Fer teknik-fermentasi

Panduan Pelaksanaan Laboratorium Instruksional I/II
Departemen Teknik Kimia ITB
MODUL 1.07 Teknik Fermentasi
-1/24-
I. Pendahuluan
Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk
menghasilkan metabolit promer dan metabolit sekunder dalam suatu lingkungan yang
dikendalikan. Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap awal proses fermentasi
yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar dapat diperoleh sel
yang hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium, komposisi
medium, suplai O2, dan agitasi. Bahkan jumlah mikroba dalam fermentor juga harus
dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi. Nutrisi dan
produk fermentasi juga perlu dikendalikan, sebab jika berlebih nutrisi dan produk
metabolit hasil fermentasi tersebut dapat menyebabkan inhibisi dan represi. Pengendalian
diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu medium fermentasi dipengaruhi
banyak faktor baik ekstraselular maupun faktor intraselular. Kinetika pertumbuhan secara
dinamik dapat digunakan untuk meramalkan produksi biomassa dalam suatu proses.
Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan fermentor bervolume 5 L dengan
volume kerja 2 L. Sebagai biakan digunakan Saccharomycess cereviceae dengan substrat
glukosa 1% pada pH 4,5. Fermentasi dilakukan secara aerobik dengan laju aerasi dijaga
antara 7 sampai 8 v/v/m. Praktikan bertugas mengamati profil pertumbuhan biomassa sel.
Pengamatan dilakukan dengan pengambilan sampel setiap satu jam. Pada sampel
dianalisis konsentrasi sel/biomassa dan konsentrasi glukosa. Setlah serangkaian tahap
penyiapan sampel, konsentrasi sel dan glukosa dilakukan secara spektrofotometri
terhadap absorbansi, kemudian dengan korelasi pada kurva baku akan diketahui
konsentrasi sel dan glukosa yang sebenarnya. Data-data ini kemudian diplot menjadi
sebuah grafik pertumbuhan sel. Dari grafik ini dapat diamati yield dan μmax.
Dalam percobaan ini diasumsikan laju pertumbuhan pada setiap bagian fermentor
sama untuk waktu tertentu. Pengadukan dianggap sempurna sehingga konsentrasi
komponen sama di setiap bagian fermentor.

II. Tujuan
Dengan melaksanakan praktikum Modul Teknik Fermentasi, praktikan akan
mengenal teknik pelaksanaan fermentasi dalam produksi biomassa.
III. Sasaran
Praktikum ini dilakukan agar praktikan dapat mengoperasikan fermentasi mulai
dari penyiapan medium, pelaksanaan dan pengakhiran fermentasi. Pada akhirnya
praktikan dapat menggambarkan kurva pertumbuhan mikroorganisme dan konsumsi
substratnya pada suatu proses fermentasi
IV. Tinjauan Pustaka
Fermentasi berasal dari bahasa Latin fervere yang berarti mendidihkan. Seiring
perkembangan teknologi, definisi fermentasi meluas, menjadi semua proses yang
melibatkan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk yang disebut metabolit
primer dan sekunder dalam suatu lingkungan yang dikendalikan. Pada mulanya istilah
fermentasi digunakan untuk menunjukkan proses pengubahan glukosa menjadi alkohol
yang berlangsung secara anaerob. Namun, kemudian istilah fermentasi berkembang lagi
menjadi seluruh perombakan senyawa organik yang dilakukan mikroorganisme yang
melibatkan enzim yang dihasilkannya. Dengan kata lain, fermentasi adalah perubahan
struktur kimia dari bahan-bahan organik dengan memanfaatkan agen-agen biologis
terutama enzim sebagai biokatalis. Produk fermentasi dapat digolongkan menjadi 4 jenis:
1. produk biomassa
2. produk enzim
3. produk metabolit
4. produk transformasi
Dalam bioproses fermentasi memegang peranan penting karena merupakan kunci
(proses utama) bagi produksi bahan-bahan yang berbasis biologis. Bahan-bahan yang
diuhasilkan melalui fermentasi merupaklan hasil-hasil metabolit sel mikroba, misalnya
antibiotik, asam-asam organik, aldehid, alkohol, fussel oil, dan sebagainya. Di samping
hasil-hasil metabolit tersebut, fermentasi juga dapat diterapkan untuk menghasilkan
Modul 1.07 Teknik Fermentasi Halaman 2 dar 24

