ như
thế nào về ý kiến trên? Cho ví dụ minh họa.
• Bài 2: Hai hệ enzym sử dùng nhiều trong các
phản ứng hóa sinh là amylaza và proteinaza.
Bạn hãy cho biết nhiệt độ tối thích để hai hệ
enzym trên hoạt động là bao nhiêu? Lấy ví dụ
minh họa?

38. TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng
Hải, Vũ Thị Hoan. Giáo trình vi sinh vật học
công nghiệp. Nhà xuất bản Giáo dục.
• Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm
Văn Ty. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo
dục.
• Lương Đức Phẩm. Nấm men công nghiệp.
Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
• Các webside

39. Đánh giá chất lượng enzym
1. Phương pháp đánh giá
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm
được tạo thành trong một thời gian nhất định với một
nồng độ enzym xác định
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến
thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm phản ứng
với một nồng độ enzym nhất định

40. Nồng độ enzym cần thiết để làm biến đổi một lượng cơ
chất hay thu nhận một lượng sản phẩm nhất định trong
một thời gian nhất định

41. 2. Đơn vị
Đơn vị enzym quốc tế (ký hiệu UI): là lượng
enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hóa
một micromol cơ chất sau một phút ở điều
kiện tiêu chuẩn ( ở pHopt, t0opt đối với enzym
cần xác định)

42. Đơn vị Katal (Kat): Là lượng enzym có khả năng xúc
tác làm chuyển hóa một mol cơ chất trong một giây ở
điều kiện tiêu chuẩn.
1UI=10-6/60 Kat = 16,67 nKat (nanoKat)

43. Hoạt độ riêng của chế phẩm enzym: Là số đơn vị
UI hoặc số đơn vị Kat ứng với 1 ml chế phẩm (nếu
là dung dịch) hoặc 1 mg chế phẩm (nếu là bột)

44. Hoạt độ phân tử: Số phân tử cơ chất được
chuyển hóa bởi một phân tử enzym trong
một đơn vị thơi gian

45. 3. Những chú ý khi đánh giá chất
lượng enzym
• Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một
giới hạn thích hợp nhất đủ thừa để bão hòa enzym
nhưng không quá cao đến mức kìm hãm enzym.
• Với những enzym cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm
bền thì phải cho chất này vào enzym trước khi cho cơ
chất vào phản ứng.
• Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pHopt và cố định,
pH thường thay đổi phụ thuộc vào cơ chất và thành
phần dung dịch đệm

46. - Nhiệt độ dùng xác định hoạt độ phải nhỏ
hơn nhiệt độ tối ưu của enzym để đề phòng
sự kìm hãm của enzym ở nhiệt độ cao.
- Thời gian xác định hoạt độ thường 5-30
phút. Nhưng cũng có trường hợp kéo dài
đến 24h nếu hoạt độ của enzym quá thấp.
trong thời gian dài phải cho những chất diệt
khuẩn để tránh hiện tượng tạp nhiễm

47. Enzym không tan
Enzym không tan hay còn gọi là enzym cố
định là enzym nằm trong một không gian bị
giới hạn. Sự giới hạn linh hoạt của enzym đạt
được bằng cách đưa nó vào một pha cách li,
tách rời khỏi pha dung dịch tự do và ở đó nó
vẫn có khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ
chất. Pha chứa enzym thường không tan
trong nước nhưng cũng có thể là polymer cao
phân tử ưu nước

48. 1. Ưu điểm của enzym không tan
• Giảm giá thành vì có thể dùng lặp đi lặp lại được
nhiều lần một lượng enzym xác định.
• Enzym không lẫn trong các sản phẩm do đó tránh
được ảnh hưởng không tốt của nó đối với sản phẩm.
• Có thể làm ngừng nhanh chóng các phản ứng khi cần
thiết.
• Enzym không tan bền hơn enzym tan do đó kết hợp
tận dụng các yếu tố nhiệt độ, pH….
• Dùng enzym cố định có thể dễ dàng thay thế các quá
trình lên men bằng các phản ứng enzym ngoài tế bào

