Metode penentuan parameter spesifik obat bahan alam mencakup penetapan senyawa marker, kadar golongan metabolit sekunder, dan kelarutan ekstrak dalam etanol dan air. Parameter utama yang ditetapkan antara lain profil KLT untuk mendeteksi senyawa aktif, penetapan kadar senyawa marker secara kuantitatif, dan penetapan kadar total golongan seperti fenolat, flavonoid, alkaloid untuk menunjukkan kandungan metabolit sekunder.

1. (metode uji parameter spesifik)
STANDARISASI DAN
PENENTUAN MARKER OBAT
BAHAN ALAM
TIM DOSEN STANDARISASI & PENENTUAN MARKER OBA 2020

2. PENENTUAN PARAMETER SPESIFIK ADALAH
aspek kandungan kimia (baik kualitatif maupun
kuantitatif) yang bertanggung jawab terhadap aktivitas
farmakologi tertentu
Ginko biloba Ginkolida mencegah kepikunan
+ flavonoid tertentu
sinergisme
lempuyang gajah
(Zingiber zerumbet)
lempuyang pahit
(Zingiber littorale)
kurkumin
gingerol
tidak terdeteksi
terdeteksi
zerumbon
terdeteksi
menghambat
sel neoplasma
terdeteksi

3. Senyawa marker aktivitas farmakologi
Standarisasi
kadarnya???
Senyawa aktif
Senyawa utama (mayor, dominan, >>)
kriterianya:
Senyawa identitas (khas, unik, eksklusif)
Senyawa aktual

4. Kriteria Senyawa Marker
• Senyawa aktif : senyawa yang langsung bertanggungjawab terhadap
aktifitas misalnya saponin ginsenosida pada tanaman ginseng (Panax
ginseng)
• Senyawa utama : atau major compound yakni senyawa yang secara
kuantitatif dominan di dalam suatu tanaman obat. Contohnya kurkuminoid
di dalam rimpang kunyit (C.longa) meskipun bukan yang bertanggung
jawab secara langsung terhadap aktifitas farmakologi
• Senyawa identitas : senyawa yang khas, unik, eksklusif hanya terdapat
pada suatu tanaman obat, misal lunamarin, lunakrin dan lunasin yang
terdapt pada sanrego (Lunasia amara)
• Senyawa aktual : senyawa apapun asalkan terdapat di dalam tanaman yang
di analisis

5. Profil KLT
Penetapan kadar marker
Penetapan kadar total golongan
senyawa metabolit
Kelarutan ekstrak dalam
etanol dan air
1
2
3
4
Ketentuan umum mutu ekstrak menurut DEPKES-BPOM
(2000, 2004) menyebutkan bahwa aspek yg harus
ditetapkan pada parameter spesifik adalah:

6. Profil KLT
• Tujuan : menunjukkan setidaknya senyawa aktif (marker) betul ada di
dalam ekstrak atau secara kimiawi otentik yakni berasal dari tanaman yang
benar.
• Parameter : senyawa marker muncul sebagai bercak terpisah
• Permasalahan :
1. Marker muncul tidak sebagai bercak tunggal meskipun senyawa
pembanding otentik tersedia
2. Tidak tersedia marker yang otentik
Profil KLT ini merupakan analisis kualitatif pendahuluan, kegagalannya
menghentikan dalam upaya kuantitatifnya.

7. • Keberhasilan memunculkan profil KLT senyawa target dipengaruhi
oleh :
1. Sistem kromatografi (Fase diam dan fase gerak)
2. Jenis pelarut (thdp senyawa target dlm ekstrak)
3. Jumlah penimbangan ekstrak (terlalu kecil, marker tidak terbaca →
jumlah penimbangan hrs ditingkatkan)
4. Pemilihan metode visualisasi → cara fisika (sinar UV 254/366) lalu
cara kimia (reagen spesifik/semprot)

8. Sistem kromatografi (fase normal)
• Fase diam : KLT silika gel GF254
• Fase gerak :
1. Normalnya → CHCl3 : MeOH (MeOH <20%)
2. Komposisi lain → heksan : etil asetat ( 7:3, 5:5, 3:7)
3. Untuk memisahkan senyawa inti aromatik → aseton :benzen (benzen >aseton)
4. Untuk golongan alkaloid → metanol, kloroform atau heksan dengan salah satu komopenen yang
bersifat basa (dietilamin atau beberapa tetes amonia)
5. Senyawa yang terlalu polar (polifenol sederhana, glikosida steroid, glikosida flavonoid) →
kloroform:metanol dengan penambahan sedikit air. Jika terlalu polar menggunakan metanol :asam
asetat glasial:air:asam formiat (rasio asam kecil)
6. Untuk mempertajam pemisahan bisa ditambahkan beberapa tetes asam lemah atau basa lemah

