Downloaded 35 times
Uploaded byOlga Shatova
Основы генетики
Документ описывает основы молекулярной биологии, включая ключевые процессы репликации, транскрипции и трансляции ДНК и РНК. Он охватывает механизмы действия различных ферментов и белков, участвующих в синтезе и модификации нуклеиновых кислот, а также процессы, связанные с регуляцией этих механизмов. В том числе, документ затрагивает влияние антибиотиков на синтез ДНК и белка.
More Related Content
Основы генетики
- 1. Основы молекулярной биологии:Основымолекулярной биологии: репликация,репликация, транскрипция,транскрипция, трансляциятрансляция Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького Кафедра биологической химии к.мед.н. Шатова О.П. 2015
- 2.
- 3. ГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ –содержат аргинин и лизин •(Н2А, Н2В, Н3 и Н4)2 – нуклеосомный кор + ДНК (146 пары) = нуклеосома •Н1 – связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных) и защищают от воздействия нуклеаз НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ •ферменты репликации, транскрипции и репарации •сайт-специфических белков типа "цинковые пальцы"
- 4.
- 5. РЕПЛИКАЦИЯ это синтез ДНКпо матрице ДНК, т.е. удвоение ДНК Первичная структура ДНК– представлена последовательностью дезоксирибонуклеотидов Вторичная структура – антипарал. двойная спираль Третичная структура - суперспираль http://www.dnalc.org/resources/3d/04- mechanism-of-replication-advanced.html
- 6. РепликацияРепликация Механизм репликации – полуконсервативный принципкомплементарности Первый этап – это формирование репликативной вилки ДЕСПИРАЛИЗАЦИЯ ДНК • Хеликаза (разрушает водородные связи) • Топоизомераза (разрушает фосфорнодиэфирные) • SSB –препятствуют спирализации
- 8. РЕПЛИКАЦИЯ 1. Инициация –это деспирализация и образование праймера – праймазой (ДНК – зависимой РНК – полимеразой), т.е. праймер – это фрагмент РНК 2. Элонгация - ДНК – полимераза ІІІ – присоеденяется к праймеру и синтезирует по принципу комплементарности цепь ДНК 3. Терминация Метилирование ДНК После завершения репликации происходит метилирование нуклеотидных остатков вновь образованных цепей ДНК. СН3 присоединяются ко всем остаткам аденина в последовательности - ГАТЦ- (материнская нить), источник СН3-(SAM). Биологическая роль метилирования – репарация дочерней нити ДНК. - S-фаза клеточного цикла - инициация репликации регулируется специфическими сигнальными белковыми молекулами - факторами роста
- 9. Okazaki Синтез всегда 5 →3(Топоизомераза)
- 10. Репликация у эукариот 5ДНК-полимераз: α β ε δ Синтез ДНК в ядре Синтез митохондриальной ДНК ДНК-полимераза α – синтезирует праймер, из 8-10 нуклеотидов ДНК-полимераза δ – присоединяется к праймеру и удлиняет цепь ДНК (лидирующая цепь) ДНК-полимераза β – удаляет праймеры, заполняет брешь (отстающая ДНК-полимераза ε – присоединяется к праймеру и удлиняет цепь ДНК (отстающая цепь) γ
- 11. Теломерная последовательность –ГГГТТА После завершения репликации хромосомы 5'-концы дочерних цепей ДНК недостроены, так как после удаления праймеров эти фрагменты оказываются недореплицированными. Это происходит потому, что ДНК-полимераза β, отвечающая за заполнение бреши, образованной после удаления праймера, не может вести синтез цепи ДНК от 3'- к 5'-концу (мы помним, что только 5'→3'). Таким образом, в ходе каждого цикла репликации 5'- концы синтезированных цепей укорачиваются. Но такие потери не представляют опасности для генетической информации хромосом, потому что укорочение ДНК идёт за счёт теломер. Таким образом, запрограммирована клеточная смерть - апоптоз
- 12. СИНТЕЗ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК А- укорочение вновь синтезированных цепей ДНК после удаления праймеров; Б - в состав теломеразы входит короткая молекула РНК, содержащая в активном центре последовательность нуклеотидов, комплементарную теломерному повтору; 1 - фермент прикрепляется за счёт взаимодействия РНК с существующей теломерой и добавляет последовательно по одному нуклеотиду фрагмент -GGGTTA-. Матрицей служит простетическая группа теломеразы - фрагмент РНК; 2 - фермент перемещается по нити ДНК таким образом, что РНК-матрица в составе теломеразы постоянно комплементарно связана с концом вновь синтезированного теломерного повтора. Заново синтезированная теломерная ДНК служит матрицей для удлинения второй цепи ДНК, но уже в ходе следующего цикла клеточного деления.
- 13. Полимеразная цепная реакция- ПЦР http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html
- 14. Транскрипция – синтезРНК по матрице ДНК ГОТОВНОСТЬ К ТРАНСКРИПЦИИ Ремоделирование нуклеосом 1. Деконденсация доменов 2. Гиперацетилирование гистонов и появление чувствительности к ДНК-азе I 3. Уменьшение или распад нуклеосом 4. Превращение нуклеосом в гексасомы
- 15.