biomassa sel mikroba seperti ragi roti (baker yeast) yang digunakan dalam pembuatan
roti. Untuk menghasilkan tiap-tiap produk fermentasi di atas dibutuhkan kondisi
fermentasi yang berbeda-beda dan jenis mikroba yang bervariasi juga karakteristiknya.
Oleh karena itu, diperlukan keadaan lingkungan, substrat (media), serta perlakuan
(treatment) yang sesuai sehingga produk yang dihasilkan optimal.
Pada percobaan ini digunakan ragi Saccharomycess cereviceae, yang bersifat
fakulktatif anaerobik. Pada kondisi aerobik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur
reaksi bioenergetik adalah oksigen. Pemanfaatan pada keadaan ini menghasilkan
penambahan biomassa sel dengan persamaan reaksi sebagai berikut:
C6H12O6 → CO2 + H2O + biomassa sel
Pada kondisi anaerobik, Saccharomycess cereviceae menggunakan senyawa
organik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik. Dalam hal ini
yang digunakan adalah glukosa dari substrat dengan hasil akhir perombakan berupa
alkohol (etanol), aldehid, asam organik, dan fussel oil. Reaksi yang berlangsung dalam
keadaan anaerobik tersebut adalah sebagai berikut:
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + produk samping
Pada percobaan ini digunakan glukosa sebagai substrat utama. Hal ini
disebabakan struktur model glikosa yang sederhana sehingga mudah digunakan oleh
Saccharomycess cereviceae. Glukosa digunakan sebagai sumber energi dan sumber
karbon yang digunakan untuk membentuk material penyusun sel baru.
Glukosa disebut juga reducing sugar sehingga pemanfaatannya oleh
Saccharomycess cereviceae dilakukan dengan mengoksidasi glukosa yaitu dengan cara
pemutusan ikatan rangkap pada gugus karbonil glukosa.
Media yang digunakan di dalam fermentasi harus memenuhi syarat-syarat
sebagai berikut:
1. mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel Saccharomycess
cereviceae
2. mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel
Saccharomycess cereviceae
3. tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel
4. tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam penggunaan
substrat.
Oleh karena itu, selain glukosa, ke dalam medium fermentasi juga ditambahkan zat-zat
lain yang berfungsi sebagai sumber makronutrien dan mikronutrien serta growth factor.

Proses pertumbuhan mikroba sangat dinamik dan kinetikanya dapat digunakaan
untuk meramal produksi biomassa dalam suatu proses fermentasi. Faktor utama yang
mempengaruhi pertumbuhan dan perilaku mikroba dapat digolongan dalam faktor
intraseluler dan faktor ekstraselular. Faktor intraselular meliputi struktur, mekanisme,
metabolisme, dan genetika. Sedangkan faktor ekstraselular meliputi kondisi lingkungan
seperti pH, suhu, tekanan.
Proses pertumbuhan mikroba merupakan proses yang memiliki batas tertentu.
Pada saat tertentu, setelah melewati tahap minimum, mikroba akan mengalami fasa
kematian. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan berhentinya pertumbuhan mikroba
antara lain:
1. Penyusutan konsentrasi nutrisi yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikroba
karena habis terkonsumsi.
2. Produk akhir metabolisme yang menghambat pertumbuhan mikroba karena
terjadinya inhibisi dan represi.
Pertumbuhan kultur mikroba umumnya dapat digambarkan dalam suatu kurva
pertumbuhan. Pertumbuhan mikroba dapat terbagi dalam beberapa tahap seperti pada
Gambar 1, antara lain:
1. Fasa stationer adalah fasa yang disebut fasa adaptasi/ lag phase. Pada saat ini
mikroba lebih berusaha menyesuaikan diri dengan lingkungan dan medium baru
daripada tumbuh ataupun berkembang biak. Pada saat ini mikroba berusaha
merombak materi-materi dalam medium agar dapat digunakan sebagai nutrisi
untuk pertumbuhannya. Bila dalam medium ada komponen yang tidak dikenal
mikroba, mikroba akan memproduksi enzim ekstraselular untuk merombak
komponen tersebut. Fasa ini juga berlangsung seleksi. Hanya mikroba yang dapat
mencerna nutrisi dalam medium untuk pertumbuhannya lah yang dapat bertahan
hidup.
2. Fasa pertumbuhan dipercepat adalah fasa dimana mikrioba sudah dapat
menggunakan nutrisi dalam medium fermentasinya. Pada fasa ini mikroba
banyak tumbuh dan membelah diri sehingga jumlahnya meningkat dengan cepat.
Laju pertumbuhan
μ = dX meningkat mencapai nilai maksimumnya.
dt
μ = laju pertumbuhan mikroba (sel/detik)
X = jumlah mikroba hidup

3. Fasa eksponensial adalah akhir fasa pertumbuhan dipercepat. Pada fasa ini laju
pertumbuhan tetap pada laju pertumbuhan maksimum (μmaks). Nilai μmaks ini
ditentukan oleh konstanta jenuh/ saturasi substrat. Nilai μmaks untuk setiap
mikroba juga tertentu pada masing-masing substrat.
4. Fasa pertumbuhan diperlambat mulai pada akhir fasa eksponensial. Pertumbuhan
mikroba yang begitu cepat tidak diimbangi tersedianya nutrisi yang cukup. Jika
fermentasi dilakukan secara batch, dimana umpan nutrisi dimasukkan hanya pada
awal proses fermentasi, pada waktu tertentu saat jumlah mikroba yang
mengkonsumsi nutrisi tersebut melebihi daya dukung nutrisi akan terjadi
kekurangan nutrisi. Hal lain yang memperlambat pertumbuhan mikroba adalah
terjadinya inhibisi ataupun represi yang terjadi karena terakumulasinya produk
metabolit sekunder hasil aktifitas fermentasi mikroorganisme.
5. Fasa kematian terjadi apabila nutrisi sudah benar-benar tidak dapat lagi
mencukupi kebutuhan mikroorganisme. Keadaan ini diperparah oleh akumulasi
produk metabolit primer dan sekunder yang tidak dipanen sehingga terus
menginhibisi ataupun merepresi pertumbuhan sel mikroorganisme. Selain itu
umur sel juga sudah tua, sehingga pertahan sel terhadap lingkungan yang berbeda
dari kondisi biasanya juga berkurang.
Gambar 1 Kurva Karakteristik Pertumbuhan Sel dalam Medium Fermentor

