Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506 pada orang dewasa sehat dengan membuktikan kemampuan bakteri tersebut untuk bertahan hidup di saluran pencernaan melalui teknik kultur dan real-time PCR. Dua belas subjek diberi suplemen probiotik dan placebo secara acak, dan sampel feses dikumpulkan selama empat minggu untuk menganalisis keberadaan L. plantarum menggunakan metode

1. Viabilitas probiotik Lactobacillus plantarum
IS-10506 asal Dadih pada orang dewasa
sehat
Azmier Adib
NPM : 0806419522

2. PENDAHULUAN

3. A. LATAR BELAKANG
• Makanan fungsional  berkhasiat
terapeutik
• Probiotik
• Prebiotik

4. • Mikroba dalam Probiotik  BAL
• Umumnya Lactobacillus dan
Bifidobacteria
• Proses fermentasi, BAL  metabolit
perubahan rasa, bentuk pada susu
serta mampu menghambat
pertumbuhan bakteri perusak dan
patogen

5. • Strain probiotik komersial yang
berasal dari negara-negara maju
belum tentu cocok dan optimal
fungsinya bagi orang Indonesia

6. • Dadih merupakan susu fermentasi asal
Sumatra barat.
• Dadih diproduksi dengan cara memasukan
susu kerbau segar yang telah disaring kedalam
tabung bambu, ditutup dengan daun pisang
lalu dibiarkan pada suhu kamar selama ± 1
sampai 2 hari sampai terbentuk gumpalan
menyerupai yogurt.

7. • Proses fermentasi dadih yang spontan melibatkan
Bakteri Asam Laktat indigenous yg beragam, proses
fermentasi dadih tidak mengindahkan sanitasi & higinis
• Perlu diteliti peranan bakteri asam laktat yang terlibat
dalam fermentasi dadih, khususnya kemampuan
menghambat pertumbuhan patogen mengingat susu
kerbau tidak dipanaskan terlebih dahulu dan
menggunakan peralatan yg tidak higinis
• Sebagai tahap awal perlu diteliti viabilitas Lactobacillus
plantarum asal dadih, apakah dpt bertahan pada
saluran cerna orang dewasa sehat di Indonesia
sehingga berpotensi sebagai probiotik lokal yang cocok
untuk masyarakat Indonesia

8. B. Tujuan
• Mengetahui viabilitas probiotik Lactobacillus
plantarum IS-10506 pada orang dewasa
dengan membuktikan viabilitas Lactobacillus
plantarum IS-10506 pada feses dengan
menggunakan metode kultur dan real time
PCR.

9. C. Hipotesis
• Lactobacillus plantarum IS-10506 dapat
bertahan hidup pada saluran cerna dan
berfungsi sebagai probiotik yang tepat untuk
orang dewasa sehat

10. D.MANFAAT PENELITIAN
• Penelitian ini akan memberi manfaat langsung
kepada partisipan dan tidak langsung bagi
masyarakat, sehingga diharapkan konsumsi
probiotik untuk menjaga kesehatan saluran
cerna beralih ke probiotik lokal

11. TINJAUAN PUSTAKA

12. • Probiotik
• Viabilitas probiotik jumlah mikroba hidup harus
cukup untuk memberikan efek positif bagi
kesehatan & mampu berkolonisasi sehingga dapat
mencapai jumlah yg diperlukan.
• Viabilitas mikroba dalam produk probiotik harus
mencapai 107-1010 cfu/g, krn viabilitas akan
mengalami penurunan selama penyimpanan.
Probiotik

13. Fuller1 dan Gilliland, 28 menyebutkan persyaratan
bakteri asam laktat yang dapat digunakan sebagai
agensia probiotik, harus memiliki sifat :
• Stabil terhadap asam lambung
• Toleran terhadap asam empedu dan mampu
bertahan hidup selama berada pada usus halus dan
usus besar
• Memproduksi substansi antimikroba yang dapat
menekan pertumbuhan bakteri patogen pada usus

14. • Mampu menempel dan mengkolonisasi dinding
saluran pencernaan, mendominasi dinding saluran
pencernaan, dan dapat menghambat pertumbuhan
bakteri patogen
• Tumbuh dan berkembang dalam saluran
pencernaan, sehingga dapat menjalankan
peranannya menjaga keseimbangan flora usus dan
meningkatkan kesehatan tubuh
• Mempunyai kemampuan untuk menstimulasi
sistem kekebalan tubuh.

