quy trình chiết tách và lựa chọn phương pháp xác định hoạt độ enzym protease (ficin) từ nhựa thân cây sung Việt Nam

1. Đề Bài
Trình bày quy trình chiết tách và lựa chọn phương pháp xác định hoạt độ enzym
protease (ficin) từ nhựa thân cây sung Việt Nam.

2. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ENZYM FICIN
❖ Enzym Ficin là gì?
- Ficin (Ficain) là một protease được tìm thấy trong nhựa cây thuộc họ ficus
(sung, vải), thuộc họ moraceae.
- Protease là enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid (CO-NH)
trong các phân tử polypeptid, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các
amino acid tự do hoặc các peptid phân tử thấp.

3. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ENZYM FICIN
❖ Cấu tạo hóa học:
- Ficin là 1 loại protease thực vật trong cấu trúc bậc 1 có chứa nhóm -SH, trình tự
gần trung tâm phản ứng như sau: Pro-Leu-Arg-Gln-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys-
Tryp-
- Thành phần của ficin sẽ khác nhau tùy nguồn thu.

4. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ENZYM FICIN
❖ Tính chất vật lý:
- Trọng lượng phân tử: 23000 - 27000
- Nhiệt độ hoạt động: 30 - 80°C. Nhiệt độ tối ưu: 50-65°C
- Hệ số sa lắng: 2,5-2,7S
- Điểm đẳng điện: 9-10
- Không tan trong dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước.
❖ Tính chất hóa học:
- pH hoạt động: 4-9,5. pH tối thích phụ thuộc vào cơ chất của enzym: gelatin là 5,
casein là 9,5, hemoglobin là 7, các cơ chất nhân tạo là 6,5.
- Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxy hó bởi không khí làm cho dịch nhựa chuyển
thành màu hồng nâu và hoạt tính xúc tác bị giảm xuống.

5. ĐẶC ĐIỂM NGUỒN NGUYÊN LIỆU
Hình dáng bên ngoài:
- Cây sung là cây thân gỗ nhỡ, vỏ cây màu
trắng hoặc xám, nhẵn, tán lá rộng xum xuê.
- Cao khoảng 25 – 30m, đường kính thân
cây khoảng 50 – 60cm.
- Cành: Cành sung ở dưới gốc to và già hơn
có nhiều u cục xù xì, cành ngọn nhỏ và
ngắn dần.

6. - Lá: Lá sung có hình trứng hoặc hình mũi
mác nhưng dài và nhọn ở hai đầu, dài
khoảng 10 – 12cm, rộng khoảng 5 – 6cm,
khi còn non lá có màu xanh lá mạ và có
lông tơ bao phủ, khi lá già Đặc điểm của
cây Sung
- Hoa: Hoa của cây sung thường ra theo
cụm, ra từ những cành già, thân cây hoặc
ngọn cành.
- Quả: Quả sung thường mọc theo chùm.
Quả có hình cầu bẹp ở đáy quả, cuống
quả ngắn khoảng 1cm và hơi chum lên
giống như núm vú. Mép lá không răng
ĐẶC ĐIỂM NGUỒN NGUYÊN LIỆU

7. QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH ENZYM FICIN
Dịch nhựa
sung
Pha nước
cất
Khuấy bằng máy
khuấy từ trong 5
phút
Ly tâm tốc độ 3000
vòng/phút( 10 phút)
Thu dịch bên
trên
Thu lấy các
phân đoạn
Thu các phân
đoạn có hoạt
tính và đưa vào
lọc gel
Thu phân
đoạn
chế
phẩm
enzym
Loại bỏ tủa
Tủa phân đoạn
bằng ethanol
Xác định
hoạt tính
của các
phân đoạn
Xác định hoạt
tính của các
phân đoạn
Độn với
tinh bột tỉ
lệ 1:1
Sấy khô ở
40 độ C

8. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano
❖ Nguyên tắc:
Protein (casein) làm cơ chất. XĐ độ hoạt động phân giải protein của enzym trên
cơ sở XĐ lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng, bằng phản ứng màu
với TT folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương
ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzym.

9. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
Đơn vị hoạt động của proteolitic (casein) là lượng enzym mà trong 1h ở 30ºC có
khả năng phân giải protein tạo các sản phẩm hòa tan trong acid trichloroacetic
(TCA), cho phản ứng màu với TT folin – clocalteau.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với 1µg tyrosin. Hoạt
độ riêng của các chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt động proteolitic
trên 1ml protein chế phẩm.

10. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
❖ Chuẩn bị hóa chất:
+ DD cơ chất casein 1%: Cân 1g casein hòa tan trong 100ml dd đệm phosphat
0,1M có pH = 7, đun trên bếp điện cho đến lúc hòa tan hoàn toàn.
+ DD folin – clocalteau (0,1N): Hút 1ml dd folin – clocalteau 1N hòa tan trong 9ml
nước cất để được dd folin 0,1N.
+ DD Na2CO3 0,4M
+ DD acid trichloroacetic(TCA) 0,4M

11. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
❖ Cách tiến hành: chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống trắng.
+ Ống thí nghiệm:
➢ Cho 0,2ml cơ chất đã đạt đến 35ºC vào ống nghiệm giữ 5-10 phút ở nhiệt độ
35ºC, cho 0,2ml dd enzym (đã đạt được nhiệt độ 35ºC) tiếp tục giữ ở 35ºC
trong vòng 10 phút, cho ngay 0.4ml dd TCA, lắc đều trong 30 phút ở khoảng
nhiệt độ trên, đem đi ly tâm để loại tủa.
➢ Sau khi ly tâm lấy 0,2ml dịch nổi cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng
màu với TT folin – clocateau.

12. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
Xác định mật độ quang của dd:
Thêm 0,2ml dịch sau khi ly tâm vào 1ml dd Na2CO3 6% lắc đều. Thêm 0,2ml TT
folin 0,1N, lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành so màu trên máy
speckol với bước sóng 660 nm. Dùng cuvet thủy tinh.
+ Ống trắng:
Cho vào ống nghiệm 0,2ml cơ chất rồi thêm 0,2ml HCl, thêm tiếp 0,4ml TCA, lắc
đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ 35ºC, tiến hành ly tâm và các bước tiếp theo tương
tự như đối với ống thí nghiệm.

13. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosin: Dung dịch tiêu chuẩn tyrosin (mg/ml)
Cân chính xác 1mg tyrosin tinh khiết khô hòa tan trong một ít dd HCl 0,2N, cho
vào bình định mức 1ml và cho HCl 0,2N đến vạch định mức. Từ dd này pha loãng
tiếp tục bằng HCl 0,2N để nhận được dd có chứa 10µg/ml-70µg/ml.
Lập đồ thị tiêu chuẩn tyrosin:
➢ Từ dd đã pha loãng trên, lấy 0,2 ml cho vào ống nghiệm, thêm 1ml dd
Na2CO3 6%, thêm 0,2 ml TT folin 0,1N để 30 phút ở nhiệt độ phòng, so màu
với máy so màu ở bước sóng 660nm.
➢ Kết quả được thể hiện ở bảng: mật độ quang tương ứng với nồng độ tyrosin
và đồ thị đường chuẩn tyrosin.

14. PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM FICIN
Tính kết quả:
➢ Lấy số liệu đọc trên máy của mẫu thí nghiệm và mẫu trắng. Dựa vào đồ thị
đường chuẩn tính lượng µg tyrozin tương ứng.
➢ Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 0,2ml dd enzym đã lấy XĐ hoạt độ
theo CT:
Trong đó:
0,8: thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng (0,2ml cơ chất, 0,2ml dd enzym, 0,4ml dd
TCA).
t: thời gian để enzym tác dụng với cơ chất (30 phút)

15. ỨNG DỤNG CỦA ENZYM FICIN
1. Trong công nghiệp thực phẩm
- Trong công nghiệp thịt đồ hộp: làm mềm thịt tăng hương vị và giá trị thịt sau
khi chế biển.
- Trong công nghiệp chế biến sữa: dùng các protease làm đông tụ sữa
(renin), protease vi sinh vật khác (Bacillus wensentericus, Micor...) trong sản
xuất fomage.
- Công nghiệp nước giải khát, làm trong bia, rượu, nước quả.
- Công nghiệp nước chấm nước mắm rút ngắn quá trình thủy phân chế biển
nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá...

16. ỨNG DỤNG CỦA ENZYM FICIN
2. Trong y học:
- Làm thuốc sổ giun.
- Trị các bệnh do kst đường ruột gây ra.
- Loét da, đau họng.
- Dùng làm thuốc thử máu.
- Chữa nhức đầu và một số bệnh ngoài da như chốc, nhọt, sưng đau, tụ
máu…

17. ỨNG DỤNG CỦA ENZYM FICIN
3. Trong các lĩnh vực khác:
- Enzyme ficin có khả năng kìm hãm hiện tượng Melanosis (đốm đen) ở loài
tôm hồng do có sự kìm hãm lên enzyme polyphenol oxydase (tác nhân gây
xuất hiện đốm đen ở tôm).
- Ở các nước Âu Mỹ trước đây, ficin là một thành phần trong nước rửa chén
nhưng sau này nó không được dùng nữa vì có tác dụng xấu đối với da.
- Ficin dùng trong việc nghiên cứu thủy phân thức ăn cho bò và một số ứng
dụng trong lĩnh vực thú y.