9. Sistem kromatografi (fase terbalik)
• fase diam: C18 yang terikat silika
• fase gerak:
1. metanol:asetonitril (1:1, 3:1, 2:1)
2. metanol:asetonitril: air (2:2:1 atau 1:2:1)
sistem ini digunakan jika sistem fase normal tidak memberikan hasil
yang baik

10. Penetapan kadar marker
• Tujuan : menunjukkkan secara kuantitatif kadar dari senyawa marker yang
ada di dalam ekstrak sehingga bisa ditentukan berapa jumlah senyawa yang
bertanggung jawab terhadap aktifitas farmakologi di dalam ekstrak
• Parameter : terbacanya senyawa target pada kadar tertentu
• Permasalahan :
1. Senyawa target tidak berwarna
2. Senyawa marker tersedia dalam jumlah terbatas
3. Bentuk peak pada pembacaan densitometer maupun HPLC tidak terbatas
4. Linearitas dan reprodusibilitas rendah

11. Penetapan kadar total golongan metabolit
• Tujuan : menetapakan kadar total golongan metabolit sekunder tertentu
, misal : fenolat, flavonoid, alkaloid, antrakinon, kumarin, saponin
• Parameter : kadar metabolit sekunder pada range tertentu
• Permasalahan :
1. Golongan senyawa tidak ada/terdeteksi
2. Beberapa metode standar tidak aplikatif
3. Tidak semua instrumen bisa diterapkan untuk analisis kadar total
4. kadar yang diperoleh tidak spesifik (>50%)

12. Golongan metabolit
sekunder yang harus
ditetapkan
(dalam parameter mutu
ekstrak Indonesia )
1. Golongan fenolat
2. Golongan flavonoid
3. Golongan saponin
4. Golongan minyak atsiri
5. Golongan tannin
6. Golongan alkaloid
7. Golongan steroid
8. Golongan kumarin

13. Kadar fenolat total
• uji pendahuluan: FeCl3 → warna hijau sampai hitam
• Kadar fenolat total dinyatakan dalam mg fenolat yang setara dengan
asam galat (gallic acid equivalent) dalam gram ekstrak
• ekstrak dibuat dlm konsentrasi 1%
• pembanding: asam galat
• pereaksi: folin ciocalteu dan Na2CO3 7%
• Ukur absorbansinya dengan spektrofotometri dengan panjang
gelombang 749,5 nm

14. Kadar Flavonoid total
• Uji pendahuluan: sitroborat → floresensi kuning dibawah UV366
• penetapan kadar:
1. Metode Chang : pereaksinya → AlCl3 dan kalium asetat. absorbansi
diukur menggunakan spektrofotometer pada 437 nm. Kandungan total
dinyatakan dengan quersetin equivalent (%)
2. Metode Zhou : pereaksinya → NaNO2, AlCl3 dan NaOH. absorbansi
diukur menggunakan spektrofotometer pada 510,5 nm Kandungan
total dinyatakan dengan rutin equivalent (%).

15. Cara lain utk uji Kuantitatif Flavonoid:
1. KCKT / HPLC
2. GC: Flavonoid dirubah menjadi turunan termetilasi
atau tertrimetisilisasi dan pembuatan turunan ini
memungkinkan juga pengukuran spectrum massa.

16. lanjutan...
Penentuan secara Kuantitatif : KADAR FLAVONOID
Catatan:
- Lakukan percobaan blanko
- Perlu pembanding umumnya Quersetin/Rutin
Serbuk Simplisia Eks. MetOH
MeOH, air,
saring
Abs ukur 415 nm
+ camp. AlCl3 dan As. Asetat
diamkan 30 menit

17. Saponin total
• Uji pendahuluan: penggojogan larutan ekstrak dengan solven semula,
membentuk buih stabil lebih dari 15 menit
• penetapan kadar:
1. darah sapi segar + Na sitrat + dapar fosfat + larutan ekstrak.
2. Hemolisis darah ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi
jernih/transparan
• Hasil pembacaan dinyatakan dengan indeks saponin yaitu
perbandingan antara kadar ekstrak terkecil yang memberikan
hemolisis dengan saponin standar terendah yang memberikan
hemolisis

18. Penetapan Alkaloid (Kuantitatif)
Gravimetri
Ekstraksi
Timbang Pengendapan
Timbang
Spektrometri
Ekstraksi
Ukur Absorban
Titrimetri
Ekstraksi
Asam basa TBA
KCKT / HPLC

19. Alkaloid total
• Uji pendahuluan: Mayer/Dragendorff → endapan
• penetapan kadar:
larutan ekstrak + asam asetat 10%, kocok, saring dgn kertas saring
yg sudah ditimbang → filtrat dipekatkan + ammoium hidroksida →
terbentuk endapan → endapan dicuci lagi dgn ammoium hidroksida →
endapan dikeringkan pada 60 C, 30 menit, dinginkan → endapan
ditimbang ad bobot konstan → hitung rendemen alkaloid
• Kelemahan: senyawa non alkaloid berunsur Nitrogen akan turut
mengendap

