1. ‫سازی‬ ‫بهینه‬PCR1
(‫پلیمراز‬ ‫ای‬ ‫زنجیره‬ ‫واکنش‬PCR‫ابتکاری‬ ‫جدید‬ ‫ابزار‬ ‫)یک‬
‫مشابه‬ ‫برتحقیقات‬ ‫تاثیر‬ ‫یک‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫بیولوژیکی‬ ‫مولکولهای‬ ‫برای‬
(‫و‬ ‫االثر‬ ‫محدود‬ ‫های‬ ‫آنزیم‬ ‫کشف‬ ‫از‬ ‫که‬ ‫ای‬southern blot‫است‬ ‫داشته‬ ).
PCR‫از‬ ‫تنها‬ ‫رشته‬ ‫یک‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫حساس‬ ‫ای‬ ‫بگونه‬DNA‫شده‬ ‫تقویت‬
‫ژنومیک‬ ‫کمپلکس‬ ‫مخلوط‬ ‫از‬ ‫عادی‬ ‫صورت‬ ‫به‬ ‫تنها‬ ‫رشته‬ ‫ژنهای‬ ‫کپی‬ ‫و‬
‫مقدور‬ ‫آگاروز‬ ‫ژل‬ ‫روی‬ ‫باندهای‬ ‫بصورت‬ ‫آن‬ ‫گسترش‬ ‫و‬ ‫شده‬ ‫استخراج‬
.‫است‬ ‫گشته‬
PCR‫به‬ ‫ویا‬ ‫سریع‬ ‫انداختن‬ ‫پرده‬ ‫برای‬ ‫مستقیم‬ ‫بطور‬ ‫تواند‬ ‫می‬
( ‫کردن‬ ‫مرتب‬ ‫ترتیب‬sequencing‫الحاق‬ ‫و‬ ‫دوتایی‬ ‫تقسیم‬ ‫جهت‬ )
‫کلونیهای‬‫.پیشرفتهایی‬ ‫رود‬ ‫کار‬ ‫به‬ ‫باکتریایی‬ ‫فازپالکوزیا‬
‫از‬ ‫استفاده‬ ‫مانند‬DNA‫و‬ ‫گرما‬ ‫به‬ ‫مقاوم‬ ‫مرازهای‬ ‫پلی‬
‫توسط‬ ‫شده‬ ‫ابداع‬ ‫روش‬ ‫که‬ ‫نمودن‬ ‫اتوماتیک‬kary mullis‫باشد‬ ‫می‬
‫بیشمار‬ ‫و‬ ‫گوناگون‬ ‫کاربردهای‬ ‫توسعه‬PCR‫جستجوهای‬ ‫میان‬ ‫از‬ ‫را‬
‫برای‬ ‫نویس‬ ‫پیش‬ ‫یک‬ ‫.بدون‬ ‫است‬ ‫داده‬ ‫پرورش‬ ‫عمومی‬‫موقعیتها‬ ‫همه‬
‫هر‬ ‫عملکرد‬ ‫نتیجا‬ ‫بود‬ ‫خواهد‬ ‫مناسب‬ ‫اعتراض‬ ‫قابل‬ ‫غیر‬PCR‫جدید‬
‫پیش‬ ‫مشکالتی‬ ‫مواردی‬ ‫در‬ ‫نیست‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫نیازمند‬ ‫مشابه‬ ‫طور‬ ‫به‬
‫محصول‬ ‫از‬ ‫کمی‬ ‫بازده‬ ‫یا‬ ‫نیست‬ ‫تشخیص‬ ‫قابل‬ ‫یا‬ ‫محصول‬ ‫که‬ ‫اید‬ ‫می‬
. ‫آید‬ ‫می‬ ‫بدست‬
‫از‬ ‫ناشی‬ )‫(معمولی‬ ‫اختصاصی‬ ‫غیر‬ ‫ای‬ ‫زمینه‬ ‫باندهای‬ ‫حضور‬
‫باشد‬ ‫می‬ ‫پرایمرها‬ ‫غلط‬ ‫کشش‬ ‫یا‬ ‫اشتباه‬ ‫نمودن‬ ‫آسترکاری‬.