. Dalam percobaan ini, proses fermentasi ragi tersebut melalui 4 tahapan:
1. tahap persiapan medium fermentor
2. tahap sterilisasi
3. tahap pembuatan inokulum dan pengembangan starter
4. tahap pelaksanaan fermentasi
Tahap Persiapan Medium Fermentasi
Medium yang digunakan adalah medium cair yang terdiri dari 2 macam larutan.
Larutan pertama berisi garam-garam nutrisi untuk pertumbuhan ragi, sedangkan larutan
kedua adalah substrat yang umumnya berupa latutan glukosa dalam air. Nutrisi yang
diperlukan dalam medium petumbuhan ragi antara lain unsur N, S, O, H, Mg, K, Ca.
Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Kadar senyawa-senyawa
yang diperlukan supaya medium dapat mendukung pertumbuhan ragi secara optimal
harus ditentukan berdasarkan komposisi masing-masing unsur dalam sel ragi yang telah
banyak diteliti dan dibukukan.
Adapun komponen dari media yang digunakan adalah sebagai berikut:
a. Substrat utama
Sebagai substrat utama digunakan larutan glukosa. Karena glukosa adalah substrat
utama, maka pertumbuhan biomassa sel Saccharomycess cereviceae merupakan
fungsi dari konsentrasi glukosa. Hasil perombakan glukosa oleh sel adalah berupa
CO2 dan H2O.
b. Sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor.
Sebagai sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor umumnya
Laboratorium Mikrobiologi dan teknologi Bioproses Dept. Teknik Kimia ITB
menggunakan zat-zat sebagai berikut:
1. (NH4)2SO4 sebagai sumber nitrogen yang berguna bagi pembentukan asam
nukleat dan asam-asam amino.
2. K2SO4 sebagai sumber K+ yang merupakan kofaktor enzim
3. Na2HPO4.2H2O sebagai sumber Na dan P. Na berfungsi sebagai kofaktor dan P
berguna untuk sintesis asam nukleat, ATP, fosfolipid, dan senyawa yang
mengandung fosfor lainnya.
4. MgSO4 sebagi sumber Mg yang berperan di dalam stabilisasi ribosom,
stabilisasi membran dan dinding sel, serta berfungsi sebagai kofaktor enzim.
5. CaCl2 sebagai sumber Ca untuk stabilisasi dinding sel

6. ZnSO4 sebagai sumber Zn yang berfungsi sebagai regulator enzim
7. Fe(NH4)(SO4) sebagai sumber Fe, makronutrien pembentuk sitokrom pembawa
elektron dalam jalur transportasi elektron.
8. CuSO4 sebagai sumber Cu yang berperan penting dalam reaksi redoks
metabolisme.
9. yeast extract sebagai penyedia asam-asam amino tunggal, growth factor dan
berbagai vitamin yang dibutuhkan sel
10. aqua dm, sebagai media pelarut dan pengaduk dalam transportasi senyawa.
Setelah medium substrat dan medium nutrisi dicampurkan, diusahakan pH tetap 4-5
yang merupakan pH optimal pertumbuhan sel ragi.
Tahap Sterilisasi
Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga terbebas dari kontaminasi
mikroorganisme lain. Sterilisasi perlu dilakukan karena kontaminasi mikroba lain akan
memberikan dampak yang tidak menguntungkan sebagai berikut:
1. kontaminan meningkatkan persaingan di dalam mengkonsumsi substrat sehingga
akan mengurangi perolehan
2. kontaminan dapat menghambat proses metabolisme sel sehingga akan mengurangi
perolehan
3. kontaminan meningkatkan turbiditas sehingga dapat mengacaukan pengukuran
terhadap jumlah sel setiap saat.
Pada percobaan ini proses sterilisasi dilakukan di laboratorium dengan
menggunakan autoclave. Autoclave melakukan sterilisasi dengan menggunakan panas
lembab. Keuntungan penggunaan panas lembab dalam proses sterilisasi adalah
kelembaban mempermudah proses denaturasi protein sel kontaminan. Autoclave
dioperasikan pada tekanan 15 psia dan temperatur 121 oC selama 15 menit.
Pada saat sterilisasi beberapa lubang pada fermentor ditutup dengan kapas.
Tujuannya adalah untuk mengalirkan udara panas dari dalam fermentor sehingga tidak
terjadi tekanan yang terlalu tinggi di dalam fermentor selama sterilisasi. Sedangkan
tujuan lain penggunaan kapas adalah agar kehilangan uap air selama sterilisasi minimal.
Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi tidak
boleh disterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses
karamelisasi. Karamelisasi disebut juga proses reduksi Maillard. Proses ini terjadi karena
gugus karbonil pada glukosa bereaksi dengan gugus amonium atau protein dari medium

