2. • Kultura biljnih ćelija, tkiva i organa in vitro predstavlja skup tehnika
gajenja biljaka (cijelih biljaka, sjemena, embriona) i biljnih dijelova
(ćelija, protoplasta, eksplantata, tkiva, organa) u kontrolisanim, sterilnim
uslovima i na definisanim hranljivim podlogama.
• Zasniva se na sposobnosti ćelija da se razvijaju van organizma (in vitro, što
znači “u staklu”, mada sudovi za gajenje ne moraju biti od stakla).
• Metoda kulture biljnih stanica i tkiva podrazumijeva laboratorijski uzgoj
stanica, tkiva, organa i kompletnih organizama na umjetnim hranidbenim
podlogama i u aseptičnim uvjetima.
• Ta je tehnika postala nezaobilazna u primjeni genetičkog inženjerstva na
biljkama te kao metoda alternativna hemijskim metodama u svrhu
dobivanja bioloških vrijednih spojeva koji se koriste u npr. farmaciji i
medicini.
3. Na vrlo malom prostoru moguće je proizvesti veliki broj sadnica, a od samo
jedne majčinske biljke moguće je proizvesti i do 20 miliona sadnica.
Metodom razmnožavanja biljaka, koje su dobivene izoliranjem meristemskog tkiva iz
vršnih pupova, moguća je proizvodnja sadnog materijala oslobođenog patogenih klica,
posebice virusa koji su danas vrlo veliki problem u npr. voćarstvu ili vrtlarstvu.
Posebno je zanimljivo što se na ovaj način mogu uzgojiti mnoge biljne vrste
kojima u prirodi prijeti izumiranje, čime bi se moglo pridonijeti očuvanju
biološke raznolikosti ukoliko bi to dozvolile i potaknule nadležne institucije.
4. HISTORIJAT
• Osnove kulture biljnih ćelija i tkiva
postavili su Šlajden i Švan 1838.
godine postavivši tzv. “teoriju
totipotencije” koja kaže da su ćelije
svih živih organizama autonomne i,
u osnovi, sposobne da regenerišu
čitav organizam.
• Rodonačelnikom ove oblasti ipak se
smatra austrijski botaničar Gotlib
Haberland koji se bavio fiziološkom
anatomijom biljaka, iznio je ideju o
kulturi ćelija. On je doveo do
REVOLUCIJE u Fiziologiji biljaka
jer je otkrio moguće procese
KLONIRANJA BILJAKA.
Matijas Šlajden Teodor Švan
5. Haberland je prvi pokušao da izoluje ćelije iz biljke i odgaji ih u
uslovima in vitro, van organizma. Nije u tome uspio.
Ćelije su preživljavale neko vrijeme, ali se nisu dijelile.
Haberland nije uspio zato što je:
izolovao prilično diferencirane ćelije koje je mogao lako da
izoluje, ali koje su izgubile moć dediferencijacije
(palisadne ćelije lista, filamenti prašnika, korenske dlake,
ćelije zatvaračice stoma). Te ćelije su visoko diferencirane i
ne dijele se ni u biljci, odnosno zahtijevaju stimulatore
rastenja da bi se dediferencirale i dijelile.
Pravio je podloge za gajenje ćelija prema tadašnjim
znanjima o potrebama ćelije za mineralnim solima.
Dodavao je mineralnim rastvorima neke organske materije,
ali nije znao ništa o vitaminima i fitohormonima.
Nekoliko godina kasnije Currel, Burrows i Harrison su
uspjeli da odgaje životinjske i ljudske ćelije u kulturi
(1907. – kultura fibroblasta).
6. Za razliku od kulture animalnih ćelija, koja je doživjela nagli razvoj 20-tih i 30-tih
godina 20 vijeka, kultura biljnih ćelija je zaostajala u razvoju zbog kasnog otkrića
biljnih hormona .
Međutim, kasnije se ona naglo razvila i našla primjenu u veoma bitnim oblastima
primenjene biologije.