- 17.
- 18. Промотор эукариотПромотор эукариот Conservedeukaryotic promoter elements Consensus sequence CAAT box GGCCAATCT TATA box ТАТА-бокс, также известный, как бокс Голдберга-Хогнесса - консервативная последовательность ДНК богатая A-Т парами, содержащая обычно 7-8 нуклеотидов, и расположенная приблизительно за 25 пар оснований перед сайтом начала транскрипции. TATAAТ GC box GGGCGG CAP site TAC 18 •находится перед структурными генами •известно несколько типов, которые имеют различную структуру
- 19. Единица транскрипции упрокариот Оперон Промотор Оператор Цистрон 1 Терминатор Цистрон n Цистрон – ген, кодирующий одну полипептидную цепь или одну молекулу РНК ДНК 3' 5'
- 20. Терминация П О Т 3'5' не гни папин ген Терминация- в терминаторе имеются Г-Ц богатые участки – палиндромы. Дойдя до палиндрома, РНК-полимераза не останавливается, а считывает его. После этого копия палиндрома в РНК складывается в шпильку .
- 21. Lac-оперон •Если в средеглюкозу заменить лактозой, то через некоторое время E. coli начинают синтезировать 3 фермента, обеспечивающих метаболизм лактозы. •В отсутствие лактозы репрессор (аконитаза) связан с оператором, перекрывающим промотор, и транскрипция не идет. • При появлении лактозы, она связывается с репрессором, оператор освобождается и начинается транскрипция оперона
- 22. Посттранскрипционая модификация -процессинг Модификация на стадии элонгации 1. кэпирование (присоединение ГТФ, а затем +СН3) гуанилилтрансфераза КЭП •обеспечивает инициацию трансляции •защищает от действия 5'-экзонуклеаз •AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп 2. Полиаденилирование полиА-полимераза сигнал AAUAAA •облегчает выход мРНК из ядра •замедляет её гидролиз в цитоплазме
- 23. Посттранскрипционая модификация -процессинг 3. Сплайсинг – это вырезание интронов и сшивание экзонов
- 24. Процесс "вырезания" интронов протекает приучастии малых ядерных РНК (мяРНК). Образование 3',5'- фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК, входящие в структуру сплайсосомы. В результате сплайсинга из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы "зрелой" мРНК. 3. Сплайсинг
- 25. Процессинг пре-тРНК Пре-тРНК содержитвсего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон"
- 26. Процессинг пре-рРНК Из молекулыпредшественника 45S рРНК образуются три типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5,8S, локализующиеся в большой субъединице
- 27. Основные типы РНК •транспортнаяРНК (тРНК) "клеверный лист" акцептор •матричная РНК (мРНК) •рибосомальная РНК (рРНК) S – скорость оседания субъединиц петля переменного размера дигидро- урацил ψ (псевдо- урацил) АУГ УГА/УАГ/УУА поли-А-хвост
- 28.
- 29. Генетический кодГенетический код Различных64 варианта; 61 для 20 аминокислот (терминирующие:UAG,UGA,UAA) Инициаторн.кодон – АУГ (метионин) Вырожденность или избыточность Универсальность Триплетность Специфичность 29
- 30.
- 31. тРНК – адаптормежду мРНК итРНК – адаптор между мРНК и аминокислотамиаминокислотами 31 акцептор для ак антико дон для мРНК
- 32. Активация аминокислот -Активацияаминокислот - аминоацилтРНКсинтетазыаминоацилтРНКсинтетазы 32
- 33.
- 34. Компоненты трансляцииКомпоненты трансляции Рибосомы тРНК мРНК АК Инициаторн. факторы Факторы элонгации Факторы терминации Аминоацил-тРНК-синтетазы Источники энергии 34
- 35.
- 36. Существует большая группавеществ ингибирующая синтез ДНК – антибиотики и цитостатики Антибиотики Механизм действия Ингибиторы репликации Дауномицин Доксорубицин Внедряются («интеркалируют») между парами оснований ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию Актиномицин D Мелфалан Алкилирует ДНК и нарушает репликацию Номермицин Новобиоцин Ингибируют ДНК-топоизомеразу П, ответственную за суперспирализацию ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию Ингибиторы транскрипции Рифамицины Связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции Ингибиторы трансляции Тетрациклины Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр Левомицетин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность Эритромицин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию Стрептомицин Ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК
- 37.
