Wyklad 8

Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków

Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią
ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele
wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów
(antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe
(antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie,
hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym,
immunosupresyjnym i innym.

- wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych;
- połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie
- zastosowanie medyczne – około 150

Potencjalne dalsze możliwości:
- z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000
- z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000
- bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne

Przedmiot: Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna

Metabolizm wtórny – przemiany peryferyjne

Biosynteza metabolitów wtórnych rozpoczyna się w momencie wyczerpania źródeł
substratu pokarmowego limitującego wzrost drobnoustrojów


ANTYBIOTYKI
Substancje małocząsteczkowe
wytwarzane przez organizmy żywe
(głównie drobnoustroje) hamujące
wzrost lub zabijające drobnoustroje


Promieniowce są głównymi producentami antybiotyków


NIETYPOWI PRODUCENCI

Wytwarzane przez cis kalifornijski
(Taxus brevifolia)

Wytwarzane przez żabę afrykańską
(Xenopus laevis)

Wytwarzana przez rekina
(Squalus acanthias)


CHEMOTERAPIA – leczenie poprzez działanie chemoterapeutyku, czyli
substancji chemicznej selektywnie toksycznej, tzn. takiej, która hamuje wzrost
lub zabija czynniki inwazyjne (baterie, grzyby, komórki nowotworowe, wirusy),
czyniąc jednocześnie jak najmniejsze szkody komórkom organizmu leczonego

ANTYBIOTYKI – substancje chemiczne pochodzenia naturalnego, tzn.
produkowane przez organizmy, które hamują wzrost lub zabijają inne organizmy

SELEKTYWNOŚĆ DZIAŁANIA – oddziaływanie tylko z jednym rodzajem celu
molekularnego w czynniku inwazyjnym

CEL MOLEKULARNY – biomakromolekuła (białko, kwas nukleinowy) lub
struktura supramolekularna (błona biologiczna, ściana komórkowa), z którą
oddziałuje chemoterapeutyk. Wynikiem tego oddziaływania jest efekt toksyczny
wobec czynników inwazyjnych zawierających cel molekularny


Paul Ehrlich

Urodzony w roku 1854 w Strzelinie
(wówczas Strehlen)

Wprowadził pojęcie „magicznej kuli”

Pierwszy nowoczesny chemoterapeutyk
– arsfenamina - stosowany w latach
1910 – 1940 w leczeniu syfilisu, odkryty
został przez pracującego w zespole Ehrlicha
Japończyka Sachahiro Hata

Arsfenamina produkowana była przez
koncern Hoetsch pod nazwą Salvarsan


Penicylina G została odkryta przez Aleksandra Fleminga

1921 – odkrycie lizozymu
1929 – odkrycie penicyliny G

Pomnik Aleksandra Fleminga w Madrycie


Główne klasy antybiotyków
Cefalosporyny
Tetracykliny

Penicyliny

Makrolidy
Aminoglikozydy


CEL- ŚCIANA KOMÓRKOWA (biosynteza i organizacja)

Penicyliny

Peptydoglikan


Penicylina G – działa tylko na bakterie gramdodatnie, nie wytwarzające β-laktamazy.
Rozpada się w żołądku.

Ampicylina (u góry) i amoksycylina (u dołu)
– działają na bakterie gramujemne.

Penicylina V – jak Penicylina G,
ale trwała w żołądku


CEL – BIOSYNTEZA BIAŁKA


CEL – DNA


Antybiotyki przeciwnowotworowe
Antybiotyki antracyklinowe
Daunorubicyna – producent Streptomyces
peuceticus.

Łączą się DNA, hamując replikację

Komórki nowotworowe rozmnażają się
intensywnie, w sposób niekontrolowany

Spośród „normalnych: komórek organizmu
Intensywnie namnażają się tylko komórki
włosów i szpiku kostnego.

Chemoterapia antybiotykami
przeciwnowotworowymi może prowadzić
do uszkodzenia szpiku

CEL – BŁONA KOMÓRKOWA

Walinomycyna


Antybiotyki przeciwgrzybowe

Łączą się z ergosterolem, składnikiem grzybowej
błony cytoplazmatycznej, powodując tworzenie
kanałów
W błonie komórek ludzkich występuje zamiast
ergosterolu cholesterol, z którym antybiotyki
przeciwgrzybowe łączą się nieco mniej chętnie

Efekty uboczne chemoterapii Amfoterycyną B

Wymioty, biegunka, bóle głowy, gorączka,
uszkodzenie nerek i wątroby, neurotoksyczność,
drastyczne obniżenie ilości erytrocytów


Oporność na antybiotyki

•oporność specyficzna – wobec określonego związku
lub grupy podobnych strukturalnie substancji

•oporność wielolekowa (krzyżowa, MDR)
– utrata wrażliwości na działanie
wielu niepodobnych strukturalnie leków