7. PRIMJENA
Od 1990. god. pa do danas, razvoj kulture biljaka in
vitro usmjeren je uglavnom na primjenu:
U naučnim istraživanjima (u eksperimentalne
svrhe) omogućava dobijanje genetički
uniformnog i fiziološki homogenog biljnog
materijala u velikim količinama i gajenje u
kontrolisanim uslovima a uz minimalno ulaganje
prostora i novca,
U poljoprivredi, hortikulturi i šumarstvu –
omogućava masovnu proizvodnju sadnog
materijala.
U zaštiti sredine – omogućava očuvanje,
razmnožavanje i reintrodukciju u prirodna
staništa endemičnih, ugroženih i rijetkih vrsta
biljaka,
U biotehnologiji “Green biotechnology” (ili
biotehnologija biljaka),
Korišćenje biljnih kultura za proizvodnju
biorazgradive plastike, biodizela i sličnih
proizvoda,
Eksploatacija sekundarnog metabolizma biljaka
(za potrebe farmacije i medicine; bioreaktori),
Reciklaža otpada, čišćenje zagađenih sredina
Dobijanje i upotreba genetički modifikovanih
organizama (GMOs)
8. Metoda kulture tkiva i biljnih stanica “in vitro” koristi se za vegetativno
razmnožavanje brojnih biljnih vrsta, posebno onih koje:
• stvaraju malu količinu sjemena,
• čije sjeme ima slabu klijavost
• ili onih koje se teško razmnožavaju vegetativnim putem.
Npr. Orhideje je umjetno moguće razmnožiti jedino na ovaj način
(iz sjemena).
One stvaraju velike količine sjemena ali u prirodi njihovo sjeme može klijati
samo u simbiozi s gljivama. Simbioza im je potrebna zbog toga, što sjeme
orhideja nema ili ima vrlo mali endosperm te pomoću gljiva dobivaju
hranjiva potrebna za klijanje. In vitro metodom će im hranjiva podloga
može nadoknaditi potebne hranjive tvari.
9. Dio koji se izoluje iz biljke i uvodi u kulturu naziva se primarni eksplantat.
Primarni eksplantati mogu biti pojedinačne ćelije, isječci iz tkiva ili cijeli organi.
Terminom eksplantat označava se dio biljke koji se, u uslovima in vitro, prenosi na svježu
podlogu radi daljeg razmnožavanja ili održavanja kulture ili dobijanja novih struktura.
Jedna od osnovnih ‘’zakona’’ kultivisanja biljaka u uslovima in vitro jeste sterilnost.
To znači da moraju biti sterilni:
Biljni materijal (primarni eksplantati i eksplantati)
Hranljive podloge
Prostor u kojem se obavljaju manipulacije (laminar)
Instrumenti, posuđe i voda sa kojima se radi
STERILNOST KULTURA znači oslobođenost ne samo od mikroorganizama,
već od svih živih organizama osim biljaka.
TEHNIKE
10. Zagađivači biljnih kultura in vitro su virusi,
bakterije, kvasci, gljivice, crvi i grinje.
Grinje nisu same po sebi opasne po biljke
(ne hrane se njima), već unose
mikroorganizme u kulture.
Biljni materijal se steriliše hemijski, spolja,
jer se pretpostavlja da je zdrava biljka
sterilna iznutra.
11. HRANLJIVE PODLOGE
Sastav hranjivih podloga varira u zavisnosti od biljne vrste, biljnog
materijala i cilja koji želimo da postignemo ali postoje osnovni zahtjevi za
pripremu hranljivih podloga.
Podloga mora da sadrži sledeće sastojke:
1.Vodu - Mora biti prečišćena jer obična destilovana voda može da sadrži otrovne sastojke
(metale i dr.). Upotrebljava se voda destilovana u staklu (bidestilovana voda) ili
dejonizovana voda.
2. Izvor mineralnih soli - ima više rastvora, svaki se koristi za drugu svrhu.
Najviše se koristi MS rastvor (Murashige and Skoog, 1962). MS sadrži
makro i mikro elemente.
Murašige i Skug su ispitali na duhanu veliki broj kombinacija raznih soli.
Dobili su optimalne koncentracije za svaku so i kombinovali dalje. Na kraju
su došli do odgovarajuće kombinacije katjona i anjona.
12. 3. Izvor ugljenika (izvor energije) - Najćešće se dodaje 3 - 5% glukoza ili 2 - 4% saharoza.
