Presented By :  Laleh Mehryar  (871101007) Dear Professor :   Dr. Rezazadeh Department of Food Science, Urmia University S...
Father of the Biosensor  Professor Leland C Clark Jnr   1918–2005
Review
What is a Biosensor? in : Biosensor (www.google.com) International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) defines bio...
INTRODUCTION <ul><li>What Is a Biosensor? </li></ul><ul><li>   Biosensor = bioreceptor + transducer </li></ul><ul><li>The...
Block Diagram of a Biosensor Sample (Analyte or Substrate) Biorecognition Element Transducer Signal Processing Device Olfa...
Block Diagram of a Biosensor <ul><li>Biocatalyst </li></ul><ul><li>Transducer </li></ul><ul><li>Amplifier </li></ul><ul><l...
<ul><li>Specificity </li></ul><ul><li>With biosensors, it is possible to measure specific analytes with great accuracy.  <...
Applications of Biosensor <ul><li>Health Care </li></ul><ul><ul><li>Measurement of Metabolites </li></ul></ul><ul><ul><li>...
1 2 3 4 5 6 7 8 9  analyte BM Signal transducer Affinity reaction How it works ???
The ability to determine the occurrence of food contamination due to foodborne pathogens at every stage of food  productio...
 
 
 
 
 
 
<ul><li>A microbial biosensor consists of a transducer in conjunction with immobilised viable or non-viable microbial cell...
Advantages <ul><li>able to metabolise a wide range of chemical compounds </li></ul><ul><li>have a great capacity to adapt ...
انواع عناصر بیولوژیکی  <ul><li>1.  آنزیم های خالص شده  </li></ul><ul><li>2.  سلولهای کامل  زنده و غیر زنده </li></ul>
آنزیم های خالص شده  <ul><li>آنزیم های خالص شده در ساخت بیوسنسورها بعلت فعالیت و آنالیزهای اختصاصی بالا بطور متداول مورد اس...
سلولهای کامل <ul><li>سلولهای کامل هم در فرم زنده و هم غیرزنده مورد استفاده قرار میگیرند .   سلولهای زنده اهمیت قابل ملاحظه...
محدودیتهای سلولهای کامل <ul><li>1.  مهمترین   محدودیت   استفاده از سلولهای کامل نفوذ سوبسترا و محصولات از دیواره سلولها که...
<ul><li>1.  یکی از روشهای غلبه بر این مشکل استفاده از سلولهای نفوذپذیر است که از روشهای فیزیکی ( انجماد ) ، شیمیایی ( حلال...
<ul><li>2.  روشهایی برای کاهش این واکنشها بررسی شده است .  نفوذپذیری سلول باعث خارج شدن تعدادی از کوفاکتورها با وزن مولکول...
تثبیت مواد بیولوژیکی <ul><li>روشهای شیمیایی  پیوند کووالانسی </li></ul><ul><li>اتصالات عرضی </li></ul><ul><li>روشهای فیزیک...
پیوند کووالانسی <ul><li>پیوند کووالانسی یک تکنیک رایج برای تثبیت آنزیم ها و آنتی بادی ها است که برای تثبیت سلول روش مناسبی...
روشهای فیزیکی <ul><li>روشهای جذب و به دام انداختن وقتیکه از سلولهای زنده استفاده میشوند مفید میباشند . راه معمول نگهداری س...
تله اندازی <ul><li>پلیمرهای سنتزی   </li></ul><ul><li>پلی آکریل آمید - هیدروژلهای بر اساس پلی اورتان و پلی وینیل الکل میبا...
کاربردهای بیوسنسورهای میکروبی در غذا <ul><li>در سالهای اخیر تقاضا برای ابزارهای آنالیتیکی سریع و اختصاصی برای آنالیز غذا و...
کنترل کیفیت شیر <ul><li>کنترل کردن کیفیت شیریک پارامتر مهمی است رانسیداسیون یا  off- flavour   در شیرومحصولات شیری بعلت آز...
تعیین اسیدآمینه ها <ul><li>تعدادی از بیوسنسورهای میکروبی برای تعیین آمینواسیدها از جمله تیروزین ( phenologens   Aeromonas ...
تعیین ویتامینها <ul><li>بیوسنسورهای میکروبی برای تعیین ویتامینها از جمله  B- 12   ( E.coli L15 )  و اسید آسکوربیک ( Entero...