Editor's Notes
- #6 Автор книги - видный американский ученый Джеймс Д. Уотсон. Каждый, кто следил за последними достижениями мировой биологии, наверняка слышал его имя рядом с именами англичан Фрэнсиса Крика и Мориса Уилкинса. Эти трое ученых, получившие в 1962 году Нобелевскую премию, сделали одно из самых значительных открытий в биологии XX века: установили структуру молекулы ДНК - генетического материала клетки, хранящего информацию о наследственных признаках организма. "Двойная спираль" - автобиографическая повесть, в которой Уотсон подробно рассказывает о том, как он и его соавторы пришли к этому открытию, - знакомит читателя с "кухней" большой науки. Непринужденная манера изложения, яркие характеристики действующих лиц - известных американских и европейских ученых, образный литературный язык привлекут к книге внимание не только ученых, но и любителей научно-популярной литературы. Джеймс Дью́и Уо́тсон (англ. James Dewey Watson, род. 6 апреля 1928, Чикаго, Иллинойс) — американский биолог. ЛауреатНобелевской премии по физиологии и медицине 1962 года — совместно с Фрэнсисом Криком и Морисом Х. Ф. Уилкинсомза открытие структуры молекулы ДНК. Уотсон часто высказывает провокационные идеи и опровергает мнение большинства с сугубо научных[источник не указан 17 дней] позиций. Уотсон постоянно поддерживает генетический скрининг и генную инженерию в отношении человека в публичных лекциях и интервью, доказывая, в частности, что глупость — это болезнь вызванная гельминтозами[источник не указан 17 дней], и что «самые глупые» 10 % людей надо лечить. Он также предположил, что красота может быть создана генетической инженерией, заявив: Некоторые говорят, что если мы сделаем всех девушек красавицами, это будет ужасно. Я думаю, это было бы великолепно. Газета The Sunday Telegraph процитировала его интервью: Если бы можно было найти ген, отвечающий за сексуальную ориентацию, и какая-нибудь женщина решила бы, что не хочет иметь гомосексуального ребёнка, — что же, ну и пусть. С точки зрения американского общества, это настолько крамольное утверждение, что коллегам пришлось спешно оправдывать Уотсона (The biologist Richard Dawkins wrote a letter to The Independent claiming that Watson's position was misrepresented by The Sunday Telegraph article, and that Watson would equally consider the possibility of having a heterosexual child to be just as valid as any other reason for abortion, to emphasise that Watson is in favor of allowing choice). По поводу ожирения, Уотсон также высказывался в интервью: Когда вы как работодатель проводите собеседование с жирным человеком, вы всегда чувствуете себя неловко, потому что знаете, что никогда не возьмете его на работу. В своем выступлении на одной конференции в 2000 году Уотсон предположил существование связи между цветом кожи и половым влечением, высказав гипотезу, что утемнокожих людей либидо сильнее. Его лекция, сопровождавшаяся слайдами женщин в бикини, доказывала, что экстракты меланина — пигмента, придающего темный цвет загорелой коже (и волосам брюнетов) — по результатам экспериментов резко усиливали половое влечение субъекта. Вот почему мы знаем латиноамериканских любовников [Latin lovers — слова из известной песни] , — сказал он, обращаясь к аудитории. — Вы никогда не слышали об английском любовнике. Только об английских пациентах. 25 октября 2007 года Уотсон был вынужден уйти с поста главы Cold Spring Harbor Laboratory (Лаборатории Колд-Спрингс-Харбор) в Лонг-Айленде, Нью-Йорк, и был выведен из состава её совета директоров после того, как следующие его слова процитировала The Times (Таймс): Я, вообще-то, вижу мрачные перспективы для Африки, потому что вся наша социальная политика строится на допущении факта, что у них уровень интеллекта такой же, как у нас — тогда как все тесты говорят, что это не так. 4 декабря 2014 года российский миллиардер Алишер Усманов на нью-йоркском аукционе Christie’s приобрёл за $4,1 млн Нобелевскую медаль Джеймса Уотсона (ранее выставленную учёным с целью пожертвования денег с её продажи для нужд университета) и вернул её учёному, на что тот ответил:
- #7 https://www.youtube.com/watch?v=KB8dDypPsHA
- #9 Наличие метальных групп в цепях ДНК необходимо для формирования структуры хромосом, а также для регуляции транскрипции генов. В течение непродолжительного времени в молекуле ДНК последовательности -GATC-метилированы по аденину только в матричной, но не в новой цепи. Это различие используется ферментами репарации для исправления ошибок, которые могут возникать при репликации.