sehingga membentuk nitrogen hitam. Senyawa ini tidak dapat dioksidasi mikroba dan
disebut unfermented substrate. Akibat reaksi ini glukosa tidak dapat diuraikan oleh sel
ragi, bahkan menjadi inhibitor terhadap sel ragi tersebut.
Reaksi karamelisasi glukosa ini berlangsung sebagai berikut:
R-COH + NH2-R’ → R-COH-NH2 + produk lain
Karena itu, proses sterilisasi dilakukan terpisah. Larutan nutrisi dimasukkan
dalam fermentor dan disterilisasi sekaligus bersama fermentornya. Larutan glukosa
disterilisasi sendiri dalam erlenmeyer. Setelah fermentor dan medium steril dingin,
larutan glukosa steril dimasukkan secara aseptik ke dalam fermentor. Kemudian pH
diatur sampai 4,5 dengan menambahkan HCH steril 1 N. Nilai 4,5 adalah pH optimum
pertumbuhan ragi.
Tahap Penyiapan Inokulum
Setelah seluruh alat dan bahan steril, dilakukan inokulasi Saccharomycess
cereviceae dari biakan murni. Yang digunakan sebagai inokulum adalah biakan ragi pada
agar miring. Komposisi medium starter adalah sama dengan komposisi media fermentasi
dengan penambahan growth factor. Inokulum tersebut dimasukkan dalam campuran
larutan nutrisi dan substrat yang diambil sebagian dari fermentor dan dimasukkan dalam
labu erlenmeyer 150 mL. Tujuan dibiakkannya ragi dalam starter adalah
mengadaptasikan sel terhadap media fermentasi. Dengan adanya adaptasi pada starter ini
diharapkan lag phase sebagai tahap awal fermentasi dilewati. Biakan diusahakan tepat
berada pada akhir fasa logaritmik. Dengan demikian pertumbuhan sel ragi akan
maksimum dalam waktu yang relatif singkat.
Inokulasi Sacchromycess cereviceae dilakukan secara aseptis untuk menjaga
kemurnian biakan. Setelah dimasukkan dalam medium, inokulum tersebut diletakkan
dalam alat shaker selama, paling cepat, 16 jam. Fungsi shaker adalah mempermudah
difusi oksigen ke dalam medium sehingga kontak antara dan inokulum makin banyak dan
homogen. Hal ini penting dilakukan untuk menjaga kondisi biakan tetap aerobik. Jika
difusi oksigen dalam medium lancar, kadar DO (oksigen terlarut) dalam medium akan
cukup mendukung pertumbuhan sel secara aerobik. Jika sel hidup secara aerobik,
biomassa baru akan lebih banyak terbentuk daripada etanol. Dengan demikian pada akhir
masa inkubasi shaker ini diharapkan juga sel sudah berada pada akhir fasa logaritmik.

Tahap Pelaksanaan Fermentasi
Tahap ini dimulai saat inokulum yang telah beradaptasi dalam medium
dimasukkan dalam medium di fermentor. Pada praktikum ini fermentor yang dipakai
bervolume 5 liter. Fermentor adalah suatu reaktor yang dipersiapkan untuk melakukan
reaksi fermentasi yang dilengkapi dengan pengaduk, saluran aerasi, dan perlengkapan
lainnya.
Pelaksanaan fermentasi dilakukan dengan cara sebagai berikut:
1. Nutrisi, substrat, dan inokulan dimasukkan ke dalam fermentor yang dilakukan
secara aseptis. Nutrisi dimasukkan ke dalam fermentor sebelum disterilisasi
dalam autoclave. Substrat dan inokulan dimasukkan dengan cara memanaskan
mulut inlet dengan kapas yang dibakar kemudian medium dan inokulum
dimasukkan ke dalam fermentor.
2. Kemudian dilakukan kecepatan aerasi dan agitasi.
Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel ragi dalam bentuk
gelembung gas. Aerasi diatur pada kecepatan skala 9. Laju oksigen yang disuplai ke
dalam fermentor dijaga stabil. Fluktuasi laju alir oksigen ini dapat menurunkan unjuk
kerja fermentor karena laju transfer O2 tidak tetap sehingga metabolisme sel ragi
terganggu karena kadar DO yang tidak stabil. Agitasi berfungsi sebagai alat
penghomogen larutan fermentasi. Agitasi dilakukan pada kecepatan 600 rpm.
Pengadukan dilakukan oleh impeller yang berjumlah 3 buah. Semakin banyak impeller di
dalam fermentor semakin homogen larutan tersebut.
Laju alir udara dan pengadukan saling terkait satu sama lain. Pengaliran udara
berfungsi untuk menjaga suplai oksigen agar tetap sedangkan pengadukan akan
meningkatkan laju dispersi oksigen ke dalam larutan dan meratakan kadar oksigen di
seluruh medium fermentasi.
Di pinggiran fermentor juga terdapat baffle yang berfungsi mencegah terjadinya
vortex (pusaran air) sehingga dapat meningkatkan efisiensi aerator. Pengaturan udara
keluar dan masuk fermentor dilakukan sedemikian rupa sehingga kontaminasi dapat
diminimalkan, yaitu dengan cara menggunakan filter mikroba kapas pada aliran masuk
dan menggunakan larutan CuSO4 yang bersifat oligodinamik dan mampu membunuh
mikroba kontaminan.
Pencampuran inokulum ke dalam medium fermentor dilakukan secara aseptik
dengan menyalakan api di sekitar tempat pemasukan inokulum. Sebaiknya, sebelum
proses fermentasi dimulai, ke dalam medium fermentor ditambahkan zat antifoam yang