کاربردهای بیوسنسورهای میکروبی در محیط <ul><li>بیشترین کاربرد بیوسنسور میکروبی در زمینه محیطی است .  مزیت سنسورهای  BOD   و...
Biosnsors for detection of: L. monocytogenes
<ul><li>Ye et al. (1997) described a  piezoelectric  biosensor  for detection of  Salmonella typhimurium . The device cons...
 
<ul><li>The antibody against Salmonella was immobilised onto the gold electrode-coated quartz crystal surface through a  p...
<ul><li>Another biosensor technique for  Salmonella  detection developed by  Seo  et al. (1999) was a direct method, in wh...
Magnetoelastic biosensor for the detection of  Salmonella typhimurium  in food products
<ul><li>Existing biosensor technologies such as  surface acoustic wave devices ,  optical  and  thickness-shear mode reson...
Fig.  Schematic drawing illustrating the wireless nature of the magnetoelastic biosensors and the basic principle for dete...
Bacterial binding measurements <ul><li>After the preparation of biosensors, they were exposed to  increasing concentration...
 
<ul><li>When the test  temperature  and  humidity  are constant, the resonant frequency change of the magnetoelastic senso...
Sensor surface bacterial densities of 0.105, 0.075 and 0.105 cells/µm 2  were observed on the samples which were exposed t...
The  Escherichia coli  O157:H7 DNA detection on a gold nanoparticle-enhanced piezoelectric biosensor E. Coli (2)
<ul><li>E. coli  O157:H7 is most well known to both microbiologists and general public. This organism was  first  recogniz...
<ul><li>As to the selectivity,  DNA  is an ideal target for specific detection of pathogenic bacteria. The DNA probe, whic...
Nanoparticles  are a new class of materials, which has been adopted for improving the detection limit and sensitivity of t...
The whole detection course of this QCM DNA sensor mainly included two parts:  sensor fabrication and detection . During th...
 
Detection of  E.coli  in foods <ul><li>One of the many applications of  surface plasmon resonance (SPR) technology  is the...
<ul><li>The following Fig. shows how a change in the chemical environment 100 nm above the thin metal layer results in a  ...
E. coli
  L. monocytogenes <ul><li>L. monocytogenes  causes  listeriosis , and has been detected in a variety of environments, inc...
<ul><li>SPR biosensor technology is one of the most promising detection methods currently in use for rapid pathogenic iden...
<ul><li>As SPR sensors are capable of detecting  changes in a refractive index  of several hundred nanometers over the sen...
<ul><li>In a study that was done in year  2007  by Joung Hyou- Arm et al., they selected  a specific monoclonal antibody  ...
References <ul><li>Maria N. Velasco-Garcia; Toby Mottram (2003).  Biosensor Technology addressing Agricultural Problems.  ...
Any Questions???
The End   Thanks
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Microbial Biosensors

2,618 views

Published on

0 Comments
3 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
2,618
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
4
Actions
Shares
0
Downloads
195
Comments
0
Likes
3
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Microbial Biosensors

  1. 1. Presented By : Laleh Mehryar (871101007) Dear Professor : Dr. Rezazadeh Department of Food Science, Urmia University Seminar 1
  2. 2. Father of the Biosensor Professor Leland C Clark Jnr 1918–2005
  3. 3. Review
  4. 4. What is a Biosensor? in : Biosensor (www.google.com) International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) defines biosensor as a “device that uses specific biochemical reactions mediated by isolated enzymes, immunosystems, tissues, organelles or whole cells to detect chemical compounds usually by electrical, thermal or optical signals”.
