Dokumen tersebut membahas tentang metode PCR (Polymerase Chain Reaction) yang merupakan teknik amplifikasi DNA secara in vitro. Metode ini menjelaskan komponen-komponennya seperti primer, DNA polimerase, dan dNTPs serta prinsip kerjanya melalui siklus denaturasi, annealing, dan elongasi DNA. Dokumen ini juga menjelaskan varian-varian PCR dan berbagai aplikasinya dalam diagnosis kedokteran dan penelitian.
Dokumen tersebut membahas tentang teknologi DNA rekombinan yang meliputi prinsip kloning gen, vektor plasmid, enzim restriksi, ligasi, transformasi, seleksi transforman, dan deteksi keberadaan DNA sisipan."
Dokumen tersebut membahas tentang kloning gen, yang merupakan proses untuk mengisolasi, memurnikan, dan memperbanyak gen tertentu dari suatu organisme. Metode yang digunakan meliputi pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi, penyisipan gen ke dalam vektor seperti plasmid, dan transformasi ke dalam sel inang untuk mereplikasi DNA.
Teknologi DNA rekombinan memungkinkan penyisipan gen dari satu organisme ke organisme lain untuk menciptakan organisme transgenik. Teknik ini telah digunakan untuk memproduksi tanaman tahan hama seperti kapas dan tomat Bt serta menghasilkan protein berguna seperti insulin melalui rekayasa genetika bakteri.
Vektor merupakan molekul DNA seperti plasmid yang digunakan untuk memindahkan DNA target ke dalam sel inang. Plasmid adalah vektor yang umum digunakan karena berukuran kecil, dapat mereplikasi sendiri, dan membawa gen resistensi antibiotik untuk seleksi klon. DNA target dimasukkan ke dalam plasmid menggunakan enzim restriksi, kemudian plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam bakteri untuk mereplikasi DNA target.
Dokumen tersebut membahas tentang metode PCR (Polymerase Chain Reaction) yang merupakan teknik amplifikasi DNA secara in vitro. Metode ini menjelaskan komponen-komponennya seperti primer, DNA polimerase, dan dNTPs serta prinsip kerjanya melalui siklus denaturasi, annealing, dan elongasi DNA. Dokumen ini juga menjelaskan varian-varian PCR dan berbagai aplikasinya dalam diagnosis kedokteran dan penelitian.
Dokumen tersebut membahas tentang teknologi DNA rekombinan yang meliputi prinsip kloning gen, vektor plasmid, enzim restriksi, ligasi, transformasi, seleksi transforman, dan deteksi keberadaan DNA sisipan."
Dokumen tersebut membahas tentang kloning gen, yang merupakan proses untuk mengisolasi, memurnikan, dan memperbanyak gen tertentu dari suatu organisme. Metode yang digunakan meliputi pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi, penyisipan gen ke dalam vektor seperti plasmid, dan transformasi ke dalam sel inang untuk mereplikasi DNA.
Teknologi DNA rekombinan memungkinkan penyisipan gen dari satu organisme ke organisme lain untuk menciptakan organisme transgenik. Teknik ini telah digunakan untuk memproduksi tanaman tahan hama seperti kapas dan tomat Bt serta menghasilkan protein berguna seperti insulin melalui rekayasa genetika bakteri.
Vektor merupakan molekul DNA seperti plasmid yang digunakan untuk memindahkan DNA target ke dalam sel inang. Plasmid adalah vektor yang umum digunakan karena berukuran kecil, dapat mereplikasi sendiri, dan membawa gen resistensi antibiotik untuk seleksi klon. DNA target dimasukkan ke dalam plasmid menggunakan enzim restriksi, kemudian plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam bakteri untuk mereplikasi DNA target.
Dokumen tersebut membahas tentang diagnosis molekular dan terapi gen. Diagnosis molekular dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi genetik melalui berbagai metode seperti PCR-RFLP dan oligo probe. Terapi gen bertujuan memperbaiki gen yang rusak dengan mengambil sel darah pasien, memperbaiki gennya, lalu memasukkannya kembali ke tubuh atau membuat gen di luar tubuh baru dimasukkan.
Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi: - Teknik untuk mengisolasi DNA. - Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup.
Teknologi DNA rekombinan melibatkan penyisipan DNA dari satu organisme ke DNA organisme lain untuk menciptakan kombinasi baru. Tekniknya meliputi isolasi DNA, pemotongan DNA dengan enzim, penyambungan DNA, transformasi ke sel inang, dan seleksi transforman yang membawa DNA rekombinan. Teknologi ini memungkinkan modifikasi genetik untuk berbagai tujuan seperti produksi obat.
PPT ini merupakan salah satu materi kuliah BIOTEKNOLOGI yang ditulis oleh Trianik Widyaningrum, M.Si. (dosen Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta).
Butuh lebih banyak materi biologi..???
http://belajar-di-rumah.blogspot.com/
Teknik Southern blot digunakan untuk menganalisis DNA plasmid dan kromosom bakteri Klebsiella pneumoniae M10 dan mutannya KSL19. DNA diekstraksi, dipotong dengan enzim restriksi, dipindahkan ke membran nilon, dan dihibridisasi dengan probe DNA yang dilabel untuk mendeteksi perbedaan gen antara kedua strain bakteri.