20. Penetapan Kadar Alkaloid
Contoh: Penetapan Kadar Kulit delima
Simplisia Erlenmeyer
tutup
Filtrat masuk corong pisah
Eter, NaOH
Kocok, saring
1 mL HCl 0,025 N
3, 675 mg alkaloid
Lap. Eter
ad 50 mL
Metil jingga,
Titer dgn HCl 0,025 N

21. Minyak atsiri total
• Uji pendahuluan: secara organoleptis → bau khas atau ekstrak
diteteskan pada kertas perkamen → komponen terpisah, tidak tampak
noda
• Penentuan Secara Kuantitatif: Destilasi uap dan Stahl (air) pelarut air
dinyatakan sebagai % V/b.
• penetapan kadar: ekstrak + air suling → labu dipanaskan → penyulingan
selesai, dinginkan >15 menit → volume atsiri dlm buret dicatat. kadar
atsiri dihitung dalam %.
• Kadar minyak atsiri tidak boleh lebih dari 1% v/b (jika komponen non
volatil yg diutamakan dlm ekstrak)

22. Kumarin total
• Uji pendahuluan: larutan ekstrak diidentifikasi di bawah UV 366 →
adanya fluoresensi kuning kebiruan
• Penetapan kumarin total dgn metode fluorometri yg dimodifikasi
menjadi spektrofotometri UV:
larutan ekstrak 1% + NaOH → ukur absorbansi 331 nm.
pembanding yg digunakan adalah kumarin 0,1%.

23. Steroid (triterpen) total
• Penetapan kadar total steroid/triterpen tidak dilakukan
tetapi sebaiknya penetapan dilakukan berdasarkan
marker sterol tertentu dengan metode densitometer
atau GC

24. Antrakinon
Cara penetapan kadar:
• Ekstrak + air panas, diamkan 5 menit, didinginkan → ekstraksi dgn
benzen → Lapisan benzen dipisahkan→ Lapisan air + FeCl3 dan HCl →
panaskan di penangas air selama 10 menit, dinginkan→ diekstraksi
dengan benzen 3x → Lapisan benzen diuapkan→ residu + KOH 5% →
Absorbansi diukur pada panjang gelombang 506 nm
• pembanding: aloin
• Kadar antrakinon total dinyatakan sebagai aloin equivalent

25. ANTRAKUINON (lanjutan)
Penentuan Secara Kuantitatif: KADAR ANTRAKUINON
Simplisia Eks. Benzen
Benzena
Ukur abs
pada 515 nm Lart. warna
Pakai pembanding
Uapkan
+ Lart. KOH

26. Kadar tanin total
• Ditetapkan kadarnya secara titrimetri (titrasi)
• uji pendahuluan: FeCl3 → Tanin terhidrolisis (tanin galat), warna larutan
biru kehitaman; Tanin terkondensasi (proantosianidin), warna hijau
kehitaman
• penetapan kadar: Titrasi dilakukan dengan kalium permanganate
(KMnO4) dengan ditambahkan indigo sulfonat, larutan dititrasi sampai
warna kuning emas (pembanding: asam galat)
• cara lain dgn metode spektrofotometri: Vanilin/EtOH, Ukur pada 530 nm
• Kadar fenol total + Folin Ciocalteu  Ukur ada 765 nm

27. Lanjutan ....
Serbuk Simplisia
Filtrat kumpulkan
dalam labu takar
Didihkan, saring
Penyarian sempurna
Cek dengan lart.Fe(III)
Kadar tanin:
1 mL KM04 0,1N
0,004157 g tanin
10 mL Filtrat
Indigosulfonat lart.
Berwarna biru
Titrasi dengan KMO4 0,1N
TA: kuning emas

28. Kadar ekstrak larut dalam air dan etanol
tujuan: mengkalkulasi persentase senyawa polar, semipolar-nonpolar
yang terkait aktivitas farmakologi
1. Metode penetapan kadar sari larut air
ekstrak dimaserasi dengan air:kloroform selama 24 jam sambil
dikocok pada 6 jam pertama→ diamkan 18 jam dan disaring → Filtrat
air diuapkan dalam cawan yg telah ditara→residu dipanaskan pada
suhu 105 C hingga bobot tetap.
Kadar sari larut air dihitung dalam persen terhadap ekstrak awal

29. 2. Penetapan kadar sari larut etanol
cara: ekstrak dimaserasi dengan etanol 96% selama 24 jam sambil 6
jam pertama dikocok → Didiamkan selama 18 jam dan disaring
cepat → Filtrat diuapkan pada cawan porselen → residu dipanaskan
pada suhu 105 C sampai bobot tetap.
Kadar sari larut etanol dihitung dalam persen terhadap ekstrak awal

30. info@uhamka.ac.i
d
www.uhamka.ac.id (021)73944451 uhamkaid Uhamk
a
@UhamkaID
TERIMAKASIH