Rekayasa genetika

1. Member Of Group
1. Ririane Sefty Guti
2. Amanah Siregar
3. Puji Astuti
4. Yessika Resonya Silitonga
5. Ridwan Adha

2. GFP

3. Green
Fluorescen
t
Protein

4. What is
GFP ?

5. What is GFP ?
Lets to study english now!!
Green (hijau) fluorescent (sinar)
Protein (protein)
Sekelompok protein dengan struktur mirip satu sama lain yang
pendaran warna hijau apabila disorot/dipapar dengan cahaya biru di
rentang untraviolet

6. History of GFP
• Protein ini pertama kali diisolasi dari ubur-ubur Aequorea victoria yang mampu
memendarkan cahaya hijau pada tahun 1962 oleh Osamu Shimomura. Namun
kegunaannya sebagai alat deteksi biologi molekuler masih belum jelas sampai pada awal
tahun 1992.
• Douglas Prasher melaporkan keberhasilannya dalam mengkloning dan mendapatkan sekuen
nukleotida GFP. Keberhasilan kloning tersebut dilanjutkan dengan aplikasi GFP pada dua
sistem organisme prokaryotik (bersel tunggal) dan eukaryotik (multi sel/organisme tingkat
tinggi). Organisme prokaryotik yang digunakan adalah Escherichia coli, sedangkan organisme
eukaryotiknya adalah cacing dari filum nematoda (cacing gelang) yaitu Caenorhabditis
elegans. Hasilnya sangat memuaskan. Ekspresi GFP cukup stabil pada kedua sistem tersebut
• "Lukisan" pantai San Diego pada media biakan bakteri yang memiliki mutasi warna
GFP yang berbeda-beda, dibuat oleh staf laboratorium Roger Tsien
• Pemanfaatan GFP menjadi meluas setelah gen-gen yang bertanggung jawab
atasnya berhasil ditemukan dan kemudian digunakan secara luas dalam biologi
molekular sejak tahun 1990-an berkat kerja dari Martin Chalfie dalam teknik yang
dikenal sebagai reporting system ("Sistem pelaporan"). Teknik ini melibatkan
sejumlah gen dengan karakteristik khas karena menghasilkan substansi yang mudah
dilacak mata, sehingga disebut gen pelapor (reporter genes), dan bermanfaat
sebagai penunjuk secara fisik atas ekspresi suatu gen tertentu pada organisme.

7. Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien
Martin Chalfie , Osamu Shimomura , dan Roger Y. Tsien
yang dianugerahi 2008 Penghargaan Nobel dalam
Kimia pada tanggal 10 Oktober 2008 untuk penemuan
dan pengembangan mereka dari Green
Fluorescent
Protein (GFP).

8. Aequorea victoria

9. Lukisan pantai San Diego pada media
biakan bakteri yang memiliki mutasi warna
GFP yang berbeda-beda, dibuat oleh staf
laboratorium Roger Tsien

10. Roger Tsien berhasil membuat
GFP ubur-ubur berwarna-warni.

11. What Is the Meaning Of
Protein ??

12. Protein
Protein tersusun dari berbagai asam
amino yang masing-masing dihubungkan
dengan ikatan peptida.
Pada GFP terdapat 238 residu asam
amino
Pada awal pembentukannya protein
hanya tersusun dari 20 asam amino yang
dikenal sebagai asam amino
dasar atau asam amino baku atau asam
amino penyusun protein

13. Fungsi Protein
Protein Struktural: Penguat sel.
Protein Cadangan: Penyimpanan
dalam bentuk asam amino.
Protein Enzimatik:
Mempercepat/katalis reaksi

14. Struktur protein pada GFP
Identifikasi
Simbol Sebutan
Pfam PF01353
Pfam clan CL0069
InterPro IPR011584
SCOP Lema
SUPERFAMILY Lema
PDB RCSB PDB, PDBe, PDBj
PDBsum Stucture summary

15. BIOLUMINESCENCE
Bioluminescence adalah fenomena
terutama laut. Ini adalah sumber utama
cahaya dalam fraksi terbesar dari volume
dihuni bumi, laut dalam. Sebaliknya,
bioluminescence pada dasarnya tidak ada
(dengan beberapa pengecualian) di air tawar,
bahkan di Lake Baikal. Di darat hal ini paling
sering dilihat sebagai jamur bercahaya pada
kayu (disebut Foxfire), atau dalam beberapa
keluarga serangga bercahaya.