Makalah ini membahas pengaruh pemberian deksametason terhadap ekspresi gen moesin pada sel-sel stroma sumsum tulang kelinci. Penelitian menunjukkan bahwa pemberian deksametason menurunkan ekspresi mRNA moesin hingga 75-85% pada dua sampel kelinci. Protein moesin terkait dengan organisasi sitoskeleton sel. Hasil ini menunjukkan bahwa deksametason dapat memodulasi gen moesin dan berpengaruh terhadap
Dokumen tersebut membahas tentang bioteknologi rekayasa genetika yang mencakup pengertian, prinsip dasar, proses, manfaat, contoh, dan jenis-jenis teknik yang digunakan seperti kloning, PCR, insulin, terapi gen."
Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Salah satu metode yang sering digunakan pada bioteknologi modern yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR).
PCR merupakan suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.
Teknologi kloning adalah suatu cara reproduksi yang menggunakan teknik tingkat tinggi di bidang rekayasa genetika untuk menciptakan makhluk hidup tanpa melalui perkawinan.
Kelompok 6 Kimia B (Southern Blotting dan Northern Blotting)Fathmasari
Dokumen tersebut membahas tentang teknik Southern Blotting dan Northern Blotting. Southern Blotting digunakan untuk mendeteksi DNA sedangkan Northern Blotting digunakan untuk mendeteksi RNA. Kedua teknik ini melibatkan proses isolasi asam nukleat, elektroforesis, transfer ke membran, hibridisasi dengan probe, dan deteksi.
Teknik Northern Blot digunakan untuk menganalisis ekspresi gen pada tanaman kacang hijau dengan mendeteksi mRNA spesifik gen Cmchi1 dan Cmchi2. Total RNA diekstraksi dari berbagai organ tanaman dan dipisahkan menggunakan elektroforesis agarosa. Probe RNA yang berlabel digunakan untuk mendeteksi mRNA target setelah transfer RNA ke membran dan hibridisasi. Hasil deteksi menunjukkan pola ekspresi gen yang berbeda di antara organ tanaman.
Rekayasa genetika melibatkan pemindahan gen dengan membuat DNA rekombinan melalui penyisipan gen untuk mendapatkan produk baru yang lebih unggul. Prinsip-prinsipnya meliputi rekombinasi DNA, teknologi hibridoma, kultur jaringan, dan transfer inti. Produk rekombinan farmasi meliputi antibodi, DNA rekombinan, protein, dan obat-obatan seperti antibiotik dan vaksin.
ANALISIS JURNAL INTERNASIONAL PENERAPAN BIOTEKNOLOGI MODERNrisyanti ALENTA
Penelitian ini menghasilkan vaksin rekombinan protein Sao-L dari bakteri Streptococcus suis untuk melindungi babi dari infeksi bakteri tersebut. Uji coba vaksin pada tikus dan babi menunjukkan peningkatan respons antibodi dan resistensi terhadap infeksi bakteri. Pengembangan vaksin ini sejalan dengan prinsip-prinsip bioetika karena memberikan manfaat bagi kesehatan hewan dan masyarakat.
Isolasi DNA merupakan proses untuk memisahkan dan memurnikan DNA dari sel atau jaringan. Metode isolasi DNA meliputi tahapan pelisisan sel, sentrifugasi, ekstraksi, purifikasi, sentrifugasi lanjutan, dan presipitasi untuk memisahkan DNA dari kontaminan seperti protein, lipid, dan karbohidrat.
Dokumen tersebut membahas produksi vaksin rekombinan, prinsipnya, kelebihan dan kekurangannya. Secara ringkas: Vaksin rekombinan dibuat dengan teknologi rekayasa DNA untuk menghasilkan respons kekebalan tubuh yang lebih baik terhadap patogen. Kelebihannya adalah plasmid DNA mudah diproduksi dan stabil, tetapi imunogenisitasnya rendah. Prinsip utamanya adalah mengambil bagian kode genetik organisme
Teknik analisis keragaman genetik meliputi PCR-RAPD, PCR-RFLP, PCR-analisis sekuen, dan PCR-DGGE. PCR-RAPD menggunakan primer untuk mempelajari keanekaragaman genetika, PCR-RFLP melihat polimorfisme dengan enzim pemotong, sedangkan PCR-analisis sekuen dan PCR-DGGE membandingkan urutan DNA.
Transkrip baru yang responsif terhadap stres dehidrasi dari tanaman serat tossa rami (Corcohrus olitorius L.) diidentifikasi. Ekspresi gen transkrip ini menurun di bawah kondisi stres dehidrasi. Studi ekspresi jaringan menunjukkan transkrip diekspresikan di akar, batang, dan daun pada kondisi normal. Homolog gen transkrip ini tidak ditemukan pada spesies tanaman lain.
Dokumen tersebut membahas tentang teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk memeriksa molekuler lalat, kutu, pinjal dan nyamuk. PCR adalah teknik perbanyakan potongan DNA secara in vitro dengan menggunakan primer dan siklus pemanasan dan pendinginan untuk memisahkan dan memperbanyak DNA target. Hasil PCR kemudian dianalisis lebih lanjut dengan elektroforesis dan sekuensing untuk menentukan urutan basa nitrogen DNA.
Dokumen tersebut membahas tentang diagnosis molekular dan terapi gen. Diagnosis molekular dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi genetik melalui berbagai metode seperti PCR-RFLP dan oligo probe. Terapi gen bertujuan memperbaiki gen yang rusak dengan mengambil sel darah pasien, memperbaiki gennya, lalu memasukkannya kembali ke tubuh atau membuat gen di luar tubuh baru dimasukkan.
Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi: - Teknik untuk mengisolasi DNA. - Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup.