‫مورد‬ ‫محصول‬ ‫تقویت‬ ‫برای‬ ‫رقیبی‬ ‫که‬ ‫پرایمرها‬ ‫دایمر‬ ‫تشکیل‬
‫علت‬ ‫به‬ ‫اختصاصی‬ ‫غیر‬ ‫زمینه‬ ‫باندهای‬ ‫.حضور‬ ‫است‬ ‫انتظار‬
(‫غلط‬ ‫آسترکاری‬mispriming( ‫اشتباه‬ ‫گسترش‬ ‫یا‬ )misextention‫شکل‬ ‫آغازگر‬ )
‫تقویت‬ ‫برای‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫دایمر‬ ‫پرایمر‬ ‫گیری‬‫مورد‬ ‫محصول‬ ‫با‬ ‫رقابت‬
(‫اشتباه‬ ‫اتصال‬ ‫با‬ ‫جهش‬ ‫و‬ ‫نظر‬misincorporation‫تجانس‬ ‫عدم‬ ‫دلیل‬ ‫به‬ )
‫از‬ ‫ها‬ ‫فرایند‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫نمودن‬ ‫تسریع‬ ‫بخش‬ ‫این‬ ‫هدف‬ . ‫است‬
‫تهیه‬ ‫درست‬ ‫شامل‬ ‫که‬ ‫هاست‬ ‫پرایمر‬ ‫موارد‬ ‫در‬ ‫نمودن‬ ‫بحث‬ ‫طریق‬
‫ها‬ ‫پیشنهاد‬ ‫این‬ ‫است‬ ‫نظر‬ ‫مورد‬ ‫محصول‬ ‫آوردن‬ ‫بدست‬ ‫و‬ ‫آنها‬ ‫کردن‬
‫آزمایشهای‬‫بوسیله‬ ‫ترکیبی‬ ‫نو‬ ‫از‬ ‫آنها‬ ‫در‬ ‫عمال‬ ‫که‬ ‫ما‬Taq DNA
.‫است‬ ‫آمده‬ ‫بدست‬ ‫ایم‬ ‫کرده‬ ‫استفاده‬ ‫پلیمرازبومی‬
Standard PCR Amplification protocol
‫هدف‬ ‫توالی‬ ‫شوند‬ ‫می‬ ‫تقویت‬ ‫استاندارد‬ ‫بصورت‬ ‫وضعیتها‬ ‫گاه‬ ‫هر‬
‫طراحی‬ ‫برای‬ ‫را‬ ‫شروع‬ ‫شرایط‬ ‫تا‬ ‫کند‬ ‫می‬ ‫پیدا‬ ‫حضور‬ ‫عمده‬ ‫طور‬ ‫به‬
‫نمودن‬PCR‫بزرگی‬ ‫امتیاز‬ ‫تواند‬ ‫می‬ ‫وضعیت‬ ‫این‬ ‫شود‬ ‫مهیا‬ ‫جدید‬
‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫برای‬PCR‫تکرار‬ ‫خصوصا‬ ‫دهد‬ ‫ارائه‬ ‫عملکرد‬ ‫جهت‬
‫ضروری‬ ‫اجرایی‬ ‫هر‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫در‬ ‫که‬ ‫محصوالت‬ ‫آنالیز‬ ‫یا‬ ‫تشخیص‬
.‫است‬
1 optimization ofPCRs

2. 1-: ‫اول‬ ‫مرحله‬lµ111‫لوله‬ ‫یک‬ ‫در‬ )‫(نمونه‬ ‫دهنده‬ ‫واکنش‬
‫میکروفوژ‬ml5‫کنید‬ ‫مخلوط‬ ‫بریزید‬ ./:
DNA‫ای(مولکولهای‬ ‫دورشته‬611‫تا‬511)
20pmol(‫بریزید‬ ‫ها‬ ‫ازپرایمر‬ ‫ازهرکدام‬Tm>55 prefrred)
(NH4)2 SO4 200mM
20 mM‫از‬Mgcl2
750Mm Tris-HCL(PH=8.8 at 25C