  5. 5. INTRODUCTION <ul><li>What Is a Biosensor? </li></ul><ul><li> Biosensor = bioreceptor + transducer </li></ul><ul><li>The bioreceptor is a biomolecule that recognizes the target analyte whereas the transducer converts the recognition event into a measurable signal. </li></ul><ul><li>Enzyme is a Bioreceptor </li></ul>in : Biosensors (www.egtoget.com)
  6. 6. Block Diagram of a Biosensor Sample (Analyte or Substrate) Biorecognition Element Transducer Signal Processing Device Olfactory Membrane Olfactory Nerve Cell Introduction to Biophotonics – Prasad - John Wiley & Sons © 2003 odor Brain
  7. 7. Block Diagram of a Biosensor <ul><li>Biocatalyst </li></ul><ul><li>Transducer </li></ul><ul><li>Amplifier </li></ul><ul><li>Processor </li></ul><ul><li>Monitor </li></ul>
  8. 8. <ul><li>Specificity </li></ul><ul><li>With biosensors, it is possible to measure specific analytes with great accuracy. </li></ul><ul><li>Speed </li></ul><ul><li>analyte tracers or catalytic products can be directly and instantaneously measured </li></ul><ul><li>Simplicity </li></ul><ul><li>receptor and transducer are integrated into one single sensor& the measurement of target analytes without using reagents is possible </li></ul><ul><li>Continuous monitoring capability </li></ul><ul><li>Biosensors regenerate and reuse the immobilized biological recognition element </li></ul>in : Biosensors (www.egtoget.com)
  9. 9. Applications of Biosensor <ul><li>Health Care </li></ul><ul><ul><li>Measurement of Metabolites </li></ul></ul><ul><ul><li>Market Potential </li></ul></ul><ul><ul><li>Diabetes </li></ul></ul><ul><ul><li>Insulin Therapy </li></ul></ul><ul><ul><li>Artificial Pancreas </li></ul></ul><ul><li>Industrial Process Control </li></ul><ul><ul><li>Bioreactor Control </li></ul></ul><ul><li>Military Application </li></ul><ul><li>Environmental Monitoring </li></ul><ul><ul><li>Air and Water Monitoring </li></ul></ul>in : Biosensors (www.egtoget.com)
  10. 10. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 analyte BM Signal transducer Affinity reaction How it works ???
  11. 11. The ability to determine the occurrence of food contamination due to foodborne pathogens at every stage of food production , processing , and distribution is crucial to improving the safety of our food supply. There are more than 250 known food borne diseases caused by bacterial and viral infections in the United States. Annually, these foodborne diseases result in an estimated 76 million illnesses, 325,000 hospitalizations, 5,000 deaths, and 6 billions dollars in unneeded expenditure. Bacterial contamination accounts for 91% of total foodborne diseases. Salmonella sp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli and Bacillus cereus were found to be main source of bacterial contaminations in our food supply.
  12. 18. <ul><li>A microbial biosensor consists of a transducer in conjunction with immobilised viable or non-viable microbial cells. Non-viable cells obtained after permeabilisation or whole cells containing periplasmic enzymes have mostly been used as an economical substitute for enzymes. Viable cells make use of the respiratory and metabolic functions of the cell, the analyte to be monitored being either a substrate or an inhibitor of these processes. Bioluminescence-based microbial biosensors have also been developed using genetically engineered microorganisms constructed by fusing the lux gene with an inducible gene promoter for toxicity and bioavailability testing (7). </li></ul>
  13. 19. Advantages <ul><li>able to metabolise a wide range of chemical compounds </li></ul><ul><li>have a great capacity to adapt to adverse conditions and to develop the ability to degrade new molecules with time. </li></ul><ul><li>are also amenable for genetic modifications through mutation or through recombinant DNA technology and serve as an economical source of intracellular enzymes. </li></ul>