berfungsi mencegah terjadinya foaming. Zat antifoam yang banyak digunakan di industri
adalah silicon. Foaming terjadi karena protein terdenaturasi dalam medium fermentasi.
Selain menggunakan zat kimia, foaming juga dapat dicegah secara mekanik dengan
mengatur putaran agitator. Hal ini lebih sering dilakukan karena zat kimia yang terlalu
banyak ditambahkan ke dalam medium dapat menjadi inhibitor bagi pertumbuhan
mikroba.
Pada awal fermentasi diusakan pH medium adalah 4,5 yang optimal bagi
pertumbuhan ragi. Selama fermentasi pH medium sangat mungkin mengalami penurunan
karena terbentuknya asam organik sebagai produk samping fermentasi. Karena itu pH
medium harus dipantau, jangan sampai terlalu drop yang akan mengakibatkan sel ragi
mati.
Pengambilan dan Pengujian Sampel
Dalam percobaan fermentasi ini sampel untuk analisis diambil dari outlet sample
yang disebut sampling point. Untuk mencegah kontaminasi udara luar dan menjamin
bahwa sampel yang dianalisis adalah medium yang representatif pada kondisi tepat saat
pengambilan sampel tanpa terpengaruh kotoran dan sampel sebelumnya yang mungkin
ada di aliran sampling point, maka 5 mL pertama dari sampel harus dibuang. Analisis
yang diperlukan untuk percobaan ini adalah konsentrasi glukosa dan konsentrasi ragi
setiap waktu.
Penentuan konsentrasi sel ragi dan glukosa dilakukan dengan analisis
spektrofotometri. Prinsip spektrofotometeri adalah analisis turbidometri. Prinsip
turbidometeri adalah menganalisis konsentrasi suatu zat berdasarkan kekeruhannya
dibanding sampel blanko yang dianggap nilai 0 absorban atau full scale transmitan, atau
tidak mengandung konsentrasi zat yang dianalisis.
Pada penentuan konsentrasi sel ragi kekeruhan disebabkan oleh suspensi sel ragi.
Blanko yang digunkan adalah larutan medium yang persis sama dengan medium
fermentor, tetapi yang tidak dipakai sebagai medium pertumbuhan ragi. Analisis
dilakukan dengan mengambil data absorbansi. Untuk membuat kurva pertumbuhan
diperlukan kurva baku untuk mengkorelasikan antara konsentrasi sel terhadap absorbans.
Panjang gelombang yang digunakan untuk menganalisis konsentrasi sel adalah 600 nm.
Sampel untuk analisa konsentrasi glukosa harus disentrifugasi terlebih dahulu
untuk mengendapkan semua sel ragi sedemikian sampai larutan medium terlihat jernih
sehingga tidak mengganggu pancaran sinar saat diperiksa dengan spektrofotometri.

Sentrifugasi dilakukan selama 15 menit dengan kecepatan putaran 5000 rpm. Hasil
sentrifugasi adalah supernatan di bagian atas yang berupa cairan yang mengandung
glukosa residu (belum terkonsumsi sel ragi) dan endapan sel ragi di bagian bawah.
Jangkauan konsentrasi sampel yang dapat dideteksi akurat oleh spektrofotometri
sangat pendek. Karena itu larutan supernatan glukosa yang telah terpisah dari sel ragi
harus diencerkan dahulu. Data absorbansi spektofotometri dengan reagen Somogyi-
Nelson baru akurat pada konsentrasi 20-150 ppm.
Analisis pertama dilakukan dengan penambahan Somogyi 1 (yang mengandung
Na2SO4 anhidrat, KNa tartrat, Na2CO3, NaHCO3 ) yang berfungsi memberi kondisi basa,
dan larutan Somogyi 2 yang mengandung Cu SO4. Saat bereaksi dengan Somogyi 2
glukosa akan teroksidasi. Gugus karbonil glukosa akan teroksidasi menjadi karboksilat
sementara Cu2+ akan tereduksi menjadi Cu+. Reaksi redoks tersebut dalam kesetimbangan
akan menjadi:
Karbonil + Cu2+ + basa → Karboksilat + Cu2O + H+
Reaksi redoks ini hanya dapat berlangsung pada kondisi panas. Karena itu setelah
supernatan ditambahi Somogyi 2 campuran harus dipanaskan sampai reaksi mencapai
kesetimbangan. Reaksi oksidasi dihentikan dengan mendinginkan secara tiba-tiba
campuran tersebut dalam es batu. Analisis dilanjutkan dengan penambahan reagen
Nielson yang mengandung ansenomolibdate berwarna kuning. Penambahan Nielson
dimaksudkan untuk mengubah karboksilat yang ada menjadi gas CO2. Untuk
mengeluarkan gas ini, campuran harus dikocok. Setelah penambahan Nielson, larutan
akan berubah warna dari biru menjadi kuning. Campuran yang telah bebas CO2 tersebut
dianalisis dengan spektrofotometri. Untuk penentukan konsentrasi glukosa digunakan
panjang gelombang 520 nm. Panjang gelombang ini sesuai dengan intensitas warna
larutan yang berwarna hijau. Konsentrasi glukosa ditentukan dengan bantuan kurva baku
absorbasn terhadap konsentrasi glukosa.
Penentuan Growth Yield
Perolehan biomassa yang menunjukkan produktivitas proses fermentasi
dinyatakan sebagai perolehan (Yield). Growth yield ini dinyatakan dengan persamaan:
X −
X
0
S −
S
=
Δ
Y - X
S
Δ
=
0
dimana: X = massa sel saat t
X0 = massa sel awal