Teknologi DNA rekombinan melibatkan penyisipan DNA dari satu organisme ke DNA organisme lain untuk menciptakan kombinasi baru. Tekniknya meliputi isolasi DNA, pemotongan DNA dengan enzim, penyambungan DNA, transformasi ke sel inang, dan seleksi transforman yang membawa DNA rekombinan. Teknologi ini memungkinkan modifikasi genetik untuk berbagai tujuan seperti produksi obat.
PPT ini merupakan salah satu materi kuliah BIOTEKNOLOGI yang ditulis oleh Trianik Widyaningrum, M.Si. (dosen Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta).
Butuh lebih banyak materi biologi..???
http://belajar-di-rumah.blogspot.com/
Teknik Southern blot digunakan untuk menganalisis DNA plasmid dan kromosom bakteri Klebsiella pneumoniae M10 dan mutannya KSL19. DNA diekstraksi, dipotong dengan enzim restriksi, dipindahkan ke membran nilon, dan dihibridisasi dengan probe DNA yang dilabel untuk mendeteksi perbedaan gen antara kedua strain bakteri.
Makalah ini membahas pengaruh pemberian deksametason terhadap ekspresi gen moesin pada sel-sel stroma sumsum tulang kelinci. Penelitian menunjukkan bahwa pemberian deksametason menurunkan ekspresi mRNA moesin hingga 75-85% pada dua sampel kelinci. Protein moesin terkait dengan organisasi sitoskeleton sel. Hasil ini menunjukkan bahwa deksametason dapat memodulasi gen moesin dan berpengaruh terhadap
Dokumen tersebut membahas tentang bioteknologi rekayasa genetika yang mencakup pengertian, prinsip dasar, proses, manfaat, contoh, dan jenis-jenis teknik yang digunakan seperti kloning, PCR, insulin, terapi gen."
Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Salah satu metode yang sering digunakan pada bioteknologi modern yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR).
PCR merupakan suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.
Teknologi kloning adalah suatu cara reproduksi yang menggunakan teknik tingkat tinggi di bidang rekayasa genetika untuk menciptakan makhluk hidup tanpa melalui perkawinan.
Kelompok 6 Kimia B (Southern Blotting dan Northern Blotting)Fathmasari
Dokumen tersebut membahas tentang teknik Southern Blotting dan Northern Blotting. Southern Blotting digunakan untuk mendeteksi DNA sedangkan Northern Blotting digunakan untuk mendeteksi RNA. Kedua teknik ini melibatkan proses isolasi asam nukleat, elektroforesis, transfer ke membran, hibridisasi dengan probe, dan deteksi.
Teknik Northern Blot digunakan untuk menganalisis ekspresi gen pada tanaman kacang hijau dengan mendeteksi mRNA spesifik gen Cmchi1 dan Cmchi2. Total RNA diekstraksi dari berbagai organ tanaman dan dipisahkan menggunakan elektroforesis agarosa. Probe RNA yang berlabel digunakan untuk mendeteksi mRNA target setelah transfer RNA ke membran dan hibridisasi. Hasil deteksi menunjukkan pola ekspresi gen yang berbeda di antara organ tanaman.
Rekayasa genetika melibatkan pemindahan gen dengan membuat DNA rekombinan melalui penyisipan gen untuk mendapatkan produk baru yang lebih unggul. Prinsip-prinsipnya meliputi rekombinasi DNA, teknologi hibridoma, kultur jaringan, dan transfer inti. Produk rekombinan farmasi meliputi antibodi, DNA rekombinan, protein, dan obat-obatan seperti antibiotik dan vaksin.
ANALISIS JURNAL INTERNASIONAL PENERAPAN BIOTEKNOLOGI MODERNrisyanti ALENTA
Penelitian ini menghasilkan vaksin rekombinan protein Sao-L dari bakteri Streptococcus suis untuk melindungi babi dari infeksi bakteri tersebut. Uji coba vaksin pada tikus dan babi menunjukkan peningkatan respons antibodi dan resistensi terhadap infeksi bakteri. Pengembangan vaksin ini sejalan dengan prinsip-prinsip bioetika karena memberikan manfaat bagi kesehatan hewan dan masyarakat.
Isolasi DNA merupakan proses untuk memisahkan dan memurnikan DNA dari sel atau jaringan. Metode isolasi DNA meliputi tahapan pelisisan sel, sentrifugasi, ekstraksi, purifikasi, sentrifugasi lanjutan, dan presipitasi untuk memisahkan DNA dari kontaminan seperti protein, lipid, dan karbohidrat.
Dokumen tersebut membahas produksi vaksin rekombinan, prinsipnya, kelebihan dan kekurangannya. Secara ringkas: Vaksin rekombinan dibuat dengan teknologi rekayasa DNA untuk menghasilkan respons kekebalan tubuh yang lebih baik terhadap patogen. Kelebihannya adalah plasmid DNA mudah diproduksi dan stabil, tetapi imunogenisitasnya rendah. Prinsip utamanya adalah mengambil bagian kode genetik organisme
Teknik analisis keragaman genetik meliputi PCR-RAPD, PCR-RFLP, PCR-analisis sekuen, dan PCR-DGGE. PCR-RAPD menggunakan primer untuk mempelajari keanekaragaman genetika, PCR-RFLP melihat polimorfisme dengan enzim pemotong, sedangkan PCR-analisis sekuen dan PCR-DGGE membandingkan urutan DNA.