  14. 20. انواع عناصر بیولوژیکی <ul><li>1. آنزیم های خالص شده </li></ul><ul><li>2. سلولهای کامل زنده و غیر زنده </li></ul>
  15. 21. آنزیم های خالص شده <ul><li>آنزیم های خالص شده در ساخت بیوسنسورها بعلت فعالیت و آنالیزهای اختصاصی بالا بطور متداول مورد استفاده قرار میگیرند . که بعلت گرانی و ناپایداری کاربردهای آنها در زمینه بیوسنسورها محدود می شود . بیش از 90% آنزیم های شناخته شده درون سلولی هستند به این ترتیب استفاده از سلول های کامل بعنوان منبع آنزیم های داخل سلولی در فرایندهای صنعتی مختلف بهترین آلترناتیو می باشد که مانع فرایند طولانی و گرانقیمت خالص سازی آنزیم شده آنزیم ها در داخل سلول باقی مانده و با ترکیبات سمی از جمله فلزهای سنگین واکنش نمیدهند (7). </li></ul>
  16. 22. سلولهای کامل <ul><li>سلولهای کامل هم در فرم زنده و هم غیرزنده مورد استفاده قرار میگیرند . سلولهای زنده اهمیت قابل ملاحظه ای در ساخت بیوسنسورها دارند . میکروبهای زنده ترکیبهای ارگانیک مختلفی را متابولیز میکنند . بصورت هوازی یا غیرهوازی منجر به تولید محصولاتی از جمله آمونیاک، دی اکسید کربن، اسیدها و ... میشود که با استفاده از مبدل های مختلف مونیتور میشوند . سلولهای زنده زمانی استفاده میشوند که ظرفیت جذب همه سوبسترا توسط میکروارگانیسم بعنوان شاخص فعالیت متابولیکی تنفسی در نظر گرفته شود . در مواردی از جمله محاسبه نیاز اکسیژن بیولوژیکی . </li></ul>
  17. 23. محدودیتهای سلولهای کامل <ul><li>1. مهمترین محدودیت استفاده از سلولهای کامل نفوذ سوبسترا و محصولات از دیواره سلولها که منجر به طولانی شدن زمان پاسخ در مقایسه با سنسورهای آنزیمی میشود . </li></ul><ul><li>2. یکی دیگر از محدودیتهای سلولهای کامل پائین بودن عملکرد اختصاصی آنها در مقایسه با بیوسنسورهایی است از آنزیم های خالص شده استفاده شده که اساسا به علت واکنشهای کاتالیز شده ناخواسته توسط دیگر آنزیم های موجود در سلول میباشد (7). </li></ul>
  18. 24. <ul><li>1. یکی از روشهای غلبه بر این مشکل استفاده از سلولهای نفوذپذیر است که از روشهای فیزیکی ( انجماد ) ، شیمیایی ( حلالهای ارگانیک ) و آنزیمی ( لیزوزوم یا پاپایین ) استفاده میشود . رایج ترین روش استفاده حلالهای ارگانیک از جمله تولوئن، کلروفرم، اتانول و بوتانول میباشد . این تیمار شیمیایی باعث ایجاد منفذهای کوچکی بوسیله جداسازی لیپیدها از سطح سلول میشود که باعث نفوذ سریع سوبسترا یا محصولات از این منفذهای کوچک غشایی شده و از خروج آنزیم های درون سلولی جلوگیری میشود . هر چند انجام این فرایند باعث مرگ سلول میشود اما بعنوان یک منبع از آنزیم های درون سلولی عمل میکند . برای عملکردهای ساده بیوسنسورها مورد استفاده قرار میگیرند . </li></ul>
  19. 25. <ul><li>2. روشهایی برای کاهش این واکنشها بررسی شده است . نفوذپذیری سلول باعث خارج شدن تعدادی از کوفاکتورها با وزن مولکولی کم شده که این عمل واکنشهای ناخواسته را کاهش میدهد . گرچه یک سلول کامل مخمر شامل بتاگلاکتوزیداز داخل سلولی لاکتوز را به اتانول و co 2 تبدیل میکند در حالیکه همان سلول در شرایط نفوذپذیرلاکتوز را فقط به گلوکز و گالاکتوز بعلت از دست رفتن کوفاکتورها تبدیل میکند . یکی دیگر از روشهای غیرفعال کردن آنزیمها استفاده از روشهای فیزیکی بوده زمانیکه از سلولهای مرده استفاده شود . روش دیگر در کاهش واکنشهای ناخواسته در سلولهای زنده بلوکه کردن راههای متابولیکی ناخواسته یا سیستم انتقال است . </li></ul>
  20. 26. تثبیت مواد بیولوژیکی <ul><li>روشهای شیمیایی پیوند کووالانسی </li></ul><ul><li>اتصالات عرضی </li></ul><ul><li>روشهای فیزیکی جذبی </li></ul><ul><li>تله اندازی </li></ul>
  21. 27. پیوند کووالانسی <ul><li>پیوند کووالانسی یک تکنیک رایج برای تثبیت آنزیم ها و آنتی بادی ها است که برای تثبیت سلول روش مناسبی نیست . یکی از مشکلات اساسی این تکنیک اینست که سلولها در معرض گروههای عامل واکنش دهنده قوی و شرایط سخت واکنش قرار گرفته که باعث آسیب رسیدن به سلولهای زنده شده و همینطور آنزیمهای درون سلولی کاهش پیدا میکند . </li></ul>
  22. 28. روشهای فیزیکی <ul><li>روشهای جذب و به دام انداختن وقتیکه از سلولهای زنده استفاده میشوند مفید میباشند . راه معمول نگهداری سلولها در نزدیکی سطح مبدل استفاده از غشاهایی مثل غشا دیالیز میباشد . در حالت کلی غشا باید از لحاظ شیمیایی و مکانیکی پایدار بوده ضخامت آن 10-15 μm و اندازه منافذ آن μm 0.1-1 باشد . </li></ul>