S = massa glukosa saat t
S0 = massa glukosa awal
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (μmaks)
Laju pertumbuhan spesifik mikroorganisme (μ) diformulasikan sebagai:
dX
X
dt
μ = 1
Nilai μ akan bernilai maksimum bila
dX
dt
bernilai maksimum.
dX
dt
adalah gradien kurva
pertumbuhan yang mununjukkan jumlah sel ragi setiap waktu. Nilai
dX
dt
maksimum pada
fasa logaritmik, dimana terlihat jumlah mikroba paling tinggi dan konstan selama
beberapa saat.
V. Rancangan Percobaan
V.1 Perangkat dan Alat Ukur
1. Fermentor batch seperti pada Gambar 2
2. Labu erlenmeyer
3. Spektrofotometer
V.2 Bahan/ Zat Kimia
1. Glukosa
2. Bahan-bahan nutrisi
3. Biakan mikroba dalam agar miring

Sensor
suplai
udara
Aerator
7 Inlet
Udara
Outlet Hole/
Sampling Point
Motor
Sensor
Putaran
Inlet
Hole
Liquid level
1
2
Impeller
3 Sparger
4 Filter
Mikroba
5
Baffle
Gambar 2 Perangkat Alat dan Instrumentasi Modul Fermentasi
Keterangan Gambar:
1. Inlet adalah tempat memasukkan inokulan dan medium
2. Pengaduk/impeller adalah alat untuk mendispersikan semua komponen di dalam
larutan sehingga larutan dalam fermentor menjadi homogen
3. Sparger adalah alat pemecah gelembung-gelembung udara agar gelembung udara yang
terbentuk berukuran kecil sehingga luas permukaan interfasanya lebih besar sehingga
laju difusi oksigen ke dalam lerutan labih cepat dan kadar oksigen terlarut meningkat
4. Filter mikroba adalah penyaring kontaminan mikroba dari udara kompresor yang
masuk. Filter yang digunakan adalah kapas.
5. Baffle adalah lempengan tipis di dinding fermentor yang bertujuan menghasilkan aliran
turbulen dan mencegah terbentuknya vorteks.
6. Sampling point adalah saluran tempat sampel diambil.
7. Inlet udara adalah tempat udara aerasi masuk ke dalam fermentor.

V.3 Prosedur Kerja
V.3.1 Penyiapan Medium
Proses penyiapan medium dilakukan mengikuti diagram kerja yang ditunjukkan
pada Gambar 3
Komponen-komponen
Nutrisi
Masukkan
Labu Kocok
Campurkan, Larutkan
dalam air, Aduk
Larutan Nutrisi untuk
Medium
Tambah asam/basa, atur
sampai pH 4,5
Larutan Nutrisi pH 4,5
Masukkan
Fermentor
Larutan Substrat
untuk Medium
Masukkan
Autoclave
Glukosa
Labu Kocok
Atur suhu 121 oC dan tekanan 15 psi
Sterilisasi fermentor+medium dan
larutan glukosa
Autoclave shut down
Fermentor + Medium steril
Dinginkan
Keluarkan fermentor
Lar. Substrat steril
Gambar 3 Penyiapan Medium

V.3.2 Pengembangan Kultur Ragi dalam Labu Kocok
Pengembangan kultur ragi dalam labu kocok untuk fasa adaptasi dikerjakan
sesuai prosedur kerja yang ditunjukkan pada Gambar 4.
Isikan perlahan
2 Labu Erlenmeyer 500 mL
@ 135 mL lar Nutrisi
2 Labu Erlenmeyer
berisi 135 mL lar Nutrisi
Larutan Substrat untuk Medium
Masukkan
Autoclave
Glukosa
Labu Kocok
Atur suhu 121 oC dan tekanan 15 psi
Sterilisasi lar. nutrisi dalam
erlenmeyer dan larutan glukosa
Lar. nutrisi steril
Autoclave shut down
Dinginkan
Keluarkan lar. nutisi dan lar. glukosa
Lar. glukosa steril
Masukkan 10 mL
Lar. nutrisi dengan
glukosa steril
Biakan ragi dalam
agar miring
Inokulasikan
Dinginkan
Lar. nutrisi dengan
glukosa steril dingin
Inokulum
Kocak pada shaker 30 0C
Kultur siap
digunakan
Gambar 4 Proses Pengembangan Kultur Ragi

V.3.3 Proses Fermentasi
Proses fermentasi ini adalah percobaan utama. Fermentasi dilakukan sesuai
prosedur yang ditunjukkan pada Gambar 5
Fermentor
Instalasikan dengan benar
atur T = 30 0C, r =600
rpm, laju aerasi 1,5 v/v/m
Fermentor siap pakai Kultur ragi yang telah
didiamkan 16 jam
Tuangkan secara steril
dan aseptik (dekat api)
Fermentasi dimulai
catat waktu
atur pH 4,5
Lakukan prosedur pengambilan sampel dari sampling point
Sampel
Gambar 5 Fermentasi Ragi dalam Fermentor

