1. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków
Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią
ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele
wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów
(antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe
(antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie,
hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym,
immunosupresyjnym i innym.
- wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych;
- połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie
- zastosowanie medyczne – około 150
Potencjalne dalsze możliwości:
- z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000
- z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000
- bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne
2. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Metabolizm wtórny – przemiany peryferyjne
Biosynteza metabolitów wtórnych rozpoczyna się w momencie wyczerpania źródeł
substratu pokarmowego limitującego wzrost drobnoustrojów
3. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
ANTYBIOTYKI
Substancje małocząsteczkowe
wytwarzane przez organizmy żywe
(głównie drobnoustroje) hamujące
wzrost lub zabijające drobnoustroje
6. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
NIETYPOWI PRODUCENCI
Wytwarzane przez cis kalifornijski
(Taxus brevifolia)
Wytwarzane przez żabę afrykańską
(Xenopus laevis)
Wytwarzana przez rekina
(Squalus acanthias)
7. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
CHEMOTERAPIA – leczenie poprzez działanie chemoterapeutyku, czyli
substancji chemicznej selektywnie toksycznej, tzn. takiej, która hamuje wzrost
lub zabija czynniki inwazyjne (baterie, grzyby, komórki nowotworowe, wirusy),
czyniąc jednocześnie jak najmniejsze szkody komórkom organizmu leczonego
ANTYBIOTYKI – substancje chemiczne pochodzenia naturalnego, tzn.
produkowane przez organizmy, które hamują wzrost lub zabijają inne organizmy
SELEKTYWNOŚĆ DZIAŁANIA – oddziaływanie tylko z jednym rodzajem celu
molekularnego w czynniku inwazyjnym
CEL MOLEKULARNY – biomakromolekuła (białko, kwas nukleinowy) lub
struktura supramolekularna (błona biologiczna, ściana komórkowa), z którą
oddziałuje chemoterapeutyk. Wynikiem tego oddziaływania jest efekt toksyczny
wobec czynników inwazyjnych zawierających cel molekularny
8. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Paul Ehrlich
Urodzony w roku 1854 w Strzelinie
(wówczas Strehlen)
Wprowadził pojęcie „magicznej kuli”
Pierwszy nowoczesny chemoterapeutyk
– arsfenamina - stosowany w latach
1910 – 1940 w leczeniu syfilisu, odkryty
został przez pracującego w zespole Ehrlicha
Japończyka Sachahiro Hata
Arsfenamina produkowana była przez
koncern Hoetsch pod nazwą Salvarsan
9. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Penicylina G została odkryta przez Aleksandra Fleminga
1921 – odkrycie lizozymu
1929 – odkrycie penicyliny G
Pomnik Aleksandra Fleminga w Madrycie
10. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Główne klasy antybiotyków
Cefalosporyny
Tetracykliny
Penicyliny
Makrolidy
Aminoglikozydy
12. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Penicylina G – działa tylko na bakterie gramdodatnie, nie wytwarzające β-laktamazy.
Rozpada się w żołądku.
Ampicylina (u góry) i amoksycylina (u dołu)
– działają na bakterie gramujemne.
Penicylina V – jak Penicylina G,
ale trwała w żołądku
15. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
CEL – DNA
16. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Antybiotyki przeciwnowotworowe
Antybiotyki antracyklinowe
Daunorubicyna – producent Streptomyces
peuceticus.
Łączą się DNA, hamując replikację
Komórki nowotworowe rozmnażają się
intensywnie, w sposób niekontrolowany
Spośród „normalnych: komórek organizmu
Intensywnie namnażają się tylko komórki
włosów i szpiku kostnego.