‫از‬tween20‫مقدار‬ ‫به‬1015%‫بریزید‬
100µg/Ml‫بدون‬ ‫گاوی‬ ‫آلبومین‬ ‫سرم‬ ‫یا‬ ‫اتوکالوشده‬ ‫ژالتین‬ ‫از‬
‫هسته‬
50µm‫از‬ ‫هرکدام‬ ‫از‬dNTP‫ها‬
2‫واحد‬Taq DNA‫مراز‬ ‫پلی‬
1µg‫از‬DNA‫معادل‬ ‫انسانی‬ ‫کپی‬ ‫تک‬ ‫ژنومیک‬511×3‫مولکول‬
‫هدف‬
10ng‫از‬DNA‫معادل‬ ‫مخمر‬511×3‫هدف‬
1ng‫از‬DNAEcoli‫معادل‬511×3‫هدف‬
1%‫یک‬ ‫از‬M13‫معادل‬ ‫پالکیو‬611‫هدف‬
‫بافر‬ ‫(در‬10X PCR‫بجای‬KCL‫از‬(NH4)2 SO4 200Mm‫نمودیم‬ ‫استفاده‬
‫پرایمرها‬ ‫اتصال‬ ‫برای‬ ‫وسیعتر‬ ‫آنیالینگ‬ ‫دمای‬ ‫محدوده‬ ‫به‬ ‫که‬ ‫چرا‬
).‫میکند‬ ‫عمل‬ ‫تر‬ ‫اختصاصی‬ ،
225 -‫تا‬35‫از‬ ‫سیکل‬PCR‫زیر‬ ‫در‬ ‫ارائه‬ ‫دمای‬ ‫از‬ ‫کنید‬ ‫تهیه‬
: ‫شدن‬ ‫دناتوره‬ ‫برای‬ ‫کنید‬ ‫استفاده‬C66‫مدت‬ ‫به‬15‫(یک‬ ‫ثانیه‬
‫مطل‬ ‫معموال‬ ‫طوالنی‬ ‫شروع‬ ‫زمان‬) ‫است‬ ‫وب‬
: ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫الحاق‬ ‫برای‬C.
55‫مدت‬ ‫به‬ ‫و‬36‫ثانیه‬
: ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫گسترش‬ ‫برای‬72C‫مدت‬105‫دقیقه‬
3-‫در‬ ‫دمایی‬ ‫نهایی‬ ‫گستره‬ ‫یک‬ ‫شامل‬ ‫بایستی‬ ‫سیکل‬ ‫هر‬C22
‫مدت‬ ‫برای‬5‫کرد‬ ‫سرد‬ ‫توسط‬ ‫واکنشگرها‬ ‫باشد‬ ‫دقیقه‬‫دمای‬ ‫تا‬ ‫ن‬C
01‫نمودن‬ ‫اضافه‬ ‫ویا‬M10 m‫از‬EDTA.‫شوند‬ ‫می‬ ‫متوقف‬

3. ‫آنزیم‬ ‫غلظت‬2
‫برای‬ ‫شده‬ ‫پیشنهاد‬ ‫غلظت‬ ‫رنج‬ ‫یک‬Taq DNA‫مراز‬ ‫پلی‬
(‫توسط‬Perkin-Elmer cetus‫بین‬ )1‫و‬2.5( ‫واحد‬SA=20units/Pmol‫هر‬ ‫ازای‬ ‫به‬ )
100µl‫باشد‬ ‫می‬ ‫دهنده‬ ‫واکنش‬.
‫هستند‬ ‫بهینه‬ ‫حالت‬ ‫در‬ ‫پارامترها‬ ‫دیگر‬ ‫که‬ ‫زمانی‬.‫حال‬ ‫هر‬ ‫به‬
‫ذکر‬ ‫(که‬ ‫اخیر‬ ‫مقدار‬ ‫با‬ ‫باشد‬ ‫متغییر‬ ‫است‬ ‫ممکن‬ ‫آنزیم‬ ‫مقدار‬
‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫یا‬ ‫هدف‬ ‫تایی‬ ‫دو‬ ‫های‬ ‫رشته‬ ‫نمودن‬ ‫تقسیم‬ ‫جهت‬ )‫شد‬
‫یک‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫زمان‬PCR.
‫از‬ ‫آن‬ ‫رنج‬ ‫کنید‬ ‫تست‬ ‫را‬ ‫آنزیم‬ ‫غلظت‬ ‫که‬ ‫کنیم‬ ‫می‬ ‫پیشنهاد‬ ‫ما‬
5%‫تا‬5‫در‬ ‫واحد‬100µL‫الکتروفور‬ ‫ژل‬ ‫بوسیله‬ ‫را‬ ‫نتایج‬ ‫و‬ ‫باشد‬‫ز‬
.‫کنید‬ ‫گیری‬ ‫اندازه‬
‫است‬ ‫اختصاصی‬ ‫غیر‬ ‫زمینه‬ ‫باشد‬ ‫زیاد‬ ‫خیلی‬ ‫آنزیم‬ ‫غلظت‬ ‫اگر‬
‫باشد‬ ‫کم‬ ‫خیلی‬ ‫آنزیم‬ ‫غلظت‬ ‫اگر‬ ‫و‬ ‫شود‬ ‫انباشته‬ ‫محصوالت‬ ‫است‬ ‫ممکن‬
‫شود‬ ‫می‬ ‫تولید‬ ‫انتظار‬ ‫مورد‬ ‫محصول‬ ‫از‬ ‫ناکافی‬ ‫مقدار‬.
‫گیری‬ ‫اندازه‬ ‫وضعیتهای‬ ‫و‬ ‫متفاوت‬ ‫سیون‬ ‫فرموال‬ ‫سبب‬ ‫به‬ :‫توجه‬
‫مم‬ ‫گیری‬ ‫اندازه‬ ‫واحد‬ ‫و‬‫است‬ ‫کن‬Taq DNA‫تهیه‬ ‫از‬ ‫مراز‬ ‫پلی‬
‫آید‬ ‫بدست‬ ‫مختلف‬ ‫کنندههای‬.
‫ها‬ ‫نوکلوتید‬ ‫داکسی‬3
‫محلولهای‬DNTP‫و‬ ‫بوده‬ ‫طبیعی‬ ‫بایستی‬ ‫می‬pH‫معادل‬ ‫آنها‬
2(‫باشد‬PH=7.0‫سنجی‬ ‫طیف‬ ‫طریق‬ ‫از‬ ‫بایستی‬ ‫آنها‬ ‫وغلظت‬ )
(spectrophotometry‫تا‬ ‫اولیه‬ ‫غلظتهای‬ ‫شود‬ ‫تعیین‬ )10mM‫رقیق‬ ‫باید‬
‫دمای‬ ‫در‬ ‫و‬ ‫شوند‬ ‫تقسیم‬ ‫قسمت‬ ‫دو‬ ‫به‬ ‫بعد‬ ‫و‬ ‫شوند‬C21-‫نگهداری‬
‫شامل‬ ‫کاری‬ ‫موجود‬ ‫یک‬ ‫شوند‬1mM‫هر‬ ‫از‬DNTP‫شود‬ ‫می‬ ‫پیشنهاد‬
‫پایداری‬DNTPs‫از‬ ‫شده‬ ‫تکرار‬ ‫سیکلهای‬ ‫طی‬ ‫در‬PCR‫که‬ ‫است‬ ‫بقدری‬
‫تقریبا‬51%‫از‬DNTP‫از‬ ‫بعد‬51.‫ماند‬ ‫می‬ ‫باقی‬ ‫دور‬
‫بین‬ ‫غلظتهای‬21‫و‬211Mµ‫در‬ ‫دور‬ ‫هر‬ ‫در‬ ‫نوکلئوتیدها‬ ‫داکسی‬ ‫از‬
‫می‬ ‫نتیجه‬ ‫را‬ ‫درست‬ ‫و‬ ‫مخصوص‬ ‫بازده‬ ‫یک‬ ‫با‬ ‫متعادل‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬
‫چهار‬ .‫دهند‬DNTPs‫تا‬ ‫شوند‬ ‫استفاده‬ ‫برابر‬ ‫غلظتهای‬ ‫با‬ ‫بایستی‬
‫درست‬ ‫هم‬ ‫و‬ ‫بودن‬ ‫اختصاصی‬ ‫هم‬ .‫دهد‬ ‫رخ‬ ‫اتصال‬ ‫در‬ ‫اشتباه‬ ‫کمترین‬
‫شدن‬ ‫انجام‬PCR‫از‬ ‫کمتر‬ ‫غلظتهای‬ ‫از‬ ‫کردن‬ ‫استفاده‬ ‫با‬DNTP
.‫یابد‬ ‫می‬ ‫افزایش‬ ‫شده‬ ‫پیشنهاد‬ ‫معمول‬ ‫بطور‬ ‫که‬ ‫آنچه‬ ‫به‬ ‫نسبت‬
