3. Vēsture
• 1980 gadā 3D printēšanas metode radīta.
• 1984 gadā pirmais strādājošais printeris.
• 2010 gadā 3D printeri plaši pieejami
pārdošanā
• 1993 ‘’Langer and Vacanti’’ rodas šūnu
izolēšanas un uzslāņošanas metode
• 2013 gadā
Kāpēc to
vajag ?
4.
5. Kāpēc tas ir vaidzīgs?
• Audi bojājas ar laiku, slimību, traumu un iedzimtu
defektu rezultātā. Un šo defektu labošana bieži
paļaujas uz transplantēšanu no donoriem, vai arī ar
protēzēm.
• Orgānu donori vienmēr ir mazāk, nekā recipienti. 2009
gadā vien Amerikā bija 154,324 pacienti, kas stāv rindā
uz orgānu transplantāciju.No kuriem tikai 27,996
saņema orgānu, bet 8,863 mira gaidot rindā (25 cilvēki
dienā).
• Gaidošo pacientu skaits pieaug ar katru gadu un orgānu
transplantācijas operācijas izmaksā vairāk nekā 300
miljardi dolāru gadā.
6. Audu mākslīga kultivēšana
solās labot situāciju orgānu un audu
nepieciešamībā no donora lietojot
biomateriāla matrices un augšanas
faktorus. Radītie audi izslēdz atgrūšanas
reakcijas un donoru-recipienta nesaderību.
7. Kāda atšķirība 2D vai 3D
Divās dimensijās
attēls tiek konstruēts divās plaknēs X un
Y, kas apzīme platumu un augstumu; kolonnas
un rindas u.t.t. Ar divu dimensiju attēlu labākajā
gadījumā var simulēt 3D efektu. Attēls nevar tikt
rotēts un apskatīts no citām pusēm.
8.
9.
10. Kāda atšķirība 2D vai 3D
Trijās dimensijās
attēls tiek konstuēts X, Y, un Z plaknē, kur Z
nozīmē dziļumu un piešķir telpiskumu. Tieši
dziļums ir tas, kas atšķir zīmējumu/gleznu no
skulptūras.
11.
12.
13. 2014. Gada februāris
• 2.500 $ printeris
• 600 $ sirds
• 20 h mašīnas darba
• 1 bērna dzīvība
14. Kā rodas mākslīgie audi
• Standartā printēšanai nepieciešams: šūnas ; biomateriāla
matrice un AF.
• Šūnas tiek uzsētas uz biometariāla un tad tas tiek noturēts AF
barotnē. – šādi var izveidot avaskulārus audus kā skrimsli un
plānu ādu.
• Šūnas un biomateriāls tiek apstrādāts, veidojot hydrogel. Gēls
pa vienam pilienam tiek uzklāts uz matrices. Slāņojoties
gēlam, struktūra aug un ieņem vēlamo formu.
• Metodes
Materiāla veidošana gaisā
Materiāla veidošana blīvā vidē
18. Problēmas
Sasniedzot 1 mm, vairs nenotiek šūnu, augšanas faktoru, O2, CO2
difūzija, un šādi audi pēc implantācijas aizies bojā. Bet šādā veidā var
veidot skrimšļaudus un plānas ādas
Šunu uzklāšanas neprecizitāte, kas irobežo augstu diferencētu audu
veidošanu – plānākā iespējamā struktūra ir 0.7 mm – muskuļus, nervus
u.t.t. nevar
Printējot gaisā, meteriālam ir kritiskā masa pēc kuras viņš sabrūk
Uzgaļa diametrs ir 48 µm un tāpēc noteikto šūnu izmēru dēļ netiek
izmantotas visas šūnas, tāpēc nav iespējams panākt perfektu blīvumu
topošajiem audiem.
Izšķirtspēja 300 dpi ļauj printēt ar maksimumu 8×106 šūnas mililitrā –
arī ietekmē blīvumu. (normāli 0.04 to 0.2 mEq/mL)
Uzsildošie elementi uzgalī palielina temperatūru līdz 300°C un ilgst
dažas mikrosekundes, kā rezultātā printētās šunas uzsilst 2 µs par 4–
10°C, kā
Rezultātā izdzīvo tikai 90% šūnu.
21. ORL 3D materiāls - skrimslis
Sintētisks hidrogēls, kas tiek formulēts poli-
etilēn-glikolā (PEG) un saglabā hondrocītu
kustīgumu, stimulē ECM proteoglikānu un
kolagēns II veidošanos. PEG hidrogēls
šobrīd ir piemērotākais materiāls lai
aizstātu cilvēka skrimšļaudus.