16. Ikan aristostomias memiliki lebih dari satu organ cahaya

17. How to Aplication GFP ?

18. Tahap Aplikasi GFP
1.Fusi Translasi
2.Fusi Transkripsi
3.FLIP dan FRAP
4.FRET

19. Fusi Translasi
Teknik pertama dikenal dengan fusi
translasi, dimana ORF (Open Reading Frame)
GFP diklon di belakang ORF gen yang akan
kita amati, sehingga nanti akan ditranslasi
menjadi sebuah protein gabungan yang
panjang. Jadi jika kita melihat pendaran GFP
maka berarti protein yang kita amati pun
terekspresi di situ. Cahaya fluorescent GFP
dapat diamati dalam bentuk gambar diam
maupun bergerak sehingga kita dapat

20. Fusi Transkripsi
Teknik kedua disebut fusi transkripsi dimana
ekspresi gen yang kita amati dan GFP
digerakkan melalui promoter yang sama tetapi
antara kedua gen tersebut diselingi oleh stop
kodon, jadi ekspresinya berbarengan namun
tetap menghasilkan dua protein terpisah. Dalam
hal ini sel yang mengekspresikan gen pertama
akan dipenuhi oleh GFP yang larut sehingga
berpendar, dan bisa mendeteksi sel mana yang
mengekspresikannya.

21. FLIP dan FRAP
Kita tahu bahwa suatu molekul mengemisikan
cahaya fluorescent ketika ia tereksitasi, namun
kondisi ini tidak berlangsung selamanya, dalam
jangka waktu tertentu cahayanya akan redup dan
padam. Nah, FLIP dan FRAP ini digunakan untuk
mempelajari dinamika protein yang terlabel GFP.
Caranya dengan bleach-out (memadamkan)
daerah tertentu pada sel, kemudian dilihat berapa
lama waktu yang diperlukan oleh protein terlabel
protein untuk “merembes” kembali ke area gelap
tadi, teknik ini yang disebut FRAP (Fluorescent
Recovery After Photobleaching). Kita juga dapat
mengamati seberapa besar penurunan intensitas
fluorescent secara keseluruhan di bagian sel yang

22. FRET
FRET atau fluorescence resonance energy
transfer sudah banyak diaplikasikan dalam
beberapa teknik seperti Real Time PCR.
Prinsipnya yaitu dengan memanfaatkan dua buah
fluophore (zat yang dapat berfluorescent) yang
mana fluorophore pertama memiliki spektrum
emisi yang tumpang tindih dengan spektrum
eksitasi fluorophore kedua. Jadi ketika fluorophore
pertama memancarkan cahaya fluorescent,
otomatis yang kedua pun akan tereksitasi dan
memancarkan fluorescent. Dalam aplikasinya, dua
buah protein dilabel dengan dua macam GFP yang
memenuhi kriteria FRET tadi. Kemudian sel
ditembak dengan laser yang dapat mengeksitasi

23. Video Proses GFP

24. Sel yang mengekspresikan GFP

25. Struktur GFP

26. Aplikasi GFP
Fluorescence Microscopy
GFP juga dapat dinyatakan dalam struktur yang
berbeda memungkinkan perbedaan morfologi
• GFP digunakan secara luas dalam penelitian
kanker untuk label dan melacak sel-sel kanker
• Monitor sensitif proses intraseluler melalui
laser sistem EGFP terbuat dari garis sel ginjal
embrio manusia

27. Hewan Peliharaan Transgenik
• Ikan zebra fluorescent hijau ( glofish )
• Tikus fluorescent hijau (neonmice)
• Babi neon hijau (noels)
• Kucing hijau neon, model untuk penyakit terutama HIV
• Anjing-anjing menyalakan lampu neon merah , dan
mereka dimaksudkan untuk memungkinkan para
ilmuwan untuk mempelajari gen yang menyebabkan
penyakit manusia seperti narkolepsi dan kebutaan
GFP Dalam Seni Rupa
• Julian Voss - Andreae berbasis - GFP patung Baja
Jellyfish ( 2006)
etc