49. 2. Nhược điểm
• Enzym không tan có hoạt độ riêng nhỏ
hơn enzym tan

50. 3. Một số tính chất của enzym
không tan
• Enzym không tan có hoạt độ riêng nhỏ hơn enzym
tan
• Enzym không tan cũng tuân theo quy luật Michaelis
Menten (sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt
tính enzym). Tuy nhiên do có hiện tượng cạnh tranh
giữa cơ chất và chất mang, do hiện tượng khuyếch tán
nên cũng có những sai khác đáng kể về tốc độ phản
ứng của enzyme: Khi cơ chất và chất mang tích điện
cùng dấu thì Km không tan > Km tan, nếu tích điện
trái dấu thì ngược lại (Km – hằng số Michaielis)

51. - Enzym không tan có tính bền nhiệt hơn
enzym tan
- Enzym không tan có sự dịch chuyển pH
tối ưu sang miền kiềm hoặc axit hơn so với
enzym tan.
- Enzym không tan có thời gian bảo quản
lâu hơn và bền với các chất kìm hãm cũng
như các tác nhân gây biến tính

52. Phương pháp sản xuất enzym
không tan
1. Gắn liên kết đồng hóa trị
1.1. Gắn phân tử enzym vào chất mang không
hòa tan

53. Yêu cầu về chất mang:
- Có độ hòa tan thấp và bền vững với tác động
cơ, nhiệt và hóa học.
- Các chất mang không gây tác động kìm hãm
enzym.
- Không hấp phụ phi chọn lọc đối với protein.
- Nên háo nước vì chất mang kỵ nước có thể gây
ức chế với enzym được mang.
- Việc gắn sẽ có hiệu quả hơn nếu chất mang và
enzym có điện tích trái dấu

54. * Những chất mang thường dùng
Chất mang hữu cơ: như là polypeptit,
polysaccarit, các dẫn xuất của xenlulo (DEAE
– xenlulo: Dietyl animoetyl xenlulo, CM –
xenlulo: Cacboxyl metyl xenlulo), dẫn xuất
của dextran (DEAE – sephadex, CM –
sephadex) hoặc agaroza (aga khác với
agaroza, trong thành phần của agaroza có gốc
sunfat)

55. Chất mang vô cơ: So với chất mang hữu cơ thì
chất mang vô cơ bền hơn về nhiệt, cơ học, hóa
học, vi sinh vật và đặc biệt không thay đổi cấu
hình của khuôn khi thay đổi tính chất của môi
trường xung quanh. Các chất mang vô cơ như:
silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt….

56. 1.2. Gắn các enzym với nhau
• Người ta có thể gắn các enzym lại với
nhau nhờ các tác nhân đa hay lưỡng
chức để tạo thành những đại phân tử
enzyme không hòa tan
ví dụ thu dẫn xuất tripxin không tan bằng cách dùng andehyt
glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% để liên kết các phân tử enzyme

57. Ưu điểm
• Ít tổn thất enzym
• Tăng khả năng chống chịu của enzym đối
với các yếu tố biến tính nên đưa vào sản
xuất được.
Nhược điểm của phương pháp này là số enzym
cố định ít

58. 2.“Gói” enzym trong khuôn gel
• Các gel được hình thành trong sự polymer hóa
tổng hợp
• Các enzym bị nhốt trong các lỗ nhỏ của các
sợi tổng hợp
• Gói trong bao vi thể
• Phương pháp tiền polymer

59. 3. Phương pháp hấp phụ vật lí
• Chất hấp phu và enzym được trộn lẫn với nhau
trong một khoảng thời gian cho phép sự hấp
phụ xảy ra trong nhờ tương tác của các liên kết
ion, kị nước, hydrogen….
Nhược điểm là quá trình giải hấp phụ enzym dễ
dàng xảy ra bởi sự thay đổi pH, nhiệt độ và
thành phần ion