Transkrip baru yang responsif terhadap stres dehidrasi dari tanaman serat tossa rami (Corcohrus olitorius L.) diidentifikasi. Ekspresi gen transkrip ini menurun di bawah kondisi stres dehidrasi. Studi ekspresi jaringan menunjukkan transkrip diekspresikan di akar, batang, dan daun pada kondisi normal. Homolog gen transkrip ini tidak ditemukan pada spesies tanaman lain.
Dokumen tersebut membahas tentang teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk memeriksa molekuler lalat, kutu, pinjal dan nyamuk. PCR adalah teknik perbanyakan potongan DNA secara in vitro dengan menggunakan primer dan siklus pemanasan dan pendinginan untuk memisahkan dan memperbanyak DNA target. Hasil PCR kemudian dianalisis lebih lanjut dengan elektroforesis dan sekuensing untuk menentukan urutan basa nitrogen DNA.
1. Dokumen membahas tentang asam nukleat DNA dan RNA, serta struktur dan fungsi kromosom dan gen dalam sel.
2. DNA dan RNA berperan sebagai pembawa informasi genetik dalam sel, dengan DNA mengalami replikasi dan RNA mensintesis protein.
3. Struktur DNA berbentuk heliks ganda yang tersusun dari nukleotida yang dihubungkan fosfodiester, sementara RNA hanya beruntai tunggal.
PPT Rekgen Golden Gate final final.pptxssuser9b54b1
Penelitian ini mengembangkan sistem cloning Golden Gate untuk merekonstruksi vektor pertukaran alel dan menggunakan enzim I-SceI untuk meningkatkan efisiensi penggantian gen pada Bacillus anthracis. Metode ini mampu menghapus gen eag dan lainnya dari B. anthracis dengan efisiensi lebih dari 85% dan mempersingkat waktu proses penggantian gen.
ADN dan ARN adalah asam nukleat yang mengandung informasi genetik. ADN berperan sebagai blueprint yang mengandung instruksi untuk membangun komponen sel, sementara ARN berperan dalam mentransfer kode genetik dari ADN dan membawa asam amino ke ribosom. Kode genetik tersusun dalam bentuk kode triplet yang menentukan urutan asam amino dalam protein.
Dokumen tersebut membahas tentang genom, struktur dan morfologi kromosom, DNA, replikasi DNA, transkripsi, translasi, dan kode genetik. Secara ringkas, dokumen menjelaskan bahwa DNA mengandung informasi genetik yang direplikasi semikonservatif, kemudian ditranskripsi menjadi RNA yang akan ditranslasi menjadi protein berdasarkan kode genetik tiga basa.
Identifikasi 23 strain bakteri asam asetat yang diisolasi di Thailand menggunakan analisis filogenetik berdasarkan sekuens gen 16S rRNA dan gen groEL. Hasilnya menunjukkan strain-strain tersebut tergolong ke dalam 10 spesies Acetobacter yang berbeda, terutama A. pasteurianus, A. orientalis, A. tropicalis, dan A. ghanensis. Analisis gen groEL lebih sensitif untuk membedakan spesies yang sangat mirip seperti A. peroxydans dan A. papayae
Plasmid sebagai Alat Genetik dan Aplikasi dalam Perkembangan Biomolekuler - P...marketingIndogen
Plasmid adalah replikon sirkuler atau linier ekstrakromosomal yang ditemukan di banyak mikroorganisme pada domain Bakteri, Archaea, dan Eukariota. Plasmid dapat ditransmisikan melalui proses konjugasi. Konjugasi merupakan salah satu mekanisme yang paling efektif untuk menyebarkan elemen genetik di antara bakteri. Mekanisme tersebut adalah salah satu transportasi yang paling penting untuk bakteri komunikasi untuk memperoleh informasi genetik, kemudian memfasilitasi evolusi dan adaptasi relatif cepat pada bakteri.
Molekul DNA dan RNA memiliki peran penting dalam penyimpanan dan ekspresi informasi genetika. DNA berperan sebagai pembawa materi genetika, mengontrol aktivitas hidup, dan melakukan replikasi. RNA berperan dalam transkripsi DNA ke protein dan terdiri dari beberapa jenis. Gen merupakan unit dasar pembawa sifat yang diturunkan dan terletak pada kromosom.
Molekul DNA dan RNA memiliki peran penting dalam penyimpanan dan ekspresi informasi genetika. DNA berfungsi sebagai pembawa materi genetika dari satu generasi ke generasi berikutnya, sedangkan RNA berperan dalam proses transkripsi dan translasi yang mengontrol aktivitas hidup. Gen terletak pada kromosom dan mengandung informasi hereditas yang menentukan sifat yang diturunkan.
Prosedur isolasi plasmid bakteri dengan kit ekstraksi plasmid membahas proses isolasi plasmid dari bakteri menggunakan metode mini-prep yang meliputi pertumbuhan bakteri, lisis sel, pemurnian DNA plasmid, dan analisis menggunakan elektroforesis. Kit ekstraksi plasmid komersial mempermudah proses isolasi plasmid.