- #11 В синтезе эукариотических ДНК принимают участие 5 ДНК-полимераз (α, β, γ, δ, ε). ДНК-полимеразы различают по числу субъединиц, молекулярной массе, ассоциации с разными вспомогательными белками, ускоряющими процесс биосинтеза ДНК, и функциональному назначению. ДНК-полимеразы α (альфа), β (бета), δ (дельта), ε (эпсилон) участвуют в синтезе ДНК в ядре клеток, ДНК-полимераза γ (гамма) - в репликации митохондриальной ДНК. ДНК-полимеразы β, δ, ε не могут инициировать образование дочерних цепей, так как не имеют сродства к одиночной нити ДНК. Инициирует репликацию ДНК-полимераза α, которая комплементарна определённому сайту одноцепо-чечной ДНК. Присоединяясь к нему, ДНК-полимераза а синтезирует небольшой фрагмент РНК - праймер, состоящий из 8-10 рибонуклеотидов. ДНК-полимераза а состоит из четырёх субъединиц. Каждая из субъединиц фермента выполняет определённую функцию: "узнавание" сайта репликации, синтез праймера (8-10 рибо-нуклеотидов), синтез фрагмента цепи ДНК, около 50 дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, ДНК-полимераза α синтезирует олигонуклеотид, содержащий примерно 60 нуклеотидных остатков; первые 8-10 представлены рибонуклеотида-ми (праймер), а остальные - дезоксирибонуклеотидами. ДНК-полимераза δ Олигонуклеотид, синтезированный ДНК-полимеразой α и образующий небольшой двухцепочечный 151 Рис. 4-16. Репликация. фрагмент с матрицей, позволяет присоединиться ДНК-полимеразе δ и продолжить синтез новой цепи в направлении от 5'- к 3'-концу по ходу раскручивания репликативной вилки. ДНК-полимераза δ последовательно наращивает цепь, шаг за шагом присоединяя к ней соответствующие дезоксинуклеотиды. Выбор ДНК-полимеразой δ очередного нуклеотида определяется матрицей. Включение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов в растущую цепь ДНК сопровождается гидролизом макроэргических связей соответствующих нуклеозидтрифосфатов и отщеплением пирофосфата (Н4Р2О7). Энергия макроэргических связей расходуется на образование 3',5'-фосфодиэфирной связи между последним нуклеотидом растущей цепи ДНК и присоединяемым нуклеотидом. Включение нуклеотида в синтезируемую цепь ДНК невозможно без предварительного связывания азотистого основания водородными связями с комплементарным нуклеотидом матричной цепи. ДНК-полимеразы (α, β, γ, δ, ε) могут синтезировать нуклеотидную цепь только в направлении 5'→3', матричная цепь всегда считывается в направлении 3'→5'. В каждой репликативной вилке идёт одновременно синтез двух новых (дочерних) цепей. Направление синтеза цепи ДНК совпадает с направлением движения репликативной вилки лишь для одной из вновь синтезируемых цепей (лидирующая цепь). На второй матричной цепи синтез дочерней ДНК осуществляется двумя ферментами: ДНК-полимеразой α и ДНК-полимеразой ε в направлении 5'→3', но против движения репликативной вилки. Поэтому вторая цепь синтезируется прерывисто, короткими фрагментами, которые называют "фрагменты Оказаки" (по имени открывшего их исследователя). Дочерняя цепь ДНК, синтез которой происходит фрагментами, называют отстающей цепью. Каждый фрагмент Оказаки, примерно 100 нуклеотидных остатков, содержит праймер. Праймеры удаляет ДНК-полимераза β, постепенно 152 отщепляя с 3'-конца фрагмента по одному ри-бонуклеотиду. К ОН-группе на 3'-конце предыдущего фрагмента ДНК-полимераза β присоединяет дезоксирибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному праймеру и таким образом заполняет брешь, возникающую при удалении рибонуклеотидов. Фермент ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3'-ОН-группой дезоксирибозы одного фрагмента цепи ДНК и 5'-фосфатом следующего фрагмента. Реакция протекает с затратой энергии АТФ. Таким образом, из множества фрагментов Оказаки образуется непрерывная цепь ДНК. Эукариоты содержат по меньшей мере пятнадцать видов ДНК-полимераз[1]: ДНК-полимераза α выступает сначала в роли праймазы, синтезируя праймер РНК, а затем как нормальная полимераза, присоединяя к этому праймеру нуклеотиды. После того, как длина цепочки достигнет около 20 нуклеотидов[2], к транскрипции приступают полимеразы δ и ε; ДНК-полимераза β задействована в восстановлении ДНК; Pol γ, осуществляющая репликацию митохондриальной ДНК; ДНК-полимераза δ — основная полимераза эукариот. Она высокопроизводительна, а также обладает 3'-5'-экзонуклеазным действием; ДНК-полимераза ε, иногда замещающая ДНК-полимеразу δ во время синтеза 3’-5’-моноспирали. Основное назначение этой полимеразы неясно; ДНК-полимеразы η, ι, κ, и Rev1 из семейства Y, а также ζ из семейства B. Эти полимеразы задействованы в пропуске поврежденных участков ДНК[3]. Существуют также другие эукариотические ДНК-полимеразы, которые пока недостаточно изучены: θ, λ, φ, σ и μ.
- #13 Однако в эмбриональных и других быстро-делящихся клетках потери концов хромосом недопустимы, потому что укорочение ДНК будет происходить очень быстро. В эукариотических клетках имеется фермент теломераза (нуклео-тидилтрансфераза), обеспечивающий восстановление недореплицированных 5'-концов. К особенностям этого фермента относят присутствие в качестве простетической группы РНК. Фрагмент РНК в активном центре теломеразы служит матрицей при синтезе теломер-ных повторов хромосом. С помощью РНК фермент комплементарно прикрепляется к 3'-концу недостроенной дочерней цепи ДНК. Теломераза по принципу комплементарности последовательно удлиняет 3'-конец цепи ДНК на один гексануклеотид -GGGTTA-. Синтез всегда идёт от 5'- к 3'-концу. Затем теломераза смещается по цепи ДНК на один теломер и начинает синтез нового фрагмента -GGGTTA- (рис. 4-19, Б). В большинстве соматических клеток теломераза неактивна, так как соматическая клетка имеет длину теломерной ДНК, достаточную для времени жизни клетки и её потомства. Однако небольшую активность теломеразы обнаруживают в клетках с высокой скоростью обновления, таких как лимфоциты, стволовые клетки костного мозга, клетки эпителия, эпидермиса кожи и др.