Chemoterapia antybiotykami
przeciwnowotworowymi może prowadzić
do uszkodzenia szpiku
18. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Antybiotyki przeciwgrzybowe
Łączą się z ergosterolem, składnikiem grzybowej
błony cytoplazmatycznej, powodując tworzenie
kanałów
W błonie komórek ludzkich występuje zamiast
ergosterolu cholesterol, z którym antybiotyki
przeciwgrzybowe łączą się nieco mniej chętnie
Efekty uboczne chemoterapii Amfoterycyną B
Wymioty, biegunka, bóle głowy, gorączka,
uszkodzenie nerek i wątroby, neurotoksyczność,
drastyczne obniżenie ilości erytrocytów
19. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Oporność na antybiotyki
•oporność specyficzna – wobec określonego związku
lub grupy podobnych strukturalnie substancji
•oporność wielolekowa (krzyżowa, MDR)
– utrata wrażliwości na działanie
wielu niepodobnych strukturalnie leków
20. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii
OPORNOŚĆ SWOISTA Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Przykład: aktywność enzymu β-laktamazy jest przyczyną oporności swoistej
bakterii na działanie penicyliny G
Kwas klawulanowy – inhibitor
β-laktamazy
Floksacylina – półsyntetyczna penicylina
działająca na bakterie produkujące β-laktamazę
21. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
OPORNOŚĆ WIELOLEKOWA
Do wyrzucania cząstek leku potrzebna jest energia
Rodzaje transporterów wielolekowych
Białka typu ABC Białka typu MFS
Wykorzystują energię hydrolizy ATP Wykorzystują energię
do wyrzucania cząsteczek leku gradientu protonowego
do wyrzucania cząsteczek leku
22. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Drobnoustroje jako źródło nowych substancji czynnych
23. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Poszukiwanie antybiotyków
Wysokowydajne techniki przesiewowe
(high throughput screening)
(próbki ze środowiska, biblioteki związków)
- skrining chemiczny
- skrining biologiczny
- skrining ukierunkowany
Racjonalne projektowanie:
- de novo
- modyfikacje istniejących związków
24. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne
Cechy szczepu wysokowydajnego
maksymalna wydajność pożądanego produktu
minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych
stabilność genetyczna
odporność na zakażenia wirusowe
Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych
nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza
wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów
optymalizacja warunków wzrostu
Przykład wyniku optymalizacji szczepu:
Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G
oryginalny szczep producencki 0.1 mg/ml
szczep zoptymalizowany 30 mg/ml
25. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Mutagenizacja szczepów
mutagen komórki
zabite
(1) (4) (5)
genotyp genotyp (3) genotyp
wyjściowy uszkodzony trwale zmutowany
(2) (6)
1 – mutacje pierwotne populacja
mutantów
2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego
3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne
4 – śmierć komórki
5 – śmierć komórki
6 – namnażanie zmutowanych komórek
Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy
28. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Produkcja penicyliny G lub V
Producent: Penicillum chrysogenum
Szczepy produkcyjne wytwarzają do
70 g z litra hodowli. Wydajność szczepu
wyjściowego – 60 mg z litra
Główny sposób konstrukcji szczepów
wysokowydajnych – powielenie genów
biosyntezy (do 20 kopii)
Prekursor – kwas fenylooctowy
lub fenoksyoctowy
29. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Schemat procesu wyodrębniania penicyliny G
30. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Antybiotyki β-laktamowe wytwarzane
na drodze fermentacyjnej jako źródło
półproduktów do otrzymywania penicylin Półprodukty do otrzymywania penicylin
i cefalosporyn półsyntetycznych i cefalosporyn półsyntetycznych
kwas 6-aminopenicylanowy (6-APA)
kwas 7-aminocefalosporanowy (7-ACA)
31. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G
32. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA)
Możliwe metody: hydroliza chemiczna lub enzymatyczna
Warunki hydrolizy enzymatycznej
Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V
przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pH
na poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH lub NaOH. Produkty: 6APA oraz
odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez
zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika
organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się,
a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany
jako dodatek do nowej fermentacji
Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę
enzymatyczną
Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych
odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia;
prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola pH, temperatury;
zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych.
33. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Antybiotyki makrolidowe
Biosynteza erytromycyny
Producent: Streptomyces erythreus
Podłoża: kwas propionowy
lub propanol jako prekursor i induktor
Inne – pochodne półsyntetyczne:
klarytromycyna, cykliczny węglan
(Davercin, opracowany w Polsce),
Roksytromycyna, dirytromycyna
Erytromycyna R=H
Klarytromycyna R = CH3
34. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Biosynteza i izolacja erytromycyny
Producent: Streptomyces erythreus
Podłoże produkcyjne: Skład: glukoza i/lub skrobia, mąka sojowa lub kukurydziana,
drożdże, siarczan amonu, NaCl, CaCO3, fosforany (5 – 15 mM),
propanol lub kwas propionowy (dawki po 5 ml/L podłoża w pierwszej
połowie procesu);
Warunki: pH: 7 –7,2, maleje do 6,0, potem rośnie do 8,0; temperatura: 30 – 32 °C
w fazie wzrostu, 28 – 32 °C w fazie produkcji. Proces biosyntezy trwa
120 – 144 h, Ograniczenie represji katabolicznej poprzez dozowanie
glukozy z mniejszą szybkością w idiofazie i obecność skrobi.
Ograniczenie represji azotowej poprzez dodatek zeolitu, dodatek WNK
Wyodrębnianie produktu: produkt jest wydzielany pozakomórkowo; po zakończeniu
biosyntezy zawiesinę pohodowlaną alkalizuje się do pH 7,5 – 8,0
lub zakwasza do pH 5,5, następnie oddzielenie grzybni na filtrze
próżniowym z dodatkiem ziemi okrzemkowej; produkt z przesączu
ekstrakcją octanem butylu lub ketonem metyloizobutylowym
i reekstrakcją wodą o pH 5,5; zatężenie, krystalizacja z roztworu
o pH 9,5, rekrystalizacja z roztworu wodno-acetonowego, suszenie.