Teks ini membahas pengembangan metode isolasi DNA genomik dari tanaman jarak pagar (Jatropha curcas) untuk digunakan dalam analisis molekuler. Tiga teknik isolasi DNA (CTAB, Doyle and Doyle, dan SDS) diuji untuk menentukan metode mana yang mampu menghasilkan DNA berkualitas baik. Hasilnya menunjukkan bahwa dua dari tiga teknik mampu mengisolasi DNA tanaman jarak pagar yang berkualitas dan dapat digunakan untuk
1. TUGAS PRESENTASI KELOMPOK BIOMOL
DNA-Based Species Level Detection Of Glomeromycota:
One PCR Primer Set For All Arbuscular Mycorrhizal Fungi
Oleh :
Kelompok 3
DANDY EKO PRASETIYO P2BA11005
MIA AZIZAH P2BA11021
FEBRIAN KUSUMA A. P2BA11025
ARIE AMELIA P2BA11033
MAGISTER ILMU BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2011
2. DNA-Based Species Level Detection Of Glomeromycota:
One PCR Primer Set For All Arbuscular Mycorrhizal Fungi
LATAR BELAKANG
Arbuskular Micorrhizal Fungi (AMF) berasosiasi dengan 70-90% tanaman tanah dalam
sebuah simbiosis yang disebut arbuskular micorrhiza (AM) dan telah ada sejak 400 juta
tahun. AMF memindahkan nutrient inorganik dan air ke tanaman dan menerima karbohidrat
dalam pertukarannya. Dari studi ekologi molekuler, diketahui bahwa spesies menunjukkan
hanya sebagian kecil diversitas AMF.
Untuk mengungkapkan aspek-aspek fungsional dan ekologi dari jarak hubungan AMF
dengan tumbuhan berbeda atau kondisi lingkungan yang berbeda, maka perlu dideteksi
komunitas AMF pada level spesies. Namun ada metode untuk tujuan ini yang tidak hanya
untuk identifikasi morfologi tetapi juga untuk metode molekuler. Prisipnya, metode dasar
sekuens DNA berguna untuk mendeteksi organisme pada level komunitas berbeda, tetapi
untuk ekologi dibutuhkan juga database dan alat.
Karakterisasi molekuler AMF kebanyakan diperoleh dengan PCR pada DNA dari
akar tanaman inang, spora atau sampel tanah. Beberapa primer penargetan daerah rDNA
sebagai penanda molekuler diklaim sebagai AMF tertentu. Kebanyakan dari amplifikasi ini
hanya dibatasi pada sejumlah taksa Glomeromycotan atau DNA dari organisme nontarget.
Kebanyakan takson sampling paling komprehensif untuk Glomeromycota meliputi subunit
kecil/small subunit (SSU) daerah rDNA. Baru-baru ini, sepasang primer yang spesifik untuk
AMF telah diketahui yaitu : AML1 dan AML2.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui primer yang sesuai untuk amplifikasi DNA
dari seluruh anggota garis keturunan Glomeromycota dan untuk mengembangkan ilmu
pengetahuan untuk analisa molekuler dari komunitas Arbuskular Micorrhizal Fungi (AMF).
BAHAN DAN METODE
Jamur dan bahan tanaman untuk tes primer
Diuji sampel yang berbeda sebagai DNA template PCR, untuk menguji spesifisitas rancangan
primer baru. diantaranya memasukkan plasmid , ekstraksi DNA dari spora CMA tunggal dan
sampel akar dari Andes (Ekuador) dan Pegunungan Spessart (Jerman). Primer diuji untuk
spesifitas oleh PCR dengan plasmid yang membawa fragmen rDNA dengan urutan yang
dikenal. Semua plasmid telah diamplifikasi dari satu ekstrak DNA spora dengan SSU primer
3. rDNA SSUmAf, dijelaskan di sini, dan LSU rDNA LR4 primer 2 (dimodifikasi dari LR4;
www.aftol.org). Karena spesifisitas SSUmAf tidak bisa diuji secara langsung.
Ekstraksi DNA untuk tes primer
Semua peralatan yang digunakan disterilisasi dan DNA bebas. Dibersihkan, spora tunggal
AMF DNA diekstraksi dengan DNA Dynabead Universal Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Jerman)
seperti dijelaskan dalam Schwarzott & Schüßler (2001). Akar berpotensi terdapat AMF
dipotong sepuluh 0,5 cm dan dikumpulkan dalam tabung Eppendorf tunggal 1,5 ml yang
mengandung satu tungsten karbida (diameter 3 mm; Qiagen, Hilden, Jerman). Kemudian
dibekukan dalam N2 cair dalam tabung tertutup, ditempatkan di N2 cair. Untuk CTAB,
ekstraksi larutan penyangga (750 ml untuk 75 jaringan mg) ditambahkan ke setiap sampel
beku, jaringan tanah, diikuti oleh inkubasi pada 60 ° C selama 30 menit. Selanjutnya volume,
ditambahkan campuran kloroform-isoamylalcohol dengan perbandingan (24: 1). Sampel-
sampel tersebut disentrifugasi selama 5 menit pada 2570 g dan bagian fase atas dipindahkan
ke dalam tabung yang baru. Setelah penambahan 2,5 ml RNase (10 mg ml-1) ini diinkubasi
pada suhu 37 ° C selama 30 menit. Satu volume kloroform-isoamylalcohol (24: 1) kemudian
ditambahkan dan tabung disentrifugasi seperti di atas. Supernatan dikumpulkan dan dua
pertiga volume isopropanol ditambahkan. Sampel diinkubasi pada suhu 4 ° C selama 15
menit. Setelah sentrifugasi (10.290 g selama 10 menit) pelet dicuci pada 70% etanol, udara
kering, dan dielusi dalam 100 ml H2O. Volume 2-5 ml dari masing-masing ekstrak DNA
digunakan sebagai template PCR.