- #17 Стадии транскрипции. 1 - присоединение ТАТА-фактора к промотору. Чтобы промотор был узнан РНК-полимеразой, необходимо образование транскрипционного комплекса ТАТА-фактор/ТАТА-бокс (промотор). ТАТА-фактор остаётся связанным с ТАТА-боксом во время транскрипции, это облегчает использование промотора многими молекулами РНК-полимеразы; 2 - образование транскрипционной вилки; 3 - элонгация; 4.- терминация. строго определенных участках матрицы - терминаторах (сайты терминации). Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта (пре-мРНК), комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.
- #20 Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов мРНК Для некоторых генов описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же транскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути, поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК и, соответственно, разных белков с одного первичного транскрипта. Так, в парафолликулярных клетках щитовидной железы (рис. 4-33) в ходе транскрипции гена гормона кальцитонина (см. раздел 11) образуется первичный транскрипт мРНК, который состоит из шести экзонов. Матричная РНК кальцитонина образуется путём сплайсинга первых четырёх экзонов (1-4). Последний (четвёртый) экзон содержит сигнал полиаденилирования (последовательность -AAUAAA-), узнаваемый полиА-полимеразой в парафолликулярных клетках щитовидной железы. Этот же первичный транскрипт в клетках головного мозга в ходе другого (альтернативного) Рис. 4-32. Сплайсинг РНК. В процессе сплайсинга принимают участие различные мяРНП, которые формируют сплайсосому. мяРНП, взаимодействуя с РНК и друг с другом, фиксируют и ориентируют реакционные группы первичного транскрипта. Каталитическая функция сплайсосом обусловлена РНК-составляющими; такие РНК называют рибозимами. 167 Рис. 4-33. Альтернативный сплайсинг гена кальцитонина. В клетках щитовидной железы сплайсинг первичного транскрипта приводит к образованию кальцитониновои мРНК, включающей 4 экзона и полиА-последовательность, которая образуется после расщепления транскрипта в первом участке сигнала полиаденилирования. В клетках мозга образуется мРНК, содержащая: экзоны 1, 2, 3, 5, 6 и полиА-последовательность, образованную после второго сигнала полиаденилирования. пути сплайсинга превращается в мРНК кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие. Матричная РНК этого белка состоит из первых трёх экзонов, общих с кальцитониновои мРНК, но включает дополнительно пятый и шестой экзоны, не свойственные мРНК кальцитонина. Шестой экзон тоже имеет сигнал полиаденилирования -AAUAAA-, узнаваемый ферментом полиА-полимеразой в клетках нервной ткани. Выбор одного из путей (альтернативный сплайсинг) и одного из возможных сайтов полиаденилирования играет важную роль в тканеспецифической экспрессии генов. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Разные изоформы тропонина образуются в разных тканях на определённых стадиях их развития.
- #23 Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность -AAUAAA Ферменты, осуществляющие кэпирование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.
- #24 Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов мРНЕ Для некоторых генов описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же транскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути, поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК и, соответственно, разных белков с одного первичного транскрипта. Так, в парафолликулярных клетках щитовидной железы (рис. 4-33) в ходе транскрипции гена гормона кальцитонина (см. раздел 11) образуется первичный транскрипт мРНК, который состоит из шести экзонов. Матричная РНК кальцитонина образуется путём сплайсинга первых четырёх экзонов (1-4). Последний (четвёртый) экзон содержит сигнал полиаденилирования (последовательность -AAUAAA-), узнаваемый полиА-полимеразой в парафолликулярных клетках щитовидной железы. Этот же первичный транскрипт в клетках головного мозга в ходе другого (альтернативного) пути сплайсинга превращается в мРНК кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие. Матричная РНК этого белка состоит из первых трёх экзонов, общих с кальцитониновои мРНК, но включает дополнительно пятый и шестой экзоны, не свойственные мРНК кальцитонина. Шестой экзон тоже имеет сигнал полиаденилирования -AAUAAA-, узнаваемый ферментом полиА-полимеразой в клетках нервной ткани. Выбор одного из путей (альтернативный сплайсинг) и одного из возможных сайтов полиаденилирования играет важную роль в тканеспецифической экспрессии генов. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Разные изоформы тропонина образуются в разных тканях на определённых стадиях их развития.