  23. 29. تله اندازی <ul><li>پلیمرهای سنتزی </li></ul><ul><li>پلی آکریل آمید - هیدروژلهای بر اساس پلی اورتان و پلی وینیل الکل میباشد . یکی از مهمترین محدودیتهای این ترکیبات احتمال آسیب رسیدن به سلولهای زنده است . </li></ul><ul><li>پلیمرهای طبیعی </li></ul><ul><li>مورد استفاده برای به دام انداختن سلولها شامل آلژینات - کاراگینان - آگارز با نقطه ذوب پائین - کیتوزان ... میباشد که این پلیمرها برای تثبیت سلولهای زنده بسیار مفید هستند . </li></ul>
  24. 30. کاربردهای بیوسنسورهای میکروبی در غذا <ul><li>در سالهای اخیر تقاضا برای ابزارهای آنالیتیکی سریع و اختصاصی برای آنالیز غذا و فرمانتاسیون افزایش یافته است . آنالیزها برای نشان دادن پارامترهای مغذی ، افزودنیهای غذایی ، آلودگیها ، شمارش میکروبی و تعیین مدت زمان نگهداری و دیگر خصوصیات بویایی موردنیاز است . </li></ul>
  25. 31. کنترل کیفیت شیر <ul><li>کنترل کردن کیفیت شیریک پارامتر مهمی است رانسیداسیون یا off- flavour در شیرومحصولات شیری بعلت آزاد شدن اسیدهای چرب کوتاه زنجیر ( C 4 - C 12 ) ایجاد میشود . بر خلاف سایر میکروارگانیسم ها آرتروباکتر نیکوتیان دارای آنزیم هایی از نوع بتا اکسیداسیون بوده که نسبت به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر اختصاصی عمل میکند . بنابر گزارش اشمیت و همکاران یک بیوسنسور میکروبی بر اساس تکنولوژی فیلم ضخیم که از آرنروباکتر نیکوتیان تثبیت شده در کلسیم آلژینات بر روی سطح الکترود اکسیژن استفاده شده است . این سنسور در سیستم ناپیوسته برای تعیین میزان اسید چرب آزاد در شیر مورد استفاده قرار گرفته است . در این روش هیچ پیش تیماری برای نمونه ها انجام نگرفته و سنسور نتیجه را در 3 دقیقه نشان میدهد . </li></ul>
  26. 32. تعیین اسیدآمینه ها <ul><li>تعدادی از بیوسنسورهای میکروبی برای تعیین آمینواسیدها از جمله تیروزین ( phenologens Aeromonas ) تریپتوفان ( Ps.fluorescens ) و گلوتامیک اسید ( B.subtilis ) وجود دارد . تعیین فنیل آلانین برای کنترل فرایند تخمیر فنیل آلانین مورد نیاز است که یک بیوسنسور میکروبی بر اساس سلولهای پروتئوس وولگاریس تثبیت شده در کلسیم آلژینات بر روی الکترود اکسیژن به منظور تعیین فنیل آلانین تهیه شده است . فنیل آلانین دآمیناز موجود در سلول فنیل آلانین را به فنیل استیک اسید اکسید میکند . </li></ul>
  27. 33. تعیین ویتامینها <ul><li>بیوسنسورهای میکروبی برای تعیین ویتامینها از جمله B- 12 ( E.coli L15 ) و اسید آسکوربیک ( Enterobacter agylomerans ) توسعه یافته است . برای تشخیص سریع ویتامین B-6 یک سیستم بیوسنسور بر اساس فعالیت تنفسی یک مخمر تثبیت شده ( (Saccharomyces uvarum بر روی الکترود اکسیژن وجود دارد . که تشخیص سریع و ساده ویتامین B-6 در محصولات دریایی در حد ng/ml را امکانپذیر ساخته است . </li></ul>
  28. 34. کاربردهای بیوسنسورهای میکروبی در محیط <ul><li>بیشترین کاربرد بیوسنسور میکروبی در زمینه محیطی است . مزیت سنسورهای BOD واکنش بالای میکروارگانیسمها در تماس با الکترودها بوده که نسبت اکسیژن مصرف شده را اندازه گیری میکنند . سنجش BOD احتیاج به 5 روز دارد که در آنالیزهای انجام شده بر اساس بیوسنسور 15 دقیقه زمان لازم است . یکی از مهمترین معیارها در انتخاب میکروبها اینست که آنها باید بتوانند دامنه وسیعی از سوبستراها رامصرف کنند . بیوسنسورها باید نسبت به عوامل نامساعد محیطی از جمله سمیت و شوری مقاوم باشند . </li></ul>
  29. 35. Biosnsors for detection of: L. monocytogenes
  30. 36. <ul><li>Ye et al. (1997) described a piezoelectric biosensor for detection of Salmonella typhimurium . The device consists of a quartz crystal wafer sandwiched between two metal electrodes. These electrodes provide a means of connecting the device to an external oscillator circuit that drives the quartz crystal at its resonant frequency. A change in mass on the surface of the electrode thus changes the resonant frequency of the quartz crystal microbalance (QCM) device ( Following Fig. )(1). </li></ul>Salmonella
  31. 38. <ul><li>The antibody against Salmonella was immobilised onto the gold electrode-coated quartz crystal surface through a polyethylenimine–glutaraldehyde technique. The Salmonella cells reacted specifically and bound to the crystal surface resulting in an increase in mass that was directly related to the concentration in the solution. </li></ul><ul><li>The biosensor responded to concentrations of S.typhimurium in the range of 5.3*10 5 to 1.2*10 9 CFUml -1 in 25 min (1). </li></ul>Salmonella