Kondisi PCR
DNA Polymerase pada PCR menggunakan pasangan primer SSUmAf–LSUmAr or
SSUmCf–LSUmBr. Reaksi menggunakan campuran yang terdiri dari 0.02 U µl−1 Phusion
polymerase, 1× Phusion HF Buffer dengan 1.5 mm MgCl 2, 200 µm dari tiap dNTP and 0.5
µm tiap-tiap primer. Kondisi PCR yang pertama disesuaikan menurut Eppendorf
Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg,Germany), yaitu masing-masing 5menit
denaturasi pada suhu 990C, 40 siklus dalam 10 detik pada suhu 990C, 30 detik annealing pada
60°C and 1 menit elongasi pada 72°C; and a 10 menit elongasi terakhir. Kondisi yang sama
juga digunakan pada nested PCR, kecuali suhu annealing 63°C dan hanya terjadi 30 siklus.
Produk PCR akan memuat 1 % gel agarose dengan 1x sodium borate buffer dan visualisasi
akan terlihat setelah pemberian ethidium bromide (1 µg ml−1).
Kloning, RFLP dan sequencing Produk reaksi polymerase chain diklon dengan Nol
Blunt TOPO PCR Kit Kloning (Invitrogen) sesuai dengan instruksi, untuk mengurangi biaya
yang digunakan hanya sepertiga dari volume tertentu dari semua komponen digunakan.
4. Hanya media SOC untuk pertumbuhan bakteri awal setelah transformasi digunakan dalam
volume sesuai petunjuk. Dari kloning dapat dianalisis sampai dengan 48 klon untuk sisipan
plasmid yang sesuai. Dalam beberapa kasus lebih sedikit klon yang tersedia karena efisiensi
kloning rendah. Koloni-PCR dilakukan dengan DNA Polymerase GoTaq (5 U ml-1;Promega,
Mannheim, Jerman) dan dimodifikasi dengan M13F dan M13R. Untuk mendeteksi
intrasporal dan intersporal pada urutan variabilitas di klon, RFLP dilakukan dengan Volume
10 reaksi ml, 5 ml mengandung koloni-produk PCR. Satu atau dua klon untuk masing-masing
pola pembatasan disekuensing, menggunakan primer M13, oleh Unit Layanan Sequencing
LMU pada ABI kapiler sequencer dengan BigDye v3.1 (Terapan Biosystems, Foster City,
CA, USA) sekuensing kimia. Urutan yang dirakit dan diedit di seqassem dan disimpan di
EMBL / GenBank / DDBJ database dengan nomor aksesi FM876780 untuk FM876839.
Desain primer
Untuk desain primer baru CMA urutan tertentu keselarasan didirikan dengan menyelaraskan
program (www.sequentix.de) dan ARB (Ludwig et al, 2004.). Secara total > 1000 urutan
AMF,mencakup semua garis keturunan filogenetik yang diketahui, dianalisis untuk desain
SSU dan LSU rDNA primer. Untuk keselarasan dalam ARB yang database kombinasi dataset
baru kita dan 94 rilis versi dari database SILVA (Pruesse et al., 2007,www.arb-silva.de)
digunakan. Oligonukleotida yang kemudian disintesis sebagai standar primer (25 nmol) oleh
Invitrogen.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Design Primer
Memiliki kecocokan untu tempat mengikat primer yang sesuI dengan sekuen AMF tetapi
tidak cocok terhadap tanaman dan urutan jamur non-AM (non-AMF) yang diidentifikasi
untuk SSU rDNA dan LSU rDNA. Mereka berada pada posisi 1484 dan 1532 pada SSU dan
di posisi 827 dan 928 pada LSU rDNA (berdasarkan pada Glomus sp. "intraradices" sekuen
DAOM 197198 gambar 1 C).glomeromycota . variasi sekuern membuatnya tidak mungkin
untuk memperoleh individu sekuen primer yang khusus meng aplifikasi Glomeromycota.
Dengan demikian , satu set dari empat primer campuran didesain, setiap target mengikat satu
situs ( Tabel 2, fig .1). Ketidaksesuaian tempat tertentu pada non-3 ' hanya sedikit mengubah
titik temperatur dan beberapa ketidaksesuaian lain (Glomus etunicatum) yang mungkin
disebabkan oleh kualitas sekuen yang rendah yang diterima oleh desain primer (Gambar 1).
5. Untuk menghilangkan ketidaksesuaian nontarget organisme pada ujung 3 'maka primer
dimasukkan. Pencarian BLAST menunjukkan spesifisitas yang tinggi dari pasangan-
pasangan primer baru untuk AMF.
Sekuen Glomeromycota yang mewakili variabilitas dikenali pada lokasi yang
mengikat primer, ditunjukkan pada Gambar. 1. Kami juga memasukan gambaran beberapa
garis keturunan dengan filogenetik (Gambar 2) untuk desain primer yang memungkinkan.
Namun, taksa berikut ini tidak bisa dimasukkan untuk mengikat LSU rDNA dalam analisis :
Entrophosporaceae, berisi dua spesies yang tidak memiliki data sekuens; Archaeosporaceae,
karena urutan yang tersedia tidak menutupi tempat mengikat LSU rDNA ; Otospora yang
hanya dua non overlapping parsial pada sekuen SSU rDNA yang diketahui, Intraspora,
diwakili oleh satu database sekuen SSU rDNA.