‫پایین‬ ‫غلظتهای‬DNTP‫سایتهای‬ ‫یافتن‬ ‫گسترش‬ ‫اشتباه‬ ‫احتمال‬
‫را‬ ‫کلئوتیدها‬ ‫نو‬ ‫غلط‬ ‫شدن‬ ‫جفت‬ ‫و‬ ‫رسانده‬ ‫حداقل‬ ‫به‬ ‫را‬ ‫هدف‬ ‫غیر‬
.‫دهد‬ ‫می‬ ‫کاهش‬
Enzyme concentration 2
Deoxynucleotide Triphosphates 3

4. ‫غلظتهای‬ ‫کمترین‬ ‫بداند‬ ‫باید‬ ‫کسی‬ ‫هر‬DNTP‫طول‬ ‫برای‬ ‫مناسب‬
‫ها‬ ‫توالی‬ ‫موقعیت‬ ‫و‬‫هدف‬ ‫ی‬Mµ20‫هر‬ ‫از‬DNTP‫میکرولیتر‬ ‫یکصد‬ ‫در‬
(100µl‫برای‬ ‫که‬ ‫تئوری‬ ‫بصورت‬ .‫است‬ ‫واکنشگر‬ )2.6µg‫از‬DNA‫از‬ ‫یا‬
‫توالی‬ ‫یک‬400bp. ‫است‬ ‫کافی‬
‫از‬ ‫یکسان‬ ‫کم‬ ‫غلظتهای‬ ‫از‬ ‫استفاده‬ ‫اخیرا‬DNTP‫کدام‬ ‫هر‬ ‫از‬
2µM(‫باالی‬ ‫حساسیت‬ ‫است‬ ‫قادر‬7
(1/10‫از‬ ‫ویژه‬ ‫اللهای‬ ‫تقویت‬ ‫در‬
‫نق‬ ‫موتاسیونهای‬‫ای‬ ‫طه‬ras‫کند‬ ‫ایجاد‬.
‫منیزیم‬ ‫غلظت‬4
‫غلظت‬( ‫منیزیم‬Mg‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫جهت‬ )PCR‫غلظت‬ ‫است‬ ‫سودمند‬
‫اتصال‬ ‫بگذارد‬ ‫تاثیر‬ ‫زیر‬ ‫موارد‬ ‫تمام‬ ‫در‬ ‫دارد‬ ‫امکان‬ ‫منیزیم‬
‫پرایمرها‬-‫محصول‬ ‫رشته‬ ‫دو‬ ‫هر‬ ‫سازی‬ ‫جدا‬ ‫جهت‬ ‫مناسب‬ ‫دمای‬PCR-
‫محصول‬ ‫ویژگی‬-‫مصنوعی‬ ‫پرایمر‬ ‫دایمر‬ ‫تشکیل‬-‫شکل‬ ‫و‬ ‫آنزیم‬ ‫فعالیت‬
‫آنزیم‬ ‫درست‬.‫آنزیم‬DNA‫تا‬ ‫دارد‬ ‫نیاز‬ ‫آزاد‬ ‫منیزیم‬ ‫به‬ ‫مراز‬ ‫پلی‬
‫به‬ ‫بتواند‬DNA‫و‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫رشته‬ ‫دو‬DNTPs‫از‬ ‫شود‬ ‫باند‬
‫اینرو‬PCRs‫شامل‬ ‫بایستی‬5‫تا‬ ./5/2‫از‬ ‫بیشتر‬ ‫منیزیم‬ ‫برابر‬
‫کل‬ ‫غلظت‬DNTP‫حضور‬ ‫که‬ ‫باشید‬ ‫داشته‬ ‫توجه‬ .‫باشد‬ ‫ها‬EDTA
‫شالت‬‫یا‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫داری‬ ‫نگه‬ ‫برای‬ ‫دیگر‬ ‫های‬ ‫کننده‬DNA‫دو‬
. ‫بزند‬ ‫هم‬ ‫به‬ ‫را‬ ‫منیزیم‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫است‬ ‫ممکن‬ ‫ای‬ ‫رشته‬