28. • Anti Kanker
Anti kanker Inc telah mengembangkan tikus
transgenik telanjang, lihat gambar di bawah
Tikus di bawah cahaya biru (kiri) tikus yang sama di bawah sinar normal (kanan)
Ketika cahaya biru bersinar pada mouse setiap sel (yang mengandung aktin)
di dalam tubuhnya akan berpendar hijau. Kanker pada manusia yang mengekspresikan
DsRed dapat ditanamkan ke tikus. Kanker akan memberikan off fluoresensi merah.
Sekarang sel-sel kanker dengan mudah dapat diamati dan dipantau pada tikus hijau
hidup. Sehingga memungkinkan para peneliti di antikanker Inc untuk mengamati
metastasis (sel kanker bergerak di sekitar tubuh) dan angiogenesis (pembuluh darah
tumbuh menjadi kanker dan memasok oksigen dan makanan).

29. Babi neon
hijau (noels)

30. Alat penditeksi kanker yang terdapat
pada tikus

31. Video Hasil Ekspresi Gen GFP

32. Perkembangan GFP
Gen GFP dapat diperkenalkan ke organisme dan
dipelihara dalam genom mereka melalui
pemuliaan , injeksi dengan vektor virus , atau
transformasi sel .
Sampai saat ini , gen GFP telah diperkenalkan
dan disajikan dalam berbagai Bakteri , ragi dan
lainnya Jamur , ikan (seperti ikan zebra ) ,
tanaman , terbang , dan sel mamalia ,
termasuk manusia

33. Akhir-akhir ini, GFP fusion system digunakan untuk mengetahui
ekspresi (localization) suatu gen dengan menggunakan onion
epidermal cells atau protoplast. Pada umumnya promoter yang
dipakai untuk GFP fusion adalah 35S sehingga konstruk akhir menjadi
p35S:gen/cDNA:GFP. Ekspresi yang muncul tersebut sering disebut
dengan transient expression dari suatu gen.
Konstruk 35S:BIK1:GFP (menggunakan promoter 35S dan gen
BIK1:GFP fusion). BIK1 adalah protein kinase yang bertanggung jawab
terhadap resistensi dari infeksi serangan jamur Botrytis cinerea.
Ekspresi BIK1 terletak pada plasma membran sel sedangkan GFP yang
digunakan sebagai kontrol terekspresi pada sitoplasma dan nukleus.
Ekspresi BIK1 pada plasma membran sesuai perannya sebagai gen
resiten jamur. Hal ini berkaitan dengan proses infeksi dari kebanyakan
jamur yaitu melalui perusakan dinding sel dan membran sel.

34. Video Pembuatan Zat GFP

35. Proses Onion Epidermal Cells
35S:BIK1:GFP
1) Mereaksikan konstruk gen:GFP fusion dengan
reaction mixture yang mengandung gold particle,
CaCl2 dan spermidine.
2) Diamkan (inkubasi) dalam es kurang lebih 10 menit
3) Bilas dengan alkohol. Kering-anginkan dan letakkan
pada carrier (pembawa) sampai benar-benar kering
(alkohol menguap sempurna).
4) Masukkan pada mesin bombardment dan tembakkan
pada onion cell yang telah tersedia.
5) Letakkan dalam ruang gelap semalam, dan keesokan
harinya bisa dilihat dengan mikroskop.

36. Selain onion epidermal cells, ada satu lagi sistem yang
bisa digunakan untuk melihat transient expression dari
suatu gen yaitu menggunakan protoplast. Protoplast
adalah sel yang telah dihilangkan dinding selnya dengan
cara mekanik atau enzimatik. Isolasi protoplast dari
organ tanaman (misalnya seedling atau daun muda)
biasanya dilakukan secara enzimatik dengan
menggunakan enzim untuk merusak dinding sel.
Selulase, pektinase dan xylanase adalah beberapa
contoh enzim tersebut. Protoplast selanjutnya bisa
digunakan sebagai media untuk melihat transient
expression dari suatu gen. Namun tidak seperti onion
epidermal cells yang menggunakan bombardment,
transformasi konstruk gen ke protoplast menggunakan
electroporation atau PEG-mediated transformation.

37. KEUNGGULAN GFP
GFP fusion system memiliki keunggulan
tersendiri yaitu tidak memerlukan suatu
substrat sehingga deteksinya cukup
menggunakan mikroskop. Selain itu GFP juga
tidak bersifat toksik sehingga pengambilan
gambar bisa menggunakan sel hidup (in vivo
imaging).

38. That’s all, thank
you.. .