  32. 39. <ul><li>Another biosensor technique for Salmonella detection developed by Seo et al. (1999) was a direct method, in which Salmonella binding to specific antibodies attached to a waveguide surface were detected in minutes by measuring interferometrically the alteration in phase velocity of a guided optical wave (1). </li></ul>Salmonella
  33. 40. Magnetoelastic biosensor for the detection of Salmonella typhimurium in food products
  34. 41. <ul><li>Existing biosensor technologies such as surface acoustic wave devices , optical and thickness-shear mode resonators offer sensitivity, but are limited by their need for direct physical contacts . For example quartz crystal microbalance (QCM) needs direct physical contacts (i.e. electrical wiring) to obtain sensor response which prohibit their usage in the sealed containers. Magnetoelastic sensors don’t need direct electrical contacts for the actuation and data acquisition; this makes magnetoelastic sensors suitable for the remote detection of pathogens. The current investigation mainly focuses on the development of a biosensor that addresses these limitations through remote and real-time sensing of pathogens in food products. The Langmuir Blodgett (LB) technique was used for antibody immobilization on the magnetoelastic sensors(2). </li></ul>Salmonella(2)
  35. 42. Fig. Schematic drawing illustrating the wireless nature of the magnetoelastic biosensors and the basic principle for detecting bacterial cells. The fundamental resonant frequency of the biosensor is f 0 without antigen binding, which shifts (decreases) to f analyte due to the increased mass of antigen binding to antibody immobilized on the sensor surface(2). Salmonella
  36. 43. Bacterial binding measurements <ul><li>After the preparation of biosensors, they were exposed to increasing concentrations (5 * 10 1 cfu/ml–5 * 10 8 cfu/ml) of S. typhimurium spiked in different media ( distilled water , fat-free milk and apple juice ) at a flow rate of 100 µl/min. A peristaltic pump (Ismatec Reglo Digital peristaltic pump) was used to control the flow rate of the media containing the pathogens. The resonance frequency of the sensors was measured using an HP network analyzer 8751A with S-parameter test set both before and after the binding of bacterial cells to the immobilized antibody on the sensor. About of 801 points were recorded over the frequency range with an 11.31 s sweep time. A standard open circuit calibration was used to minimize experimental errors in the test set up. A personal computer was used to acquire data at 2 min intervals. Each data point (Fig. 3) represents the mean values obtained from five independent sensors, subjected to study under identical conditions(2). </li></ul>
  37. 45. <ul><li>When the test temperature and humidity are constant, the resonant frequency change of the magnetoelastic sensor depends only on the mass change ( Δ m) on its surface. If the mass increase is small compared to the mass of the sensor the shift in the resonant frequency is given by: </li></ul><ul><li>where f is the initial resonance frequency, M is the initial mass, Δ m is the mass change, and Δ f is the shift in the resonant frequency of the sensor. Equation shows that the resonance frequency shifts linearly, decreasing with increasing mass on the sensor surface . Hence binding of the target organism onto the biosensor surface causes a mass increase with a corresponding decrease in fundamental resonance frequency(2). </li></ul>
  38. 46. Sensor surface bacterial densities of 0.105, 0.075 and 0.105 cells/µm 2 were observed on the samples which were exposed to S. typhimurium suspensions in water, fat-free milk, and apple juice respectively at the highest bacterial concentrations(2).