Przedmiot: Podstawy Biotechnologii
OPORNOŚĆ SWOISTA Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna

Przykład: aktywność enzymu β-laktamazy jest przyczyną oporności swoistej
bakterii na działanie penicyliny G

Kwas klawulanowy – inhibitor
β-laktamazy
Floksacylina – półsyntetyczna penicylina
działająca na bakterie produkujące β-laktamazę

OPORNOŚĆ WIELOLEKOWA

Do wyrzucania cząstek leku potrzebna jest energia

Rodzaje transporterów wielolekowych

Białka typu ABC Białka typu MFS

Wykorzystują energię hydrolizy ATP Wykorzystują energię
do wyrzucania cząsteczek leku gradientu protonowego
do wyrzucania cząsteczek leku


Drobnoustroje jako źródło nowych substancji czynnych


Poszukiwanie antybiotyków
Wysokowydajne techniki przesiewowe
(high throughput screening)
(próbki ze środowiska, biblioteki związków)
- skrining chemiczny
- skrining biologiczny
- skrining ukierunkowany

Racjonalne projektowanie:
- de novo
- modyfikacje istniejących związków


Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne

Cechy szczepu wysokowydajnego
maksymalna wydajność pożądanego produktu
minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych
stabilność genetyczna
odporność na zakażenia wirusowe

Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych

nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza
wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów
optymalizacja warunków wzrostu

Przykład wyniku optymalizacji szczepu:
Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G

oryginalny szczep producencki 0.1 mg/ml
szczep zoptymalizowany 30 mg/ml


Mutagenizacja szczepów
mutagen komórki
zabite
(1) (4) (5)

genotyp genotyp (3) genotyp
wyjściowy uszkodzony trwale zmutowany

(2) (6)

1 – mutacje pierwotne populacja
mutantów
2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego
3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne
4 – śmierć komórki
5 – śmierć komórki
6 – namnażanie zmutowanych komórek
Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy


Schemat etapów procesu fermentacyjnego wytwarzania idiolitu


Produkcja penicyliny G lub V

Producent: Penicillum chrysogenum
Szczepy produkcyjne wytwarzają do
70 g z litra hodowli. Wydajność szczepu
wyjściowego – 60 mg z litra
Główny sposób konstrukcji szczepów
wysokowydajnych – powielenie genów
biosyntezy (do 20 kopii)

Prekursor – kwas fenylooctowy
lub fenoksyoctowy


Schemat procesu wyodrębniania penicyliny G


Antybiotyki β-laktamowe wytwarzane
na drodze fermentacyjnej jako źródło
półproduktów do otrzymywania penicylin Półprodukty do otrzymywania penicylin
i cefalosporyn półsyntetycznych i cefalosporyn półsyntetycznych

kwas 6-aminopenicylanowy (6-APA)

kwas 7-aminocefalosporanowy (7-ACA)


Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G


Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA)

Możliwe metody: hydroliza chemiczna lub enzymatyczna

Warunki hydrolizy enzymatycznej

Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V
przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pH
na poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH lub NaOH. Produkty: 6APA oraz
odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez
zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika
organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się,
a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany
jako dodatek do nowej fermentacji

Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę
enzymatyczną

Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych
odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia;
prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola pH, temperatury;
zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych.


Antybiotyki makrolidowe

Biosynteza erytromycyny
Producent: Streptomyces erythreus
Podłoża: kwas propionowy
lub propanol jako prekursor i induktor

Inne – pochodne półsyntetyczne:
klarytromycyna, cykliczny węglan
(Davercin, opracowany w Polsce),
Roksytromycyna, dirytromycyna

Erytromycyna R=H
Klarytromycyna R = CH3


Biosynteza i izolacja erytromycyny

Producent: Streptomyces erythreus

Podłoże produkcyjne: Skład: glukoza i/lub skrobia, mąka sojowa lub kukurydziana,
drożdże, siarczan amonu, NaCl, CaCO3, fosforany (5 – 15 mM),
propanol lub kwas propionowy (dawki po 5 ml/L podłoża w pierwszej
połowie procesu);

Warunki: pH: 7 –7,2, maleje do 6,0, potem rośnie do 8,0; temperatura: 30 – 32 °C
w fazie wzrostu, 28 – 32 °C w fazie produkcji. Proces biosyntezy trwa
120 – 144 h, Ograniczenie represji katabolicznej poprzez dozowanie
glukozy z mniejszą szybkością w idiofazie i obecność skrobi.
Ograniczenie represji azotowej poprzez dodatek zeolitu, dodatek WNK