4. Vitamine - Uvijek se dodaju B1, B6 i nikotinska kiselina. Ponekad se dodaju biotin,
pantotenska kiselina, folna kiselina - prema potrebi.
5. Organska azotna jedinjenja - Nisu obavezna ali se često dodaju. Dodaje se hidrolizat kazeina
(dobijen iz mlijeka enzimskom hidrolizom) ili pojedine aminokiseline. Biljna tkiva bi mogla
da rastu i bez ovih organskih jedinjenja.
6. Organske dodatke -Najčešće se dodaje kokosovo mlijeko. Ono je kompleksnog sastava i može
da zamijeni zahtjeve za citokininima
7.Hormone - Svaki biljni dio i vrsta mogu imati specifiične zahtjeve. Za započinjanje kultura
citokinini i auksini su neophodni. Ostali hormoni se dodaju prema potrebi ali oni nisu
neophodni za održavanje trajnih kultura.
Svi prethodni sastojci se utope u agar koji učvršćuje podlogu i omogućava potporu za
tkivo (podloga se onda naziva čvrstom podlogom). Agar NIJE u potpunosti inertna
podloga. Ako se ne doda agar, stavlja se u tečnu podlogu neki drugi držač za tkivo
npr.mostić od filterpapira, držač od zubarske žice, ili komercijalni plastični držači.
Podloge se sterilišu u autoklavu na 120° C, 20 minuta.
13.
14. Manipulisanje biljnim materijalom u
kulturi in vitro obavlja se u sterilnim uslovima,
u laminaru.
LAMINAR = aparat za filtraciju vazduha. U radni
prostor laminara uduva se sterilni vazduh, a
manipulacije se obavljaju u struji sterilnog
vazduha. Radni prostor laminara dezinfikuje se
96% etanolom.
Instrumenti za rad u sterilnim uslovima se sterilišu
kuhanjem u vodi (najmanje 20 min), a zatim
uranjanjem u teglu sa 96% etanolom ili suhom
sterilizacijom (120° C, 20 minuta).
Neke bakterije mogu da prežive u alkoholu pa
treba redovno mijenjati alkohol.
15. FIZIČKI USLOVI KOJI SE KONTROLIŠU
Svijetlost (dužina dana, kvalitet)
Temperatura (obično se održava
konstantnom temperatura od 24
do 26° C, ali ponekad specifični
procesi i kulture zahtijevaju niže
temperature; bitno je da je
temperatura kontrolisana)
Vlažnost vazduha
Provjetravanje odnosno
razmjena gasova (dobra aeracija
bitna je za gajenje kultura u
tečnim medijumima jer kiseonik
utiče na disanje)
16. POSTUPAK
1. Priprema hranljive podloge
Sastojke miješamo prema određenoj recepturi te ih zagrijavamo do temperature
95-98 º C. Mjerimo pH vrijednost otopine koja za većinu vrsta treba iznositi oko
pH 5-6 te vršimo korekcija pH dodavanjem kiseline ili lužine prema potrebi.
Pripremljenu otopinu razlijemo u dno staklenki, koje nakon toga složimo u uređaj
za sterilizaciju (autoklav).
2. Nakon provedene sterilizacije pripremamo majčinske biljke za uvođenje u kulturu “in
vitro”.
Odabiremo sortno čiste i zdrave biljke te pripremamo početni material za
razmnožavanje (eksplantat).
3.Izdvojen eksplantat brzo se prebacuje na pripremljenu hranjivu podlogu, kako bi se
izbjeglo isušivanje tkiva. Staklenke se slažu u klima komoru u kontrolirane uvjete
(temperature, vlage i svjetlosti) te u njoj započinje proces razmnožavanja.
Nakon određenog vremena biljke se vade iz staklenih posuda, čiste od medija i dijele,
kako bi se mogle staviti na ukorjenjivanje.
4.Priprema se nova hranjiva podloga, za ukorjenjivanje, koja sadrži hormon auksin.
Auksin zaustavlja postrani rast i razmnožavanje biljke, a potiče stvaranje korijena.
5. Hranjiva otopina se ulijeva u
nove staklenke te se u svaku presađuje po nekoliko
biljaka.
Staklenke se zatvaraju i ponovo vraćaju u klima komoru.