15. Dalam kemampuannya untuk menempel serta
mengkolonisasi dinding saluran cerna ,
mendominasi dinding pencernaan maupun dalam
menghambat pertumbuhan bakteri pathogen, serta
membantu sistem imun probiotik memiliki
beberapa mekanisme seperti :
• Modulasi sistem imun, meningkatkan produksi
antibodi dan mengaktifkan makrofag, limfosit serta
sel-sel imun lainnya.
• Meningkatkan produksi musin dalam usus, sehingga
meningkatkan respon imun alami

16. • Menghambat pathogen dalam saluran air seni dan
usus karena persaingan dalam mendapatkan nutrisi
dan membentuk biosurfaktan dan molekul
koagregasi yang mencegah pelekatan dan
penyebaran pathogen pada sel epitel
• Menghasilkan senyawa antibakteri seperti
bakteriosin
• Menurunkan pH dengan menghasilkan asam laktat,
sehingga tidak nyaman bagi patogen untuk tumbuh
• Menekan aktivitas enzim penghasil amin yang
toksik dan karsinogenik dari bakteri usus lainnya.

17. Susu Fermentasi
air 88.3 %
lemak 3.50 %
protein 3.20 %
laktosa 4.98 %
mineral 0.02 %

18. • Susu  mudah rusak  substrat yg baik
u/ pertumbuhan mikroba  perubahan
warna, bau, rasa & bentuk  sumber
penyakit.
• Fermentasi  BAL

19. Berdasarkan jenis mikrobanya, susu
fermentasi dikelompokan menjadi tiga
kelompok, yaitu:
• Fermentasi bakteri asam laktat
• Fermentasi bakteri asam laktat dan
kapang
• Fermentasi bakteri asam laktat dan
khamir

20. Fermentasi bakteri asam laktat
• Produk Fermentasi Mesofil Ymer,
buttermilk, susu Nordic ropy, Dadih
• Produk Fermentasi Termofil 
Yakult, yogurt, gefilak

21. Fermentasi bakteri asam laktat dan
kapang  viili
• kapang Geotrichum candidum
Fermentasi bakteri asam laktat dan
khamir  skyr, kefir, koumiss

22. SIFAT BAKTERI ASAM LAKTAT

23. Bakteria asam laktat  Gram positif,
katalase negatif, tidak membentuk
spora, tidak mempunyai sitokrom,
aerotoleran, anaerobik hingga
mikroaerofilik, membutuhkan nutrisi
yang kompleks, seperti asam-asam
amino, vitamin (B1,B6, B12 dan
biotin), purin, pirimidin.

24. Bakteri asam laktat dikelompokkan
menjadi dua golongan, yaitu
homofermentatif dan
heterofermentatif

25. • Homofermentatif adalah kelompok
bakteri asam laktat yang hanya
memproduksi ±90 % asam laktat dan
senyawa karbonil sebagai produk
akhirnya.
contoh Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus lactis, Lactobacillus
ruminis, dan Lactobacillus
thermophilus

26. • Heterofermentatif adalah kelompok
bakteri asam laktat yang tidak hanya
memproduksi asam laktat (±50%), tetapi
memproduksi senyawa lain seperti
alkohol, asam asetat, karbon dioksida,
dan senyawa diasetil sebagai produk
akhirnya,
misalnya Lactobacillus brevis,
Lactobacillus fermentum, Leuconostoc
mesenteroides, dan Streptococcus lactis

27. METODOLOGI PENELITIAN

28. • Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan pilot study
dengan desain penelitian random
sampling.

29. Alur Penelitian
Sampel
Kultur (Total plate count dalam MRS agar)
Pengenceran secara duplo hingga konsentrasi
bakteri mencapai 10-5-10-8CFU*/ml
Gram StainUji Katalase
Catatan : Uji di atas diulang 1 kali lagi pada waktu yang berbeda.
* CFU = Colony Forming Unit
Catat hasil
Real Time PCR
Detection
limit

30. • Jumlah Sampel
• Pada penelitian ini terdapat 2 kelompok
yaitu kelompok perlakuan yang diberikan
probiotik Lactobacillus plantarum IS-
10506 dalam kapsul bubuk kering dan
kontrol (placebo). Besar sample
ditetapkan dalam pilot study adalah 12
untuk setiap kelompok perlakuan (sudah
termasuk 20% kemungkinan drop out).