Wyodrębnianie produktu: produkt jest wydzielany pozakomórkowo; po zakończeniu
biosyntezy zawiesinę pohodowlaną alkalizuje się do pH 7,5 – 8,0
lub zakwasza do pH 5,5, następnie oddzielenie grzybni na filtrze
próżniowym z dodatkiem ziemi okrzemkowej; produkt z przesączu
ekstrakcją octanem butylu lub ketonem metyloizobutylowym
i reekstrakcją wodą o pH 5,5; zatężenie, krystalizacja z roztworu
o pH 9,5, rekrystalizacja z roztworu wodno-acetonowego, suszenie.
Alternatywnie wytrącenie z rozpuszczalnika organicznego w postaci
kompleksu z KNCS.
Ew. oczyszczanie – chromatografia jonowymienna lub adsorpcyjna,


Statyny

Statyny – leki obniżające poziom cholesterolu wprowadzono do lecznictwa w latach 90-
tych XX wieku. Należą do najczęściej stosowanych leków. Przyjmuje je na świecie około
80 milionów ludzi, a wartość ich sprzedaży wynosi około 30 miliardów dolarów.
Powodują one udowodnione korzyści kliniczne, m.in. zmniejszają:
- ryzyko nowych zdarzeń sercowych,
- umieralność z przyczyn sercowo-naczyniowych,
- umieralność całkowitą,
- konieczność wykonywania zabiegów rewaskularyzacji serca oraz częstość hospitalizacji.


F

HO N N

O OH OH O

Atorwastatyna (Lipitor)

Statyny naturalne (szereg górny) i syntetyczne (szereg dolny)


Mikroorganizmy zdolne do biosyntezy statyn

Producenci statyn to grzyby strzępkowe należące do rodzajów:
- Penicillium - Aspergillus
- Monascus

Monascus ruber (lowastatyna)

Aspergillus terreus (lowastatyna)

Penicillium citrinum (mewastatyna)

Produkcja i izolacja lowastatyny
Szczepy produkcyjne
Produkt uboczny biosyntezy u Aspergillus terreus - sulochryna
– mykotoksyna zanieczyszczająca podłoża hodowlane,
utrudniająca odzysk pożądanych metabolitów.
Eliminacja problemu na drodze inżynierii metabolicznej – usunięcie genów odpowiedzialnych za
biosyntezę poliketydową antronowej pochodnej emodyny, prekursora sulochryny.

Warunki hodowli
Biosynteza w procesie okresowym
z zasilaniem: fermentacja wgłębna
w podłożu płynnym lub fermentacja źródło węgla (+) mąka owsiana (podłoże wzrostowe)
powierzchniowa w podłożu stałym (+) laktoza >100 g/l lub 48g/l, fruktoza, glicerol (podłoże
produkcyjne)
(SSF) (-) glukoza (szybkie przyswajanie, wyczerpywanie)

źródło azotu (+) namok kukurydziany, pasta pomidorowa (podłoże
Ważny jest wysoki stosunek C:N. Optymalny wynosi 40 - 50 wzrostowe)
(+) mleko odtłuszczone + ekstrakt drożdżowy (podłoże
hodowlane)
Wydajność procesu: od kilkuset mg/l do kilkunastu g/l (-) NH4+ (zakwaszają podłoże)
pożywki witaminy (+) z grupy B, np. nikotynamid

16,65 mg/g „dry solid” – Biocon (Indie) Aspergillus flavipes mikroelementy żelazo, miedź, wapń, bor, cynk, magnez, molibden,
mangan
16 g/l uzyskuje fińska firma Metkinen OY – mutanty szczepu prekursory L,D-metionina (w różnych czasach hodowli)
natlenienie 20%
A. terreus ATCC20542

o
20 C Brzeczka pofermentacyjna
Kwas mineralny
pH 3,4-3,6

Filtracja

Brzeczka pofermentacyjna Rozpuszczalnik Placek filtracyjny
pH 3,4-3,6 organiczny pH 3,4-3,6
Przepuszczenie gazu oboję tnego Przepuszczenie gazu oboję tnego
Podgrzanie, 50-60 oC Podgrzanie, 50-60 oC

Układ dwufazowy Układ dwufazowy

Separacja faz Separacja faz

Faza organiczna Faza organiczna

Przemycie roztworem zasadowym Przemycie roztworem zasadowym
Przemycie wodą Przemycie wodą

Faza organiczna Faza organiczna

Odparowanie Odparowanie
Krystalizacja Krystalizacja
Filtracja i suszenie próżniowe Filtracja i suszenie próżniowe

Surowa lowastatyna (94%) Surowa lowastatyna (94%)



Surowa lowastatyna (94%) dichlorometan/toluen

o
Mieszanie, 10 min, 8-12 C
Filtracja

Rozpuszczalnik
organiczny Klarowny roztwór Wę giel aktywny

o
Podgrzanie, 30 min, 50-60 C

Klarowny roztwór

Odparowanie
Sch łodzenie
Filtracja i suszenie pró żniowe

Lowastatyna oczyszczona (99%)

Produkt poddawany jest jeszcze rekrystalizacji z izopropanolu lub acetonu

Wyklad 8

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Wyklad 8

Similar to Wyklad 8 (17)

More from marwron

More from marwron (20)

Wyklad 8