- #26 В молекуле тРНК содержатся и другие необычные основания - псевдоуридин, дигидроуридин, которые также модифицируются во время процессинга. РНК-метилазы образует 7-метилгуанозин и 2-метилгуанозин (минорные основания).
- #28 Процессинг первичных транскриптов рибосомной РНК и транспортной РНК Гены, кодирующие большую часть структурных РНК, транскрибируются РНК-полимера-зами I и III. Нуклеиновые кислоты - предшественники рРНК и тРНК - подвергаются в ядре расщеплению и химической модификации (процессингу). Посттранскрипционные модификации первичного транскрипта тРНК (процессинг тРНК) Первичный транскрипт тРНК содержит около 100 нуклеотидов, а после процессинга - 70-90 нуклеотидньгх остатков. Посттранскрипционные модификации первичных транскриптов тРНК происходят при участии РНК-аз (рибонуклеаз). Так, формирование 3'-конца тРНК катализирует РНК-аза, представляющая собой 3'-экзонуклеазу, "отрезающую" по одному нук-леотиду, пока не достигнет последовательности -ССА, одинаковой для всех тРНК. Для некоторых тРНК формирование последовательности -ССА на 3'-конце (акцепторный конец) происходит в результате последовательного присоединения этих трёх нуклеотидов. Пре-тРНК содержит всего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон", - триплета нуклеотидов, обеспечивающего взаимодействие тРНК с комплементарным кодоном мРНК в ходе синтеза белков (рис. 4-34). Посттранскрипционные модификации (процессинг) первичного транскрипта рРНК. Формирование рибосом В клетках человека содержится около сотни копий гена рРНК, локализованных группами на пяти хромосомах. Гены рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I с образованием идентичных транскриптов. Первичные транскрипты имеют длину около 13 000 нуклеотид-ных остатков (45S рРНК). Прежде чем покинуть ядро в составе рибосомной частицы, молекула 45 S рРНК подвергается процессин-гу, в результате образуется 28S рРНК (около 5000 нуклеотидов), 18S рРНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,88 рРНК (около 160 нуклеотидов), которые являются компонентами рибосом (рис. 4-35). Остальная часть транскрипта разрушается в ядре. 168 Рис. 4-34. Процессинг пре-тРНК. Определённые азотистые основания нукпеотидов тРНК в ходе процессинга метилируются под действием РНК-метилазы и превращаются, например, в 7-метилгуанозин и 2-метилгуанозин (минорные основания). В молекуле тРНК содержатся и другие необычные основания - псевдоуридин, дигидроуридин, которые также модифицируются во время процессинга. Рис. 4-35. Образование и выход из ядра субъединиц рибосом. В результате процессинга из молекулы предшественника 45S рРНК образуются три типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5,8S, локализующиеся в большой субъединице. Все три рРНК образуются в равных количествах, так как они происходят из одного и того же первичного транскрипта. 5S рРНК большой субъединицы рибосом транскрибируется отдельно от первичного транскрипта 45S рРНК. Рибосомальные РНК, образованные в ходе посттранскрипционных модификаций, связываются со специфическими белками, и образуется рибосома. 169 Рибосома - органелла клетки, участвующая в биосинтезе белка. Рибосома эукариотов (80S) состоит из двух, большой и малой, субъединиц: 60S и 40S. Белки рибосом выполняют структурную, регуляторную и каталитическую функции. 170
- #36 Зрелая иРНК считывается рибосомами в процессе трансляции (не копирование, не переписывание, а «перевод на другой язык» – язык аминокислот) иРНК считывается рибосомой в виде трёх нуклеотидных «слов». Комплексы факторов инициации и факторов элонгации доставляют аминоацилированные транспортные РНК к комплексу иРНК-рибосома.