‫واکنش‬ ‫ترکیبات‬ ‫دیگر‬5
‫برای‬ ‫شده‬ ‫پیشنهاد‬ ‫بافر‬ ‫یک‬PCR11‫تا‬51µMtris-HCl‫با‬PH
‫بین‬3/8‫تا‬8/8(PH=8.3 or 8.8‫گیری‬ ‫اندازه‬ ‫باشد‬ ‫می‬ )PH‫در‬C
21.‫میشود‬ ‫انجام‬
‫نشده‬ ‫انجام‬ ‫دیگر‬ ‫های‬ ‫بافر‬ ‫از‬ ‫وسیعی‬ ‫مطالعه‬ ‫حال‬ ‫هر‬ ‫به‬
‫در‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫قطبی‬ ‫دو‬ ‫یونی‬ ‫بافر‬ ‫یک‬ ‫تریس‬ .‫است‬
C21‫دارای‬pka‫معادل‬3/8‫ویک‬ ‫است‬pka‫از‬c
⁄121/-‫است‬
‫بنابراین‬PH‫از‬ ‫درست‬20mM( ‫تریس‬PH=8.3‫در‬ )C21‫بین‬
208‫و‬608‫سیکل‬ ‫یک‬ ‫دمایی‬ ‫وضعیت‬ ‫ودر‬ ‫است‬ ‫متغییر‬PCR‫حد‬ ‫تا‬kcl
50mM.‫کند‬ ‫کمک‬ ‫پرایمرها‬ ‫اتصال‬ ‫به‬ ‫است‬ ‫ممکن‬NaCL‫غلظت‬ ‫با‬
50mM‫یا‬kcl‫باالی‬50mM‫آنزیم‬ ‫فعالیت‬Taq DNA‫مهار‬ ‫را‬ ‫مراز‬ ‫پلی‬
‫که‬ ‫زمانی‬ ‫.در‬ ‫کنند‬ ‫می‬PCRs‫از‬ ‫کلنو‬ ‫قطعات‬ ‫با‬DNA‫مراز‬ ‫پلی‬
E.coli‫شود‬ ‫انجام‬10% DMSO.‫است‬ ‫مفید‬
DMSO‫فعالیت‬Taq DNA‫حدود‬ ‫تا‬ ‫میکند‬ ‫مهار‬ ‫را‬ ‫مراز‬ ‫پلی‬51%
‫پیشنهاد‬ ‫همانندسازیها‬ ‫بیشتر‬ ‫برای‬ ‫آن‬ ‫از‬ ‫استفاده‬ ‫بنابراین‬
.‫شود‬ ‫نمی‬
4 magnesium concentration
5 other reaction components

5. ( ‫گاوی‬ ‫آلبومین‬ ‫سرم‬ ‫یا‬ ‫ژالتین‬100µg/ml‫یونی‬ ‫غیر‬ ‫دترژنتهای‬ ‫و‬ )
‫توئین‬ ‫قبیل‬ ‫از‬21(tween20‫یا‬ ))laureth-12‫غلظت‬ ‫با‬101‫تا‬1015
(‫تعدادی‬ ‫چند‬ ‫هر‬ ‫نماید‬ ‫کمک‬ ‫آنزیم‬ ‫پایداری‬ ‫به‬ ‫تا‬ ‫نمایید‬ ‫اضافه‬
.‫هستند‬ ‫پروتئین‬ ‫نمودن‬ ‫اضافه‬ ‫فاقد‬ ‫خوب‬ ‫کاری‬ ‫دستورات‬ ‫از‬
‫پرایمرها‬ ‫شدن‬ ‫جفت‬6
، ‫باز‬ ‫ترکیب‬ ‫به‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫اتصال‬ ‫برای‬ ‫الزم‬ ‫زمان‬ ‫مدت‬ ‫و‬ ‫دما‬
‫یک‬ ‫دارد‬ ‫بستگی‬ ‫پرایمرها‬ ‫قدرت‬ ‫و‬ ‫پرایمر‬ ‫غلظت‬ ،‫پرایمر‬ ‫طول‬
، ‫آنیالینگ‬ ‫برای‬ ‫اجرا‬ ‫قابل‬ ‫دمای‬C5‫از‬ ‫پایینتر‬Tm‫صحیح‬