31. • Tempat dan Waktu Penelitian
– Laboratorium Mikrobiologi FKUI
– Oktober 2009 – Mei 2011.
• Kriteria Inklusi
–Partisipan berumur 20-55 tahun, orang
dewasa sehat, (apparently healthy) yang
tidak sedang menderita penyakit.

32. • Kriteria Eksklusi
Dari sebelum penelitian:
-. Mendapat/menggunakan produk yang
mengandung susu fermentasi (yoghurt) atau
supplemen probiotik secara rutin ataupun
produk yang meningkatkan imunitas.
-. Mengkonsumsi antibiotika.

33. • Cara Kerja
Pengambilan feses
Setiap
rsponden
maksimal
dilakukan 4x
pengambilan
feses
Pengiriman
dengan es
maksimal 2
jam
Disimpan
pada suhu
-80°C untuk
di PCR
Baca hasil
Kultur dengan
MRS agar
Gram stain
katalase

34. prosedur Kultur
A B C
1 ml
1 ml 1 ml
1 ml
A, B, dan C hingga J masing-masing diisi dengan 9 ml PBS
Inkubasi dua
hari, 37°C
1 ml
D E
1 ml
masing-masing cawan petri diisi dengan1ml hasil pengenceran
(duplo)
J
Baca hasil masing-masing pengenceran dari (A) 10-1 hingga (J)
10-10
MRS agar
Catatan: setiap 1 ml dari pengenceran disimpan untuk detection limit demikian juga
optimasi indikator memakai prosedur yang sama, namun sebelumnya feses di sentrifus.

35. INTERPRETASI HASIL
• Interpretasi hasil uji :
– Hasil uji dinyatakan negatif apabila tidak ada
bakteri Lactobacillus plantarum yang tumbuh
– Hasil uji dinyatakan positif apabila: bakteri
Lactobacillus plantarum tumbuh

36. Interpretasi kultur
Lactobacillus plantarum pada media MRS
Positif

37. Cara kerja
Sampel & beberapa intestinal mikroba
Extraksi DNA
spesifisitasoptimasiDetection limit
Real Time PCR
Baca Hasil

38. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

39. Hasil pemeriksaan kultur
General Linear Model
Sum of
Squares df
Mean
Square F Sig.
M1 Between
Groups 3896.299 1 3896.299 1.499 .234
Within
Groups 54589.661 21 2599.508
Total 58485.960 22
M2 Between
Groups 1355.618 1 1355.618 .096 .760
Within
Groups 297335.050 21 14158.812
Total 298690.667 22
M3 Between
Groups 9044.243 1 9044.243 .917 .349
Within
Groups 207203.520 21 9866.834
Total 216247.764 22
M4 Between
Groups 1452.806 1 1452.806 .111 .742
Within
Groups 273648.973 21 13030.903
Total 275101.779 22

40. 0
50
100
150
200
250
300
350
400
Minggu 1 Minggu 2 Minggu 3 Minggu 4
1
6
9
11
19
22
29
B
D
F
Jumlah Lactobacillus sp pada individu yg diberi
probiotik

41. 0
20
40
60
80
100
120
140
160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Mean per minggu dari kelompok probiotik
57.89 134.656 77.706 146.87

42. 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Minggu 1 Minggu2 Minggu 3 Minggu 4
2
4
8
15
17
18
23
24
25
26
28
5a
E
Jumlah Lactobacillus sp yang disuplementasi dengan
placebo

43. Identifikasi
Kultur pada Agar MRS
– Dalam media MRS agar, dengan penambahan
brom cresol purple, L.plantarum membentuk
koloni berukuran 2-3 mm,
berwarna kuning, cembung, warna kuning
disebabkan karena kemampuan L.plantarum
memproduksi asam dari sorbitol.
– L.plantarum  Gram positif batang dan
katalase negatif

44. Identifikasi
• MRS agar dikatakan sebagai selektif media,
jika penambahan ciprofloxacin dilakukan,
Lactobacillus sp umumnya sensitif terhadap
ciprofloxacin, kecuali L.plantarum (Bujalance,
2006).
• Jumlah Lactobacillus sp dalam sampel tinja
dari partisipan yang berbeda sepertinya
bervariasi.45 Menurut Mikelsaar,46 kisaran
jumlah Lactobacillus sp bervariasi untuk
setiap individu mulai dari 5,1 hingga 8,3 log
CFU/g.