Primer specificity – discrimination against plants
Diskriminasi primer SSUmAf1 terhadap tanaman tingkat 'rendah' sangat lemah dan
dicontohkan oleh hanya satu ketidakcocokan pada urutan database dari lumut
(Polytrichastrum, Leptodontium dan Pogonatum), liverwort (Trichocoleopsis), hornwort
(Phaeoceros) dan clubmoss (Selaginella). Burmannia, Phaseoleae sp. dan beberapa sekuen
tanaman lainnya juga menunjukkan hanya satu ketidakcocokan. Semua sekuen pada tanaman
lainnya memiliki minimal dua ketidaksesuaian, terutama pada ujung 3 'dari primer. Untuk
SSUmAf2 setidaknya ada dua ketidaksesuaian untuk semua sekuen tanaman, kecuali lumut
(Archidium) dengan hanya satu ketidakcocokan. Untuk primer forward SSUmCf1 minimal
memiliki tiga ketidaksesuaian untuk semua tanaman, kecuali untuk satu sekuen Phaseoleae
lingkungan dengan dua ketidaksesuaian, yang diamati. SUUmCf2 tidak Cocok di satu tempat
pada sekuen Phaseoleae yang sama dan pada liverworts (radula, Ptilidium dan Porella),
hornwort (Anthoceros) dan spesies Taxus.Sekuen tanaman lainnya ditampilkan minimal
memiliki dua ketidaksesuaian, setidaknya satu pada ujung 3'. Untuk sekuen SSUmCf3 yang
disebutkan di atas yang menunjukkan ketidakcocokan Phaseoleae tidak ada, tetapi semua
urutan Phaseoleae lingkungan lainnya setidaknya memiliki satu ketidakcocokan di daerah
ujung 3'primer. SSUmCf3 juga menunjukkan hanya satu ketidaksesuaian untuk urutan
liverworts (radula, Ptilidium dan Porella), hornwort (Anthoceros) dan satu sekuen Liliopsida
dan Taxus. Sisa blas hits ditampilkan dua ketidaksesuaian (Taxus spp, Pinus. Dan
Haplomitrium liverwort) atau lebih. Hasil ini menunjukkan bahwa untuk campuran primer
SSUmAf dan SSUmCf diskriminasi 'rendah' terhadap tanaman kurang dari untuk tanaman
vaskular.
6. LSU rDNA primer memiliki setidaknya dua ketidaksesuaian dengan sekuens
tanaman. Minimum untuk LSUmAr1 empat ketidaksesuaian dengan urutan Brassica.
LSUmAr2 dan LSUmAr3 menunjukkan empat ketidaksesuaian untuk urutan Medicago,
dalam kasus LSUmAr2 ini berlaku juga berlaku untuk Vitis vinifera dan Oryza sativa. Semua
urutan tanaman lainnya menunjukkan ketidaksesuaian lebih untuk LSUmAr1, LSUmAr2 dan
LSUmAr3.
LSUmAr4, yang dirancang untuk menargetkan Paraglomeraceae, dua ketidaksesuaian
yang ditemukan untuk Solanum Lycopersicum diikuti oleh setidaknya tiga untuk semua
urutan tanaman lainnya. Set primer LSUmBr memiliki minimal tiga ketidaksesuaian untuk
sekuens tanaman. LSUmBr1 menunjukkan lebih dari tiga ketidaksesuaian ke Lotus dan
urutan Brassica. Setidaknya tiga ketidaksesuaian (untuk ephedra dan Larix) terjadi untuk
LSUmBr2. Ada tiga ketidaksesuaian untuk LSUmBr3 untuk Selaginella, diikuti oleh
liverwort (Trichocoleopsis) dan lumut (Bryum) spesies dengan empat. LSUmBr4 memiliki
tiga ketidaksesuaian untuk V. vinifera dan setidaknya lima untuk semua urutan tanaman
lainnya. LSUmBr5 ditampilkan lebih dari empat ketidaksesuaian untuk setiap urutan
tanaman.
7. Gambar. 3 Polymerase chain reaction amplifikasi dengan primer SSUmAf-LSUmAr (sekitar
1800 bp amplikon) dan SSUmCf-LSUmBr (sekitar 1500 bp amplikon). (a) PCR pada
fragmen DNA clone, menggunakan temperatur annealing yang berbeda dan konsentrasi
template dari 1 ng ml-1. Seperti, Acaulospora sp; Gs, glomus sp;.. Gl, glomus korpus, Ps,
Pacispora scintillans, Kk, Kuklospora kentinensis; Gi, intraradices glomus, Sh, Scutellospora
heterogama; N, kontrol negatif. Annealing suhu: 1, 55 ° C, 2, 55,7 ° C; 3, 57,8 ° C, 4, 60,5 °
C; 5, 63,1 ° C; 6, 65 ° C; 7, 55,2 ° C; 8, 56,6 ° C ; 9, 59,1 ° C, 10, 61,8 ° C; 11, 64,2 ° C; 12,
65,5 ° C. (b) PCR menggunakan 1 ml dari pengenceran 10 kali lipat plasmid (100 pg - 0,01
ml fg-1) sebagai template, sesuai dengan 5 × 107-5 molekul plasmid dalam 20 ml Volume
reaksi PCR. Annealing suhu: SSUmAf-LSUmAr 60 ° C; SSUmCf-LSUmBr 63 ° C N,
kontrol negatif; Marker, NEB 2-Login DNA Tangga (bp: 10 000, 8000, 6000, 5000, 4000,
3000, 2000, 1500, 1200, 1000 (panah), 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100).
Tes efisiensi Primer pada plasmid dan ekstrak DNA spora tunggal
Pasangan primer baru yang dirancang untuk mengamplifikasi fragmen 1800 bp (primer
SSUmAf-LSUmAr) dan 1500 bp (SSUmCf-LSUmBr). Dalam tes amplifikasi PCR pertama,
sampel yang dipilih meliputi garis keturunan filogenetik Glomeromycota yang berbeda.