22. Sagatavo šūnas
• Cilvēka mezenhimālās šunas tika iegūtas no paša pacienta, vai no
pacientiem, kam tiek veikta artroplastija. Iegūtās šūnas tiek
sadalītas pa 5×105 šūnām /cm2 un kultivētas ar 1ng/mL FGF.
Barotne tiek atsvaidzināta 2 reizes nedēļā.
• Cilvēka locītavu hondrocīti tiek ņemti no pacientiem, kam tiek
veikta totāla ceļa artroplastija. Skrimslis tiek sadalīts izmantojot
0.15% 2. tipa kologināzi 37°C temperatūrā. Šūnu suspensija tiek
filtrēta caur 100mm filtru un mazgāta fosfātu bufer šķīdumā.
Šūnas atkal ievieto «chondrocyte expansion medium» kopā ar 10%
FGF ,100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin. Tad šūnas tiek
skaitītas un uzklātas 5000 cells/cm2 blīvumā «expansion medium».
Lai hondrocītus varētu atdiferencēt, pēc desmit dienām tos ievieto
0.25% tripsīnā un uzglabā šķidrajā slāpeklī līdz izmantošanas brīdim.
Iegūtos hondrocītus savieno ar alginātu 2% diferenciācijas barotnē
ar blīvumu 1×107 cells/mL un kulturētas 5 dienas. Pirms lietošanas
ievietotas sterilā citrāta buferšķīdumā uz 15 minūtēm.
23. Pārbauda šūnu dzīvumu
Šūnu derība tad tiek novērtēta ar LIVE/DEAD
metodi atbilstoši izstrādātājiem. Tam dēļ 5
paraugi tiek ņemti un pielietota
epifluorescence. Epifluorescence tiek
uzstādīta uz 488/530nm lai noteiktu zaļo
fluorescenci un 530/580nm lai noteiktu
sarkano fl. No 3 dažādām izvēlētām vietām
paraugos tiek skaitītas dzīvās/mirušās
šūnas un tiek noteikts dzīvo šūnu
koificents.
24.
25. In vivo/ in vitro
• Heterogēnās metrices veidošana
• Iegūtais materiāls tika kultivēts 1:1 osteogēnā un hondrogēna barotņu
maisījumā 7 dienas. Šo dienu laikā tās tiek noturētas 5% CO2 and 37°C
temperatūrā, un barotne tiek mainīta katras 3 dienas. Papildus barotnes
tiek inkubētas 15 min garumā 102mM CaCl2 vienreiz nedēļā . Un
maisījums ir gatavs printēšanai un ievietošanai AF barotnē.
• In vivo implantācija
• In vivo augšanai, tiek printēts audu sakopojums un ievietos proliferācijas
barotnē 24 stundas pirms implantācijas. Sieviešu dzimtas bezspalvainās
peles 6 nedēļu vecumā tiek anastezētas ar 1.5% izofluarānu, pēc kā
implanti tiek ievietoti pelēm subkutāni muguras rajonā. Incīzijas aizver ar
vicryl 0-5 šuvēm. Peles PO tiek atsāpinātas ar
bupronorfīnu.(0.05mg/kg, sc; Temgesic). Pēc sešām nedēļām peles tiek
nogalinātas un audi ievākti., fiksēti 4% bufer-formalīnā, un dekalcificēti
Luthra's šķīdumā (0.35M HCl and 2.65M formic acid in distilled water) 24
stundu garumā.
26.
27.
28.
29. In vitro
• Appearance and cell function in printed grafts in
vitro. (a) Macroscopic appearance of printed composite constructs
with an MSC-laden compartment on the left and a chondrocyte-
laden compartment on the right, directly after printing (top) and
after 3 weeks of culture (bottom), showing differences on a
macroscopic level. Scale bar: 500μm. HE staining after 21 days in
osteogenic part (b) and chondrogenic part (c) illustrates clusters
inside the alginate fiber in the chondrocyte part of the construct,
whereas cells are dispersed in the MSC compartment. Cells: dark
blue; alginate: light blue. (d) ALP staining (red) after 7 days
demonstrates positive cells in MSC compartment of the
construct. (e) Immunolocalization of collagen type VI (brown) at 21
days in the chondrocyte-laden part of the scaffold. Scale bars:
100μm. HE, hematoxylin and eosin; ALP, alkaline phosphatase.