- #37 Ингибиторы репликации - противоопухолевые препараты Антибиотики, взаимодействующие с ДНК, нарушают её матричную функцию и вызывают подавление процессов репликации и транскрипции. Их используют для лечения злокачественных новообразований и называют противоопухолевыми препаратами (см. раздел 15). Дауномицин, доксорубицин и некоторые другие взаимодействуют с молекулой ДНК таким образом, что циклическая структура этих антибиотиков встраивается ("интеркалирует") между парами оснований G≡C, а углеводный компонент занимает малую бороздку ДНК (рис. 4-43). Это ведёт к локальному изменению структуры ДНК и ингибированию репликации и транскрипции. К "интеркаляторам" относят также антибиотик актиномицин D, блокирующий синтез ДНК и РНК у про- и эукариотов. Это соединение слишком токсично, чтобы использовать его в клинических целях, но его широко используют в научно-исследовательской работе для изучения процессинга первичных транскриптов РНК. Избирательность действия противоопухолевых антибиотиков невелика и обеспечивается более высокой по сравнению с нормальными клетками скоростью синтеза ДНК и РНК, а также повышенной проницаемостью клеточных мембран опухолевых клеток. В то же время эти соединения токсичны для быстроделящихся нормальных клеток организма, таких как стволовые клетки кроветворной системы, клетки слизистой оболочки желудка и кишечника, фолликулов волос. В последние годы проводятся исследования по созданию препаратов, обеспечивающих доставку ингибитора только в опухолевые клетки. Это достигается связыванием цитотоксических антибиотиков с белками, рецепторы к которым имеются главным образом на опухолевых клетках (см. раздел 15). К препаратам, останавливающим репликацию, относят алкилирующие агенты и ингибиторы ДНК-топоизомеразы II (одной из изоформ топоизомераз). Последние называют ингибиторами гираз, поскольку ДНК-гиразы - ферменты прокариотических клеток, ответственные за суперспира-лизацию ДНК; у эукариотов аналогичную функцию выполняют ДНК-топоизомеразы. Известно, что транскрипция некоторых генов возможна лишь при определённом уровне суперспирализации матрицы. Соединения, вмешивающиеся в работу ДНК-гираз, могут ингибировать или активировать синтез РНК. К ингибиторам гираз принадлежат налидиксовая кислота, новобиоцин и номермицин. 181 Рис. 4-43. Строение "интеркаляторов" - дауномицина и актиномицина D. Б. Ингибиторы транскрипции и трансляции - антибактериальные препараты К ингибиторам матричных синтезов, оказывающим противобактериальное действие, относят вещества, блокирующие синтез РНК или белка. В эту группу входит широко применяемый в клинике рифампицин, получаемый на основе природного антибиотика рифамицина. Антибиотики из семейства рифамицинов ингибируют только бактериальную ДНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с β-субъединицей фермента и препятствуя инициации транскрипции (рис. 4-44). Их применяют для лечения туберкулёза, так как эти препараты не влияют на работу ядерных РНК-полимераз эукариотических клеток. Однако они могут ингибировать синтез митохондриальных РНК, хотя дозы препарата, при которых блокируется образование митохондриальных РНК, выше тех, что используют в лечении инфекционного заболевания. Большая группа антибиотиков является ингибиторами трансляции (рис. 4-45): тетрацик-лины, эритромицин, пуромицин, хлорамфени-кол и аминогликозиды. Так, один из наиболее известных аминогликозидов стрептомицин ингибирует инициацию синтеза белка у прокариотов и вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК. Его часто назначают при лечении инфекционных заболеваний сердца. К антибиотикам широкого спектра действия относят тетрациклины. Они связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аминоацил-тРНК в А-центр рибосомы, тем самым нарушая элонгацию полипептидной цепи. Тетрациклины эффективны 182 Таблица 4-5. Антибиотики - ингибиторы матричных биосинтезов как лекарственные препараты Антибиотики Механизмдействия Ингибиторырепликации ДауномицинДоксорубицин Внедряются («интеркалируют») между парами оснований ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию Актинрмицин D Мелфалан Алкилирует ДНК и нарушает репликацию НомермицинНовобиоцин Ингибируют ДНК-топоизомеразу П, ответственную за суперспирализацию ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию Ингибиторытранскрипции Рифамицины Связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции Ингибиторытрансляции Тетрациклины Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр Левомицетин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность Эритромицин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию Стрептомицин Ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК в отношении возбудителей многих болезней. Левомицетин (хлорамфеникол) также относят к антибиотикам широкого спектра действия. Он ингибирует синтез белка за счёт присоединения к 50S субъединице рибосомы, подавляя пептидилтрансферазную активность. Пенициллины и цефалоспорины относят к группе β-лактамных антибиотиков, продуцируемых плесенью штамма Penicillum. В структуре этих молекул присутствует реакционно-способное β-лактамное кольцо, вызывающее ингибирование синтеза клеточных стенок у грамотрицательных микроорганизмов. Действие этих антибиотиков направлено на фермент, обеспечивающий образование поперечных связей в структуре белков клеточной стенки бактерий. Необратимое ингибирование активности этого фермента ведёт к образованию изменённых клеточных стенок и гибели бактерий в процессе размножения. Надо сказать, что препараты антибактериальной группы отличаются высокой избирательностью Рис. 4-44. Антибиотики из семейства рифамицинов. 