45. Optimasi qPCR
Optimasi
• Suhu annealing didapat pada suhu 58.4

47. • Nilai Ct (Threshold cycle) merupakan nilai yang
menunjukan adanya peningkatan deteksi oleh
fluorescence.
• Konsentrasi primer mempengaruhi nilai Ct,
namun juga mempengaruhi spesifisitas reaksi.

48. • Konsentrasi primer yang tinggi dapat
menyebabkan nilai Ct menjadi rendah namun
juga dapat menyebabkan atau meningkatkan
produk non spesifik seperti primer – dimer.
• Penggunaan SBYR green one memiliki
kelebihan yaitu: sensitif, namun juga memiliki
kekurangan yaitu spesifisitas rendah

49. Gambar 5. Optimasi suhu annealing primer dengan menggunakan
DNA Lactobacillus plantarum IS-10506 (Marker 100bp baris M,
suhu 52OC baris 1, 52,8 OC baris 2, 54,1OC baris 3, 55,9 OC baris 4)

50. Gambar 6. Optimasi suhu annealing primer dengan menggunakan
DNA Lactobacillus plantarumIS-10506 (Marker 100bp baris
M, suhu 61,5OC baris 1, 60,3 OC baris 2, 58,4OC baris 3, 62 OC baris
4)

51. Detection Limit
• Suhu annealing pada suhu 58.4oC
• Detection limit untuk Lactobacillus
plantarum dan dari feses yang sudah di
sentifus ternyata terdapat sedikit
perbedaan dalam Ct.

52. Pengenceran Ct
qPCR
dari
kultur
Ct qPCR
dari
simulasi
adanya
inhibitor
dalam
feses
Jumlah
CFU/ml
dalam
kultur
(pengencer
PBS 1x)
Jumlah
CFU/ml
dalam
kultur
(pengencer
supernatant
feses)
10-5 18.57 27.46 86 81
10-6 26.85 28.05 48 39
10-7 27.44 29.33 4 3
10-8 29.31 31.82 - -
10-9 32.64 32.04 - -
10-10 34.49 33.27 - -

53. Spesifisitas primer
• Spesifisitas primer terhadap beberapa
intestinal mikrobiota didapatkan hasil
spesifik primer hanya untuk Lactobacillus
plantarum.

54. • mikroba yang di uji antara lain:
Bakteri hasil
Lactobacillus plantarum +
Escherichia coli -
Pseudomonas aeuroginosa -
Klebsiella pneumonia -
Serratia marcesens -
Enterobacter aerogenes -
Salmonella typhi -
Bifidobacterium sp -
Bacillus subtilis -
Proteus mirabilis -
Shigella sp -
Bacteroides fragilis -

55. Hasil PCR pada kelompok Probiotik
Probiotik
no sampel Minggu I Minggu II Minggu III Minggu IV
1 - + - +
6 - + + +
9 - + + +
11 + + + +
19 - + - +
22 + + + +
29 - + + +
B - - - -
D + + + +
F - + + +

56. Hasil PCR pada kelompok Placebo
Placebo
no sampel Minggu I Minggu II Minggu III Minggu IV
2 - - - -
4 - - - -
8 + + - -
15 - - - -
17 + - - -
18 - - - -
23 - - - -
24 + + + +
25 - + - +
26 - - - +
28 - + + -
5a - - - -
E - - - -

57. KESIMPULAN

58. • Hasil penelitian probiotik L.plantarum
terhadap orang dewasa sehat dengan
perhitungan statistik pada kultur  tidak
significant
• Kultur tidak spesifik karena tidak
memakai ciprofloxacin
• Kepatuhan partisipan mempengaruhi
hasil

59. • Optimasi didapat pada suhu 58.4
• Primerspesifik
• Hasil penelitian probiotik L.plantarum
terhadap orang dewasa sehat dengan
pemeriksaan qPCR signifiant

60. • Dari hasil pemeriksaan qPCR, viabilitas
bakteri dinyatakan dalam nilai Ct dan
peak yang sesuai dengan kontrol positif
pada grafik melting curve.
• Pemeriksaan batas deteksi menggunakan
qPCR lebih sensitif dari pada
pemeriksaan kultur.

61. SARAN

62. • Perlu dilakukan penelitian lanjutan yg
berkenaan dengan keberadaan BAL dan
komensal dalam tubuh manusia sehat serta
stabilitas bakteri dalam kemasan.
• Dalam penelitian ini kultur berperan sebagai
uji saring  media tidak spesifik (tanpa
ciprofloxacin)
• Pemakaian probe untuk qPCR