32. In vivo
• (b) Goldnera metode – ECM veidošanās.
• (c, e)Imūnhistoķīmija – kolagēna produkcija
• (d) Imūnhistoķīmija uz osteokalcīnu (brown)
Nodrāda uz hondrogēno diferenciāciju
33. Augšanas faktori
• Lai gan bioprintings ir daudzsološs, tomēr labāki rezultāti
skrimšļa blīvumā tika sasniegti implantējot veselu skrimsli
(10–20×106 cells/mL ) un mezenhimālās šūnas tieši
vaidzīgajā vietā. [Tas izskaidrojams ar iepriekš minētajiem
ierobežojumiem printējot ar 300 dpi printeri. Insulin-
transferrin-selenium (ITS+) ;transforming growth factor-β1
(TGF-β1) Hondrocīti - pietiekošs lai diferencētu
hondrocītus, bet nepietiekošs, lai ļautu tiem izplesties. FGF-
2 nozīme ir ECM sintēzē un neo-cartilage izveides
ierobežošanā. Apstrādājot ausi pēc iegūšanas ar FGF-2
, blīvums palielinājās līdz 11×106 cells/mL [56]. Tātad FGF-2
ir lietojams lai panāktu augstāku blīvumu nezaudējot
precizitāti.
34.
35. Problēmas
Sasniedzot 1 mm, vairs nenotiek šūnu, augšanas faktoru, O2, CO2
difūzija, un šādi audi pēc implantācijas aizies bojā. Bet šādā veidā var
veidot skrimšļaudus un plānas ādas
Šunu uzklāšanas neprecizitāte, kas irobežo augstu diferencētu audu
veidošanu – plānākā iespējamā struktūra ir 0.7 mm – muskuļus, nervus
u.t.t. nevar
Printējot gaisā, meteriālam ir kritiskā masa pēc kuras viņš sabrūk
Uzgaļa diametrs ir 48 µm un tāpēc noteikto šūnu izmēru dēļ netiek
izmantotas visas šūnas, tāpēc nav iespējams panākt perfektu blīvumu
topošajiem audiem.
Izšķirtspēja 300 dpi ļauj printēt ar maksimumu 8×106 šūnas mililitrā –
arī ietekmē blīvumu. (normāli 0.04 to 0.2 mEq/mL)
Uzsildošie elementi uzgalī palielina temperatūru līdz 300°C un ilgst
dažas mikrosekundes, kā rezultātā printētās šunas uzsilst 2 µs par 4–
10°C, kā
Rezultātā izdzīvo tikai 90% šūnu.
Submerged hydrogel extrusion in fluorocarbon support fluid. The experiments were conducted with 3% (w/v) agarose stained with methylene blue. (A) The extrusion of an agarose rod in fluorocarbon. (B) The collapsing of the gel rod upon removal of the support liquid. (C) A hydrogel rod extruded in air. (D) The rod detaches from the extrusion needle and collapses when a critical height is exceeded.
General concept of submerged bioprinting. (A) Single drops of cell laden hydrogel are dispensed layer-by-layer according to a predefined model to form a three-dimensional tissue construct. The printing is performed submerged in a high-density fluorocarbon supporting liquid. (B) Hydrogel drops can be appended either vertically or laterally to an existing structure. Due to the buoyant support of the fluorocarbon, branching hydrogel structures or cantilever like constructs can be build without the need for a solid support.
trunk thickness of ∼1.3mm (Fig. 7C–F). At a height of 5mm the trunk branched into five horizontal arms with lengths of ∼2.5–4.0mm, measuring ∼0.7mm in diameter.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2818246/Preciizaak, izveidoja 5x5 mm x 81Mm gludaa muskulatuura
Appearance and cell function in printed grafts in vitro. (a) Macroscopic appearance of printed composite constructs with an MSC-laden compartment on the left and a chondrocyte-laden compartment on the right, directly after printing (top) and after 3 weeks of culture (bottom), showing differences on a macroscopic level. Scale bar: 500μm. HE staining after 21 days in osteogenic part (b) and chondrogenic part (c) illustrates clusters inside the alginate fiber in the chondrocyte part of the construct, whereas cells are dispersed in the MSC compartment. Cells: dark blue; alginate: light blue. (d) ALP staining (red) after 7 days demonstrates positive cells in MSC compartment of the construct. (e) Immunolocalization of collagen type VI (brown) at 21 days in the chondrocyte-laden part of the scaffold. Scale bars: 100μm. HE, hematoxylin and eosin; ALP, alkaline phosphatase.