  39. 47. The Escherichia coli O157:H7 DNA detection on a gold nanoparticle-enhanced piezoelectric biosensor E. Coli (2)
  40. 48. <ul><li>E. coli O157:H7 is most well known to both microbiologists and general public. This organism was first recognized in 1982 , and has the ability to cause life threatening complications hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans(6). Illness due to E. coli O157:H7 infection is often misdiagnosed and generally needs invasive and expensive medical tests before it is correctly diagnosed. Primary sources for exposure to E. coli O157:H7 are consumption of ground beef, sprouts lettuce, salami, unpasteurized milk, and juice contaminated by pathogens. Since the loss caused by E. coli O157:H7 is enormous in terms of medical cost and product recall, it is extremely urgent to develop some rapid and sensitive methods to detect the bacteria in food or water supplies(6). </li></ul>
  41. 49. <ul><li>As to the selectivity, DNA is an ideal target for specific detection of pathogenic bacteria. The DNA probe, which is an oligonucleotide sequence immobilized on a fixed support and able to hybridize the complementary strand present in solution, is a powerful molecular tool for monitoring and detecting specific microorganisms in the environment or in food. It is well known that QCM is a very sensitive mass-measuring sensor, and the crystal resonance frequency decreases with a mass increase on the Au electrode surface. </li></ul>
  42. 50. Nanoparticles are a new class of materials, which has been adopted for improving the detection limit and sensitivity of the DNA biosensors. In order to form a more effective and sensitive system , we adopted the gold nanoparticles in the construction of E. coli O157: H7 DNA biosensor for the goal of signal amplification, because (i) colloidal Au has a good biocompatibility ; (ii) gold nanoparticle has a larger surface area , and helps to immobilize more biofunctional molecules onto the surface of the sensor; (iii) avidin-conjugated Au nanoparticle could be used as “mass enhancer” to amplify the frequency change depending on its relatively large mass compared to DNA target.
  43. 51. The whole detection course of this QCM DNA sensor mainly included two parts: sensor fabrication and detection . During the process of sensor fabrication, how to immobilize more ssDNA probes was pivotal for the following bacteria DNA detection, so two important routes for DNA probes immobilization were introduced to this part, which were: • Self-assembled monolayers (SAMs). • Au-thiol binding . A stepwise decrease of Δ f was observed in each fabrication step(6).
  44. 53. Detection of E.coli in foods <ul><li>One of the many applications of surface plasmon resonance (SPR) technology is the detection of E. coli O157:H7. Surface plasmon resonance is a quantum optical-electrical phenomenon based on the fact that energy carried by photons of light can be transferred to electrons in a metal. The wavelength of light at which coupling occurs is characteristic of the particular metal and the environment of the metal surface illuminated. This transfer can be observed by measuring the amount of light reflected by the metal surface (1, in, 2). </li></ul>E. coli
  45. 54. <ul><li>The following Fig. shows how a change in the chemical environment 100 nm above the thin metal layer results in a shift in the wavelength of light , which is absorbed rather than reflected . The most common practical implementation of SPR is to use a metal-coated optical prism , but other practical implementations have been demonstrated including metal-coated diffraction gratings, optical fibres and planar waveguides. The SPR biosensor has potential for use in rapid, real-time detection and identification of bacteria, and to study the interaction of organisms with different antisera or other molecular species (Fratamico et al., 1998). The lower detection limit of the BIAcore system (a commercial example of an SPR system) is approximately 10 pg of analyte mm -2 . </li></ul>
  46. 55. E. coli