Kloning rDNA digunakan dari spesies AMF Acaulospora sp. dan Kuklospora kentinensis
(Acaulosporaceae), Glomus korpus, Gl. intraradices dan sp glomus. (Glomeraceae),
Pacispora scintillans (Pacisporaceae), dan Scutellospora heterogama (Gigasporaceae) (Tabel
1, Gambar. 3a). Sebagai tambahan, fragmen-fragmen rDNA diamplifikasi dari ekstrak DNA
spora tunggal dari pyriformis Geosiphon (Geosiphonaceae), Gl. mosseae (Glomeraceae), Gl.
eburneum dan Gl. versiforme (Diversisporaceae), sp Paraglomus. (Paraglomeraceae), dan
Gigaspora sp. (Gigasporaceae) (tidak ditunjukkan). Semua spesies AMF yang diuji berhasil
diamplifikasi dengan primer baru.
Untuk menguji sensitivitas potensial primer baru, digunakan plasmid yang sama seperti
dalam tes PCR pertama dan tambahan sisipan plasmid dari Gigaspora sp, Gl.. versiforme dan
Ge. pyriformis (Tabel 1, Gambar. 3b). Mereka diencerkan selama beberapa magnitudo
(konsentrasi) yang mengandung 100 pg, 10 pg, pg 1, 100 fg, fg 10, 1 fg, fg 0,1 dan 0,01 ml fg
DNA-1. Satu mikroliter digunakan sebagai template untuk PCR, sedangkan empat
konsentrasi terendah menyesesuaikan dengan 5000, 500, 50 dan 5 molekul plasmid dalam 20
µml volume reaksi PCR. Kedua set primer diuji secara independen. Perbedaan spesifitas
antara set primer pertama dan primer bersarang (gabungan) diamati pada Pacispora,
8. Kuklospora, dan Geosiphon. Untuk Pacispora PCR dengan SSUmAf dan LSUmAr
dihasilkan, bahkan dengan konsentrasi DNA terendah, sebuah pita jelas terlihat, sedangkan
PCR dengan SSUmCf dan LSUmBr menghasilkan pita-pita yang lebih lemah, yang
menunjukkan spesifisitas rendah. Pita lemah juga diamati pada amplifikasi rDNA Ku.
kentinesis dengan primer SSUmCf-LSUmBr dan Ge. pyriformis dengan SSUmAf-LSUmAr.
Namun, perbedaan-perbedaan ini mungkin dalam rentang-error pengukuran konsentrasi DNA
plasmid fotometrik dari saham-solusi. Hanya sedikit atau tidak terjadi perbedaan antara
plasmid template lainnya, ketika membandaingkan intensitas pita, kecuali untuk Gl.
versiforme. Pita di sini, jelas terlihat hanya ditemukan konsentrasi DNA yang lebih tinggi,
tetapi dengan pola yang sama untuk kedua pasangan-pasangan primer. Namun, hal tersebut
disebabkan oleh integritas DNA template yang rendah. seri pengenceran selanjutnya dengan
persiapan plasmid segar (juga dari Diversisporaceae lain) tidak dapat dibedakan dari yang
diperoleh dengan spesies lain yang ditunjukkan pada Gambar. 3 (b). Untuk Ku. kentinensis
tidak ada amplikon dapat diamati setelah PCR dengan primer SSUmAf-LSUmAr, karena
kloning fragmen awalnya amplifikasi dengan primer bersarang (gabungan). Oleh karena itu
plasmid hanya berfungsi sebagai kontrol negatif dalam PCR pertama dan sebagai kontrol
positif untuk PCR dengan primer bersarang (gabungan)
Tes efisiensi Primer di lapangan dan pembibitan sampel pada akar dan spora
Untuk menguji apakah primer baru yang dirancang berlawanan terhadap jamur
nonglomeromycotan dan tanaman, kita menggunakan mereka, yaitu dengan mengekstrak
DNA spora tunggal pot kultur, sampel akar lingkungan, dan sampel akar dari pembibitan
pohon, dengan menggunakan pendekatan PCR. Kami mengamati tidak ada sekuens
kontaminan non-AMF tunggal di 12 akar lingkungan dan 40 sampel spora tunggal yang
diproses. Diskriminasi terhadap tanaman diuji dengan ekstrak DNA dari akar AMF host
potensial. Spesies yang dikumpulkan terdiri Poa cf. annua, Ranunculus lih. repens, dan
Rumex acetosella dari lapangan di Jerman, dan Podocarpus cf. macrostaqui, Heliocarpus
americanus dan bibit pohon Cedrela montana dari pembibitan pohon di Ekuador. Dari
sejumlah besar pendekatan PCR, hanya pada satu kesempatan, diperoleh tiga klon identik
membawa urutan tanaman (R. acetosella). Database sekuens Rumex terkait (AF189730, 630
bp) mencakup wilayah ITS, tapi tidak berikatan pada situs primer. Primer baru juga berhasil
digunakan pada DNA ekstraksi dari spora AMF tunggal dari pot kultur dan root organ
cultur (ROC). Hal ini menunjukkan amplifikasi PCR dengan cakupan luas filogenetik dari
AMF, sementara secara efisien mendiskriminasi non-AMF dan tanaman (Tabel 3)
9. DAFTAR PUSTAKA
Kruger M., Stockinger, H., Claudia K. and Arthur S. 2009. DNA-based species level
detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal
fungi.Jurnal New Phytologis 183: 212–223