‫زیرا‬ ،‫پرایمرهاست‬ ‫تقویت‬ ‫جهت‬Taq DNA‫دامنه‬ ‫در‬ ‫مراز‬ ‫پلی‬
‫پرا‬ ‫گسترش‬ .‫دارد‬ ‫فعالیت‬ ‫دما‬ ‫از‬ ‫وسیعی‬‫مرحله‬ ‫شامل‬ ،‫یمرها‬
.‫افتد‬ ‫می‬ ‫اتفاق‬ ‫پایین‬ ‫دماهای‬ ‫در‬ ،‫اتصال‬
‫به‬ ‫دمایی‬ ‫بازه‬ ‫دو‬ ‫بوسیله‬ ‫آنزیم‬ ‫فعالیت‬ ‫تغییرات‬ ‫دامنه‬
‫بین‬ ‫بزرگی‬21‫تا‬85‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫.اتصال‬ ‫شود‬ ‫می‬ ‫تنظیم‬ ‫سلسیوس‬ ‫درجه‬
‫از‬ ‫ای‬ ‫دردامنه‬C55‫تا‬C22‫از‬ ‫را‬ ‫بازده‬ ‫بهترین‬ ‫معموال‬
.‫دهد‬ ‫می‬ ‫بدست‬ ‫محصول‬
‫پر‬ ‫شاخص‬ ‫غلظت‬ ‫در‬( ‫ایمر‬0.2mM‫خواهد‬ ‫الزم‬ ‫وقت‬ ‫ثانیه‬ ‫چند‬ ‫تا‬ )
‫در‬ ‫تفاوت‬ ‫سبب‬ ‫اتصال‬ ‫دمای‬ ‫افزایش‬ ،‫گیرد‬ ‫صورت‬ ‫اتصال‬ ‫تا‬ ‫داشت‬
‫در‬ ‫کلئوئیدها‬ ‫نو‬ ‫غلط‬ ‫گسترش‬ ‫کاهش‬ ‫و‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫غلط‬ ‫اتصال‬
‫انتهای‬′3.‫شود‬ ‫می‬ ‫پرایمر‬
‫سیکلهای‬ ‫شروع‬ ‫طی‬ ‫در‬ ‫مخصوصا‬ ‫محکم‬ ‫اتصال‬ ‫دماهای‬ ‫بنابراین‬
‫ک‬ ‫روش‬ ‫ویژگی‬ ‫افزایش‬ ‫به‬ ،‫متعدد‬‫ایجاد‬ ‫برای‬ .‫کرد‬ ‫خواهد‬ ‫مک‬
‫سیکل‬ ‫شروع‬ ‫در‬ ‫ویژگی‬ ‫ماکزیمم‬Taq DNA‫ازاولین‬ ‫بعد‬ ‫توان‬ ‫می‬ ‫را‬
.‫نمود‬ ‫اضافه‬ ‫پرایمر‬ ‫اتصال‬ ‫فاصله‬ ‫در‬ ‫شدن‬ ‫دناتوره‬ ‫مرحله‬
‫از‬ ‫باالیی‬ ‫غلظت‬ ‫و‬ ‫دما‬ ‫پایین‬ ‫دامنه‬DNTPs‫سبب‬ ‫هم‬ ‫با‬ ‫دو‬ ‫هر‬
‫می‬ ‫ها‬ ‫کلئوتید‬ ‫نو‬ ‫شدن‬ ‫جفت‬ ‫غلط‬ ‫گسترش‬ ‫و‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫غلط‬ ‫گسترش‬
‫به‬ ،‫شود‬‫که‬ ‫اند‬ ‫کرده‬ ‫پشنهاد‬ ‫محققین‬ ‫از‬ ‫تعدادی‬ ‫دلیل‬ ‫همین‬
‫برای‬PCR‫از‬ ‫دمایی‬ ‫و‬ ‫بلندتر‬ ‫های‬ ‫پرایمر‬ ‫از‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫بهتر‬C55
‫تا‬C25‫و‬ ‫توسعه‬ ‫و‬ ‫اتصال‬ ‫برای‬C60‫تا‬C62‫شدن‬ ‫توره‬ ‫دنا‬ ‫برای‬
‫رشته‬ ‫شدن‬ ‫جدا‬ ‫و‬DNA‫شود‬ ‫استفاده‬.
‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫گسترش‬7
‫غلظت‬ ‫و‬ ‫طول‬ ‫به‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫گسترش‬ ‫زمان‬‫دما‬ ‫و‬ ‫هدف‬ ‫توالی‬
‫در‬ ‫معموال‬ ‫سنتی‬ ‫بطور‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫گسترش‬ ‫دارد‬ ‫بستگی‬c22‫می‬ ‫اجرا‬
‫یافتن‬ ‫توسعه‬ ‫برای‬ ‫بهینه‬ ‫دمای‬ ‫به‬ ‫نزدیک‬ ‫دما‬ ‫این‬ ‫زیرا‬ ‫شود‬
‫یک‬ ‫در‬ ‫پرایمرها‬M13-based‫می‬ ‫برآورد‬ .‫میباشد‬ ‫دوتایی‬ ‫مدل‬
‫در‬ ‫کلئوتیدها‬ ‫نو‬ ‫پیوستن‬ ‫هم‬ ‫به‬ ‫سرعت‬ ‫که‬ ‫شود‬C22‫از‬35‫تا‬111‫نو‬
‫د‬ ‫کلئوتید‬‫به‬ ‫بستگی‬ ‫و‬ ‫است‬ ‫متفاوت‬ ‫ثانیه‬ ‫ر‬pH‫نمک‬ ‫غلظت‬ ،‫بافر‬
6 primer annealing
7 Prime Extension

6. ‫طبیعت‬ ‫و‬DNA.‫دارد‬ ‫ای‬ ‫رشته‬ ‫دو‬
‫از‬ ‫زمانی‬ ‫گستره‬ ‫یک‬1‫در‬ ‫دقیقه‬C22‫طول‬ ‫تا‬ ‫محصوالت‬ ‫برای‬Kb2
‫است‬ ‫ممکن‬ ‫بیشتر‬ ‫بازه‬ ‫با‬ ‫دماهای‬ ‫حال‬ ‫هر‬ ‫به‬ .‫رسد‬ ‫می‬ ‫بنظر‬ ‫کافی‬
‫دهنده‬ ‫واکنش‬ ‫غلظت‬ ‫که‬ ‫صورتی‬ ‫در‬ ‫باشد‬ ‫مفید‬ ‫اولیه‬ ‫سیکلهای‬ ‫در‬
‫پایین‬‫غلظت‬ ‫افزایش‬ ‫با‬ ،‫محصول‬ ‫غلظت‬ ‫بعدی‬ ‫درسیکلهای‬ ‫و‬ ‫باشد‬
.‫شود‬ ‫می‬ ‫زیاد‬ ‫آنزیم‬
‫شدن‬ ‫دناتوره‬ ‫دمای‬ ‫و‬ ‫زمان‬8
‫ای)مهمترین‬ ‫دورشته‬ ( ‫هدف‬ ‫رشته‬ ‫دو‬ ‫ناکامل‬ ‫شدن‬ ‫دناتوره‬
‫برای‬ ‫شکست‬ ‫عامل‬PCR‫محصول‬ ‫یا‬PCR‫(انجام‬ ‫اجرایی‬ ‫وضعیت‬ .‫است‬
‫دمای‬ ،‫شدن‬ ‫دناتوره‬ )‫شدنی‬c
C65‫مدت‬ ‫به‬31‫می‬ ‫ثانیه‬‫یا‬ ‫باشد‬
‫دمای‬C97‫مدت‬ ‫به‬15‫است‬ ‫ممکن‬ ‫باالتر‬ ‫دماهای‬ ‫صورت‬ ‫هر‬ ‫در‬ ‫ثانیه‬
‫از‬ ‫غنی‬ ‫هدفهای‬ ‫اختصاصی‬ ‫بصورت‬G+C‫چند‬ ‫تنها‬ .‫نماید‬ ‫جدا‬ ‫را‬
‫جدا‬ ‫رشته‬ ‫که‬ ‫دمایی‬ ