Tehnologija rekombinantne DNK

1. Tehnologija
rekombinantne DNK
Seminarski rad iz predmeta
Molekularna genetika
Kadrić Melisa

2.  Rekombinantna DNK je
vrsta DNK koja nastaje
umjetnim putem.
 Ne postoji u prirodi, nego nastaje
laboratorijskom genskom
rekombinacijom različitih vrsta.
 Tehnologija rekombinantne DNA predstavlja niz
molekularno-genetičkih metoda uz pomoć kojih
je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice.
 Razdoblje rekombinantne DNA tehnologije
započelo je otkrićem restrikcijskih enzima,
70.-tih godina prošlog stoljeća.
 1978. dodijeljena je Nobelova nagrada za
fiziologiju i medicinu W. Arberu, H. Smithu i D.
Nathansu za njihov rad na otkriću restrikcijskih
enzima (endonukleaza).
Tehnologija rekombinantne DNA
naziva se i genetičko inženjerstvo;
predstavlja novu biotehnologiju
koja
se razvila u posljednje 2 decenije.

3.  Primjena ove tehnologije u fundamentalnim
istraživanjima je omogućila ogroman
napredak biohemije, ćelijske biologije,
genetike i drugih bioloških nauka.
 Ove tehnike su našle široku primjenu ne
samo u naučnim istraživanjima već u
mnogim drugim oblastima ljudske djelatnosti,
kao što su medicina, veterina, farmacija,
agronomija, šumarstvo zaštita životne
sredine, tako da u velikoj mjeri utiču na
poboljšanje kvaliteta života čovječanstva.

4. Osnovni postupci u tehnologiji
rekombinantne DNA
 Izolovanje genomske DNK i isjecanje
fragmenta DNK restrikcionim
endonukleazama.
 Ugradnja isječenog DNK fragmenta u
vektor za kloniranje (rekombinovana
DNK).
 Unošenje hibridnog molekula u ćeliju
domaćina (transformacija –bakterijska i
ćelija kvasca; ili transfekcija – animalna
ćelija)
 Kultivisanje kompleksa domaćin-vektor na
hranljivim podlogama radi dobijanja
klonova domaćina, tj. dobijanja brojnih
kopija fragmenta DNK ugrađenog u
vektor.
 Identifikacija i selekcija ćelija koje sadrže
određeni fragmet DNK i njegovo
izolovanje (ubiranje klonova).

5. Restrikcijski enzimi
•Razdoblje rekombinantne DNK je
započelo otkrićem ovih enzima.
•To su enzimi koji sijeku DNK na tačno
određenim mjestima.
•Prisutni su u ćelijama bakterija štiteći
ih od virusne DNK.
•Ovaj fenomen prvi put su primijetili
italijanski mikrobiolozi Salvador Luria i
Giuseppe Bertani 1950-ih godina.
•Naime, oni su primijetili da jedna vrsta
faga (λ) koja uspješno raste u jednoj
lozi E. coli (označenoj kao E. coli C),
kada se unese u drugu lozu E. coli (E.
coli K) mnogo slabije raste.
•Werner Arber i Matthew Meselson
su pokazali da se radi o restrikciji
pod kontrolom enzima, pa odatle i
naziv restrikcijski enzimi.

6.  Restrikcijski enzimi ili endonukleaze su
oni enzimi koji su sposobni razdvajati (sjeći)
sekvence baznih parova na bazno-specifičnim
mjestima u molekuli DNK.
 Restrikcijski enzimi režu (sijeku) molekulu
DNK na određene bazne sekvence tako da
svaki do sada izolirani enzim ima "svoju"
prepoznatljivu sekvencu koju izdvaja.
 To omogućava usmjereno „parčanje“ DNK pri
čemu nastaju definirani dijelovi određene
dužine i poznatih krajnjih sekvenci.• Pomoću ovih biološki aktivnih su
pstanci moguće je izdijeliti duge
makromolekule DNK
u fragmente koji su pogodni za d
alje manipuliranje.
• Specifičnost mjesta rezanja omo
gućava bolje upoznavanje specifi
čne strukture pojedinih sekvenci
DNK.

7.  Pomoću ovih biološki aktivnih supstanci moguće je izdijeliti
duge makromolekule DNK u fragmente koji su pogodni za
dalje manipuliranje.
 Specifičnost mjesta rezanja omogućava bolje upoznavanje
specifične strukture pojedinih sekvenci DNK.

8.  Ovi enzimi nose troslovne nazime koji
predstavljaju skraćenice od imena
bakterije iz koje su izolovani.
 Npr. Enzim izolovan iz bakterije E.
coli nosi naziv Eco, enzimi z bakterije
Bacillus amyloliqucfacicns je Bam.

9. Vektori
 U popularnom jeziku genetičara vektor se često naziva genfer.
 Poznajemo različite vektore, ali isto tako i različite forme prenošenja
strane DNK u jedan drugi živi organizam.
 Vektor može biti samo jedana noseća molekula strane DNK, ali isto tako
može dodatno samostalno realizirati transfer gena u ciljanu stanicu.
 Zajedno sa kloniranom DNK on čini rekombiniranu DNK molekulu.
Najpoznatiji vektorski sistemi u genetici su:
plazmidi, bakteriofagi, virusi, kosmidi i bakterije.

10. PLAZMIDI KAO VEKTORI
 Plazmidi su mali kružni molekuli dvolančane
DNA koji se prirodno nalaze u bakterijama i
ćelijama kvasca, a repliciraju se nezavisno od
genoma.
 Oni često sadrže neke za bakteriju veoma važne
gene, kao što su geni koji obezbjeđuju otpornost
na antibiotike.
 Plazmidi koji se koriste kao vektori za kloniranje,
najčešće su modifikovani tako da najbolje
zadovolje potrebe eksperimentatora.

11. Tipičan plazmidni vektor sadrži:
 replikativni početak koji omogućuje
replikaciju plazmidne DNK u ćeliji
domaćinu,
 bar jedan gen koji obezbjeđuje otpornost
ćelije domaćina na određeni antibiotiK,
tako da se ćelije u koje je unsen plasmid
mogu razlikovati po osjetljivosti na dati
antibiotik.
 restrikciona mjesta čije prisustvo
omogućuje da se ispitivani fragment DNA
dobijen uz pomoć jedne restrikcione
endonukleaze može lako ugraditi u
plazmidnu DNK koja se zate potrebe
presijeca istim enzimom.

12. Stvaranje rekombinantnog plazmida

13. Bakteriofag λ
 Za kloniranje nešto dužih segmenata DNK kao
vektor se najčešće koristi bakteriofag λ.
 Ovaj virus može poslužiti kao pogodan vector zbog
toga što se trećina njegovom genoma može
zamijeniti stranom DNK, a da to ne utiče na
virulenstnost, tj. sposobnost virusa da inficira
bakterijsku stanicu.
 Genom ovog virusa je linearna DNK molekula u
kome su strukturni geni za protein virusnog
omotača smješteni u desnom i lijevom kraju, a
sredina virusne DNK se može za potrebe kloniranja,
zamijeniti restrikcionim mjestima za različite
enzime.
 U ćeliji domaćinu replikuje se
virusni genom, sintetišu protein
omotača I pakuju nove virusne
partikule koje će lizirati
bakterijsku ćeliju.

14. KOZMIDI KAO VEKTORI
Za potrebe kloniranja velikih fragmenata DNK konstruisani su kozmidi, kao
vektori koji predstavljaju kombinaciju korisnih osobina plazmida i
bakteriogafa.
Plazmidi sa tzv. cos mjestima su kozmidi (cos mjesto čini jednolančana
DNA od 12 baza, to su kohezivni ili ljepljivi krajevi, takva mjesta ima u svom
genomu fag lambda).
To su mali molekuli DNK koji sadrže:
*replikativni početak plazmida,
*jedan ili nekoliko markera za selekciju,
*više različitih restrikicionih mjesta u koje se može graditi ispitivani fragment
DNK,
*i dijelove genoma bakteriofaga koji su neophodni za in vitro pakovanje u
virusni omotač.
Kozmidi se
u bakterijama replikuju na
sličan način kao plazmidi.

15. Eukariotski vektori (YAC plazmid)
 Stanica kvasca, S. cerevisiae, ima prirodni
plazmid oko 2 mm dužine, pa se takav plazmid
koristi za unos gena.
 To se radi na sljedeći način:
konstruira se bakterijski plazmid sa CEN (centromer)
regijom i izvorom replikacije kvasca i telomernom
sekvencom kromosoma kvasca.
Tako konstruirani plazmid je YAC.
YAC može nositi veliki dio strane DNA
(250 - 2000 kb i više;
to je vrlo pogodno za eukariotske gene) koja se
prenosi iz generacije u generaciju u stanici kvasca.

16.  Željeni dio DNK molekuje jednog organizma
isijeca se uz pomoć restrikcijskih endonukleaza.
 Taj isječeni dio se potom ugrađuje u plazmid.
 Plazmidi, kao ekstrahromosomski elementi, služe
kao vektori.
 Za reakciju spajanja vektorske i strane DNK
upotrebljava se naziv rekombinacija in vitro, dok
se produkt reakcije naziva rekombinantnom
DNK.
 Da bi se molekule rekombinantne DNK
autonomno replicirale, treba ih unijeti u
bakterijske ili kakve druge za to prikladne stanice.

17. LIGAZE —
MOLEKULARNO LJEPILO
Ligaze su takođe skupina
bitnih enzima u ovom
procesu.
Repariraju uništene
fosfodiesterske veze, bilo da
se radi o slučajnim prekidima, ili pri
rekombinaciji DNK molekule.

18. Većina mikroorganizama, koji bi mogli poslužiti kao domaćini, ne dozvoljava
unošenje strane hibridne molekule DNK u svoju citoplazmu.
Ovaj problem riješen je 1970.god. kada su M. Mandel i A. Higa, obradili ćelije
E. coli otopinom kalcijevog hlorida, nakon čega su one mnogo djelotvornije primile
DNA faga λ.
Nakon toga, Stanley Cohen i Annie Chang su utvrdili da se i molekuje plazmida mogu
bez problema unijeti u ćeliju E. coli ukoliko se ona obradi navedenom otopinom.
Time je omogućena in vitro hibridizacija molekula DNK.