V.3.4 Pengujian Sampel
Pada sampel akan dianalisis konsentrasi sel ragi dan konsentrasi glukosanya. Analisis
tersebut dilakukan sesuai prosedur pada Gambar 6.
Fermentor
Catat waktu setiap 1 jam
Atur pH 4,5
Sampling Point
Ambil sampel tiap 1 jam,
teknik aseptik
Sample
Ambil 5 mL, buang
Sample
Ambil 10 mL
Ambil 6 mL Ambil 4 mL
Sampel untuk
Pengukuran
Konsentrasi Sel
Spektrofotometer
Tunggu 15 menit agar
panas
Atur Ambil 6 mL panjang
gelombang 600 nM
Jaga agar absorbansi
tetap 0,2 - 0,7
Spektrofotometer siap
pakai
Sampel untuk
Pengukuran
Konsentrasi Glukosa
Ukur absorbansi sampel
Data absorbansi sel
pada sampel
Penentuan konsentrasi sel
Kurva baku absorbansi
vs konsentrasi sel
Ambil 2 mL
Sentrifugasi pada 5000
rpm, 15-20 min.
Supernatan
Encerkan hingga kadar
glukosa dalam larutan
berkisar 20-120 mg/L
Supernatan Encer
1,6 mL Somogyi I
0.4 mL Somogyi II
Campuran reaksi
Kocok, Tutup
Panaskan 10 mL
Dinginkan secara cepat
Masukkan ke dalam es
5 min.
Campuran reaksi
Analisis
2 mL Nielson
4 mL Aqua DM Kocok, hingga semua
CO2 keluar
Supernatan bebas CO2
Konsentrasi Sel
Spektrofotometer
Tunggu 15 menit agar panas
Atur Ambil 6 mL panjang gelombang 520 nm
Jaga agar absorbansi tetap 0,2 - 0,7
Spektrofotometer siap
pakai
Data absorbansi Konsentrasi
Glukosa pada sampel
Kurva baku absorbansi
vs kons. glukosa
Ukur Absorbasnsi Lar.
Glukosa
Konsentrasi Glukosa
Gambar 6 Prosedur Pengujian Sampel

V.4 Data Pengamatan
Data yang diambil untuk mendapatkan kurva pertumbuhan mikroba dan
kurva konsentrasi glukosa setiap waktu adalah:
1. Absorbansi / % transmitan suspensi ragi
(g/mL) log [sel] Agitasi
t (jam) %trans. Absorbansi [sel]
(rpm) pH Aerasi
2. Absorbansi / % transmitan larutan glukosa
t (jam) %trans. Absorbansi [gluksosal]
(g/mL)
log
[glukosa]
Agitasi
(rpm) pH Aerasi
V.5 Data Literatur
Data literatur yang dibutuhkan untuk praktikum Modul teknik fermentasi
antara lain:
1. Kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi sel kering (mg/mL)
2. Kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi glukosa (mg/mL)
V.6 Langkah Perhitungan
V.6.1 Pembuatan Kurva Baku Absorbansi terhadap Konsentrasi Sel dan Kurva
Baku Absorbansi terhadap Konsentrasi Glukosa
Sebagai contoh berikut adalah data berat sel kering terhdap absorbansi pada
panjang gelombang 600 nm
Berat sel kering (mg/mL) Absorbansi
0.4 0.06
1.09 0.18
1.81 0.28
2.5 0.39
3.72 0.57
5.31 0.83
5.89 0.92
6.9 1.08
7.79 1.21
8.48 1.34

Pengaluran data absorbansi terhadap berat sel kering tersebut ditunjukkan pada
grafik berikut.
Kurva Baku Konsentrasi Sel
y = 6.379x + 0.013
R2 = 0.9997
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 0.5 1 1.5
Absorbansi
Konsentrasi Sel (mg/mL)
Dari grafik tersebut terlihat bahwa hubungan antara absorbansi dan konsentrasi
sel kering cenderung linear mengikuti persamaan:
Konsentrasi sel kering = 6.379 Absorbansi + 0.013
Misalkan data hubungan absorbansi terhadap konsentrasi glukosa adalah:
Konsentrasi glukosa (mg/mL) Absorbansi
0 0
20 0.198
40 0.403
60 0.595
80 0.8
100 1
120 1.213
140 1.403
Maka kurva baku bsorbansi terhadap konsentrasi glukosa adalah:
Kurva Baku Konsentrasi Glukosa
y = 99.447x + 0.2381
R2 = 0.9999
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 0.5 1 1.5
Absorbansi
Konsentrasi Glukosa (mg/mL)

V.6.2 Perhitungan Absorbansi
Perhitungan ini dilakukan jika yang terbaca pada spektrofotometer adalah %
transmitan.
Persamaan yang dipakai: A = - log T
V.6.3 Penentuan Konsentrasi Sel
Persamaan yang dipakai: C = Faktor Kalibrasi . Absorbansi
V.6.4 Penentuan Konsentrasi Glukosa
Persamaan yang dipakai ;C = Faktor Kalibrasi . Faktor Pengenceran. Absorbansi
V.6.5 Contoh Perhitungan
Misalkan setalah 3 jam fermnetasi didapat data:
- % transmitan suspensi sel adalah 64.4, tanpa pengenceran
- % transmitan larutan glukosa adalah 59.4 setelah pengenceran 250 kali.
Maka:
- Absorbansi suspensi sel = -log 0.644 = 0.1911
- Konsentrasi suspensi sel berdasarkan kurva baku tersebut adalah:
6.379.0.1911+0.013 = 1.221 mg/mL
- Absorbansi larutan glukosa = -log 0.594 = 0.2262
- Konsentrasi larutan glukosa berdasarkan kurva baku diatas dan sebelum
diencerkan adalah:
250.(99.447.0.2262+0.2381)=5.6325 mg/mL
V.6.6 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel dan Kurva Konsentrasi Glukosa Tiap
Saat
Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan mengalukan data waktu (jam) di
sumbu x terhadap konsentrasi suspensi sel (mg/mL) pada sumbu y. Sedangkan
Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan mengalukan data waktu (jam) di sumbu x
terhadap konsentrasi larutan glukosa (mg/mL) pada sumbu y.