183 Рис. 4-45. Некоторые антибиотики-ингибиторы синтеза белков у прокариотов. и сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется различиями в структуре РНК-полимераз, РНК и белков рибосом в эукариотических и прокариотических клетках. В. Вирусы и токсины - ингибиторы матричных синтезов в эукариотических клетках Вирусы Генетический материал вирусов представлен молекулой ДНК или РНК. Он, как правило, невелик и содержит информацию лишь о некоторых специфических белках и ферментах, необходимых для репродукции вируса (например, вирусов оспы, гриппа, полиомиелита, гепатита). Вскоре после заражения с высокой скоростью начинается синтез вирусных ДНК, РНК и белков с использованием ферментов и белков, субстратов и источников энергии клетки хозяина. При этом в инфицированных клетках прекращается синтез нуклеиновых кислот и белков, свойственных организму хозяина. Репродукция вирусных частиц идёт вплоть до гибели заражённой клетки. Токсины Причиной гибели людей при отравлении бледной поганкой Amanita phalloides является токсин - α-аманитин, который содержится в теле гриба и вызывает необратимую дисфункцию печени и почек. Высокая токсичность этого соединения для человека связана с тем, что оно ингибирует эукариотические РНК-полиме-разы. Наибольшую чувствительность к яду обнаруживает РНК-полимераза II, катализирующая синтез мРНК. Для α-аманитина LD50 (доза per os, при которой погибает 50% лиц, получивших токсин) составляет 0,1 мг/кг массы тела. Чрезвычайно токсичен белок рицин, выделенный из клещевины обыкновенной. Он представляет собой N-гликозилазу, которая удаляет один остаток аденина из 28S рРНК большой субъединицы рибосомы и ингибирует синтез белка у эукариотов. Рицин - белковый компонент касторового масла, иногда используемого в качестве слабительного средства. Из-за высокой токсичности рицина лечение касторовым маслом проводят короткими курсами, так как длительное употребление может вызвать непрекращающийся понос, нарушение работы кишечника и даже гибель больного. У человека развитие некоторых бактериальных инфекций сопровождается ингибированием матричных синтезов. Наиболее изученный пример - ингибирование синтеза белков в клетках слизистой оболочки зева и гортани энтеротоксином возбудителя дифтерии Corynebacterium diphteriae. Некоторые штаммы этого патогенного микроорганизма получают ген токсина от бактериального вируса, называемого β-фагом, который инфицирует бактерию и индуцирует синтез токсина - одноцепочечно-го белка с молекулярной массой 60 кД. В цитоплазме клеток хозяина под влиянием протеолитических ферментов токсин расщепляется на 2 фрагмента, один из которых является ферментом АДФ-рибозилтрансферазой. Этот фермент катализирует АДФ-рибозилирование и 184 инактивацию фактора элонгации EF-2 по реакции: EF-2 + NAD+ → АДФ-рибозил-ЕF-2 + никотинамид + Н+. В условиях in vitro эта реакция обратима, но при рН и концентрации никотинамида, которые существуют в клетках, она становится необратимой. Модификация фактора EF-2 нарушает транслокацию рибосом, ведёт к прекращению биосинтеза белков в инфицированных клетках и к их гибели. С действием токсина связаны основные симптомы дифтерии. Описаны и другие токсины бактериального и растительного происхождения, ингибирующие синтез и функциональную активность белков путём АДФ-рибозилирования или модификации рРНК. Г. Интерфероны Интерфероны - небольшие белки (гликопротеины), состоящие примерно из 160 аминокислотных остатков. Они сеьфетируются некоторыми клетками позвоночньж в ответ на заражение вирусами и препятствуют распространению вирусной инфекции. Этот класс белков синтезируется в исключительно малых количествах: от на-нограммов (1-9г) до пикограммов (10_12г), но является очень активным неспецифическим противовирусным агентом (106-109 единиц антивирусной активности на 1 мг белка). Это соответствует способности одной молекулы интерферона защищать от инфекции одну клетку. Некоторые компоненты вирусных частиц (например, двухцепочечная РНК) индуцируют синтез по крайней мере 3 типов интерферонов. У человека имеются 14 генов, кодирующих α-интерфероны, которые продуцируются В-лимфоцитами и макрофагами, 5 генов β-интерферонов, обеспечивающих образование соответствующих белков фибробластами, и 1 ген γ-интерферона, экспрессия которого идёт в Т-лимфоцитах. Связываясь с рецепторами на плазматической мембране заражённых клеток, эти белки, подобно белковым гормонам, стимулируют синтез ферментов, способных разрушать мРНК вирусов и прекращать синтез белков на рибосомах, препятствуя тем самым экспрессии вирусных генов в клетках эукариотов. Исследование механизма действия интерферонов показало, что они: ингибируют синтез белков, необходимых для репликации вирусов; стимулируют синтез фермента олигонуклеотидполимеразы, катализирующего образование небольших количеств коротких олигоаденилатов: 2',5'-олиго (А). Эти олигонуклеотиды являются активаторами рибонуклеазы - фермента, расщепляющего матричные и рибосом-ныеРНК; стимулируют синтез протеинкиназы, которая фосфорилирует и, тем самым, инактивирует фактор инициации eIF2: eIF2 + АТФ → eIF2-OPO3H2 + АДФ. В результате синтез всех белков в инфицированных клетках прекращается. Клетки погибают, но вместе с ними останавливается размножение вирусов, и начинается выздоровление. Таким образом, жертвуя небольшим количеством клеток, организм защищает себя от болезни. В настоящее время интерфероны, полученные промышленным путём с использованием техники клонирования генов, широко используют при лечении обычной простуды, гриппа, полиомиелита, ветряной оспы, герпеса, вируса гепатита и других инфекций. Хорошие результаты показывает использование интерферонов в терапии некоторых видов злокачественных опухолей, главным образом, гемобластозов (см. раздел 15), хотя их роль в химиотерапии опухолей до настоящего времени остаётся малопонятной. 185 181 :: 182 :: 183 :: 184 :: 185 :: Содер