  47. 56. L. monocytogenes <ul><li>L. monocytogenes causes listeriosis , and has been detected in a variety of environments, including foods. Listeriosis occurs around the world, with an annual incidence of approximately 7 cases per million of the normal population. Its incidence tends to be higher in pregnant women, the elderly, and people with weakened or suppressed immune systems. The traditional culture – based technique for the detection of L. monocytogenes requires 5 ~ 10 days for complete identification, and is a fairly labor intensive process. Several alternative detection methods have been developed for the rapid and sensitive detection of L. monocytogenes , including ELISA, PCR, DNA microarray, and biosensor methods(4). </li></ul>
  48. 57. <ul><li>SPR biosensor technology is one of the most promising detection methods currently in use for rapid pathogenic identification. It is sensitive to changes in the thickness or refractive indices of biomaterials at the interface between a thin gold film and an ambient medium , & is thus capable of characterizing biomolecular interactions in real time without the need for labeling. </li></ul>
  49. 58. <ul><li>As SPR sensors are capable of detecting changes in a refractive index of several hundred nanometers over the sensor surface, bacterial cell particles specifically bound to an antibody can induce a large SPR angle shift, as compared with biomolecules covering an identical surface area(4). The direct detection of microbial cells is often difficult, owing principally to their large size . In order to assay whole L.monocytogenes cells with an SPR biosensor, it is first necessary to find a high-affinity antibody [monoclonal anti- L.monocytogenes mouse antibody] for the cell and to optimize the detection surface. </li></ul><ul><li>In this study, a specific monoclonal antibody against L.monocytogenes was screened using an SPR biosensor. Monoclonal antibodies were bound to protein L, after which the L.monocytogenes cells were subjected to an affinity assay. Protein L was immoblized on a carboxymethyl dextran surface via an amine coupling method, and utilized repeatedly by regeneration. The monoclonal antibody, ‘A 18’, was selected and employed for the high sensitivity detection of L.monocytogenes. specific antibodies were screened via direct binding to cells using an SPR biosensor. It was determined that the screened antibody evidenced a high degree of sensitivity for the direct detection of L.monocytogenes. </li></ul>
  50. 59. <ul><li>In a study that was done in year 2007 by Joung Hyou- Arm et al., they selected a specific monoclonal antibody (mouse IgG 1 ) against L. monocytogenes , and also attempted to detect it directly. The direct detection of microbial cells is often difficult, owing to principally large size. In order to assay whole L. monocytogenes cells with a SPR biosensor, it is first necessary to find a high- affinity antibody for the cell & to optimize the detection surface (4) . </li></ul>
  51. 60. References <ul><li>Maria N. Velasco-Garcia; Toby Mottram (2003). Biosensor Technology addressing Agricultural Problems. Biosystems Engineering , 84 (1), 1–12 </li></ul><ul><li>Guntupalli, R . , Lakshmanan, Ramji S., Johnson, Michael L., Hu, J . , Huang, Tung-Shi., Barbaree, James M., Vodyanoy, Vitaly J., Chin, Bryan A. (2007). Magnetoelastic biosensor for the detection of Salmonella typhimurium in food products. Sens. & Instrumen . Food Qual. 1:3–10 DOI 10.1007/s11694-006-9003-8 </li></ul><ul><li>SKLADAL, P., SYMERSKA, Y., POHANKA, M., SAFAR, B., MACELA, A. (2005). ELECTROCHEMICAL IMMUNOSENSOR FOR DETECTION OF FRANCISELLA TULARENSIS. Detection Technologies, Implementation Strategies and Commercial Opportunities, 221–232. </li></ul><ul><li>Joung, H., et al. (2007). Screening of a Specific Monoclonal Antibody against and Detection of Listeria monocytogenes Whole Cells Using a Surface Plasmon Resonance Biosensor. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 12 : 80-85. </li></ul><ul><li>Nayak, M., Kotian, A., Marathe, S., Chakravortty, D. (2009). Detection of microorganisms using biosensors—A smarter way towards detection techniques. Biosensors and Bioelectronics 25, 661–667. </li></ul><ul><li>LiJiang, W., QingShan, W., ChunSheng, W., ZhaoYing, H., Jian, J. & Ping, W. (2008). The Escherichia coli O157:H7 DNA detection on a gold nanoparticle-enhanced piezoelectric biosensor. Chinese Science Bulletin, vol. 53 | no. 8 | 1175-1184. </li></ul><ul><li>D’Souza, S.F.(2001). Microbial biosensors. Biosensors & Bioelectronics 16, 337–353. </li></ul>
  52. 61. Any Questions???
  53. 62. The End Thanks

×