Misalkan diperoleh data fermentasi berikut:
t
(jam) %trans. Absorbansi [sel]
mg/mL log [Sel] pH Aerasi Agitasi
(rpm)
0 99 0.0043648 0.0408431 -1.388881 4.5 9 600
1 76 0.1191864 0.7732901 -0.1116576 4.5 7 600
2 66 0.1804561 1.1641292 0.0660012 4.5 9 600
3 61 0.2146702 1.382381 0.1406278 4.5 9 600
4 57 0.2441251 1.5702743 0.1959755 4.5 6.5 600
5 54 0.2676062 1.7200602 0.2355436 4.5 9 600
6 47 0.3279021 2.1046878 0.3231877 4.5 7.5 600
7 41 0.3872161 2.4830518 0.3949858 4 7 600
8 33 0.4814861 3.0843996 0.4891706 4 8.5 600
9 26 0.5850267 3.744885 0.5734385 4 8 600
10 21 0.6777807 4.3365631 0.6371457 4 6.5 600
11 18 0.7447275 4.7636167 0.6779368 4 7 600
12 16 0.79588 5.0899186 0.7067108 4 8 600
13 15 0.8239087 5.2687139 0.7217046 4 8 600
14 15 0.8239087 5.2687139 0.7217046 4 6.5 600
Maka Kurva Pertumbuhan Biomassa Sel adalah:
Kurva Pertumbuhan Sel
6
5
4
3
2
1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Waktu (jam)
Konsentrasi Sel (mg/mL)

Dan berikutnya adalah hasil pengujian konsentrasi glukosa yang tertinggal dalam
medium dan yang terkonsumsi.
t
(jam) %trans. Absorbansi Pengencaran
[glukosa]
residu
mg/mL
[glukosa]
konsumsi
mg/mL
log
[glukosa]
residu
mg/mL
log
[glukosa]
kopsumsi
mg/mL
0 30 0.5228787 500 0.1044736 0 -0.9810
1 32 0.49485 500 0.0988989 0.0055747 -1.0048 -2.2538
2 35 0.455932 500 0.0911583 0.0133153 -1.0402 -1.8756
3 36 0.4436975 500 0.088725 0.0157487 -1.0520 -1.8028
4 38 0.4202164 500 0.0840547 0.0204189 -1.0754 -1.6900
5 40 0.39794 500 0.0796241 0.0248496 -1.0990 -1.6047
6 42 0.3767507 500 0.0754097 0.029064 -1.1226 -1.5366
7 44 0.3565473 500 0.0713913 0.0330823 -1.1464 -1.4804
8 45 0.3467875 500 0.0694502 0.0350235 -1.1583 -1.4556
9 55 0.2596373 500 0.0521165 0.0523571 -1.2830 -1.2810
10 56 0.251812 500 0.0505601 0.0539136 -1.2962 -1.2683
11 60 0.2218487 500 0.0446006 0.0598731 -1.3507 -1.2228
12 64 0.19382 500 0.0390258 0.0654478 -1.4086 -1.1841
13 78 0.1079054 500 0.0219379 0.0825357 -1.6588 -1.0834
14 98 0.0087739 500 0.0022213 0.1022524 -2.6534 -0.9903
Dan kurva Konsentrasi Glukosa (Residu dan Konsumsi) adalah:
Konsentrasi Residu dan Konsumsi Glukosa
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Waktu (jam)
Konsentrasi Glukosa (mg/mL)

V.6.7 Penentuan Growth Yield
Persamaan yang digunakan:
X −
X
0
S −
S
=
Δ
Y - X
S
Δ
=
0
Dari hasil percobaan diperoleh konsumsi total glukosa selama fermentasi adalah:
10 mg/L –(500*0.0022 mg/L) = 8.9 mg/mL
Sedangkan pertumbuhan total sel ragi adalah:
5.2687 mg/mL – 0.0408 mg/mL = 5.228 mg/mL
Maka yield pertumbuhan proses fermentasi ini adalah:
0.587
Y = - 5.228 =
8.9
V.6.8 Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum
Persamaan yang digunakan:
fasa logaritmik
lnX - lnX
awal akhir


μ =
maks t


Δ
Pada kurva logaritmik pertumbuhan sel berikut ini terlihat bahwa fasa
logaritmik berlangsung pada jam ke-4 sapai jam ke-11. Saat itu ln X4 = 0.1959
dan ln X11 = 0.6779.
Kurva Pertumbuhan Sel
1
0.5
0
-0.5
-1
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Waktu (jam)
Log Konsentrasi Sel

Maka dapat diperkirakan:
0.069 sel/jam
0.6779 - 0.1959

μ = 

= maks 7

Daftar Pustaka
1. Bailey, J.E., and Ollis, D.F., Biochemical Enginering Fundamentals, McGraw-Hill
Kogakusha Ltd., Tokyo, 1987
2. Soeryo, W, Kinetika Pertumbuhan Mikroba.

Fer teknik-fermentasi

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Fer teknik-fermentasi

Similar to Fer teknik-fermentasi (20)

Fer teknik-fermentasi