Alternatywnie wytrącenie z rozpuszczalnika organicznego w postaci
kompleksu z KNCS.
Ew. oczyszczanie – chromatografia jonowymienna lub adsorpcyjna,
35. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Statyny
Statyny – leki obniżające poziom cholesterolu wprowadzono do lecznictwa w latach 90-
tych XX wieku. Należą do najczęściej stosowanych leków. Przyjmuje je na świecie około
80 milionów ludzi, a wartość ich sprzedaży wynosi około 30 miliardów dolarów.
Powodują one udowodnione korzyści kliniczne, m.in. zmniejszają:
- ryzyko nowych zdarzeń sercowych,
- umieralność z przyczyn sercowo-naczyniowych,
- umieralność całkowitą,
- konieczność wykonywania zabiegów rewaskularyzacji serca oraz częstość hospitalizacji.
36. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
F
HO N N
O OH OH O
Atorwastatyna (Lipitor)
Statyny naturalne (szereg górny) i syntetyczne (szereg dolny)
37. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Mikroorganizmy zdolne do biosyntezy statyn
Producenci statyn to grzyby strzępkowe należące do rodzajów:
- Penicillium - Aspergillus
- Monascus
Monascus ruber (lowastatyna)
Aspergillus terreus (lowastatyna)
Penicillium citrinum (mewastatyna)
38. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Produkcja i izolacja lowastatyny
Szczepy produkcyjne
Produkt uboczny biosyntezy u Aspergillus terreus - sulochryna
– mykotoksyna zanieczyszczająca podłoża hodowlane,
utrudniająca odzysk pożądanych metabolitów.
Eliminacja problemu na drodze inżynierii metabolicznej – usunięcie genów odpowiedzialnych za
biosyntezę poliketydową antronowej pochodnej emodyny, prekursora sulochryny.
Warunki hodowli
Biosynteza w procesie okresowym
z zasilaniem: fermentacja wgłębna
w podłożu płynnym lub fermentacja źródło węgla (+) mąka owsiana (podłoże wzrostowe)
powierzchniowa w podłożu stałym (+) laktoza >100 g/l lub 48g/l, fruktoza, glicerol (podłoże
produkcyjne)
(SSF) (-) glukoza (szybkie przyswajanie, wyczerpywanie)
źródło azotu (+) namok kukurydziany, pasta pomidorowa (podłoże
Ważny jest wysoki stosunek C:N. Optymalny wynosi 40 - 50 wzrostowe)
(+) mleko odtłuszczone + ekstrakt drożdżowy (podłoże
hodowlane)
Wydajność procesu: od kilkuset mg/l do kilkunastu g/l (-) NH4+ (zakwaszają podłoże)
pożywki witaminy (+) z grupy B, np. nikotynamid
16,65 mg/g „dry solid” – Biocon (Indie) Aspergillus flavipes mikroelementy żelazo, miedź, wapń, bor, cynk, magnez, molibden,
mangan
16 g/l uzyskuje fińska firma Metkinen OY – mutanty szczepu prekursory L,D-metionina (w różnych czasach hodowli)
natlenienie 20%
A. terreus ATCC20542
39. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Produkcja i izolacja lowastatyny
o
20 C Brzeczka pofermentacyjna
Kwas mineralny
pH 3,4-3,6
Filtracja
Brzeczka pofermentacyjna Rozpuszczalnik Placek filtracyjny
pH 3,4-3,6 organiczny pH 3,4-3,6
Przepuszczenie gazu oboję tnego Przepuszczenie gazu oboję tnego
Podgrzanie, 50-60 oC Podgrzanie, 50-60 oC
Układ dwufazowy Układ dwufazowy
Separacja faz Separacja faz
Faza organiczna Faza organiczna
Przemycie roztworem zasadowym Przemycie roztworem zasadowym
Przemycie wodą Przemycie wodą
Faza organiczna Faza organiczna
Odparowanie Odparowanie
Krystalizacja Krystalizacja
Filtracja i suszenie próżniowe Filtracja i suszenie próżniowe
Surowa lowastatyna (94%) Surowa lowastatyna (94%)
40. Wykład 8 – Biotechnologie otrzymywania antybiotyków i statyn
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Produkcja i izolacja lowastatyny
Surowa lowastatyna (94%) dichlorometan/toluen
o
Mieszanie, 10 min, 8-12 C
Filtracja
Rozpuszczalnik
organiczny Klarowny roztwór Wę giel aktywny
o
Podgrzanie, 30 min, 50-60 C
Klarowny roztwór
Odparowanie
Sch łodzenie
Filtracja i suszenie pró żniowe
Lowastatyna oczyszczona (99%)
Produkt poddawany jest jeszcze rekrystalizacji z izopropanolu lub acetonu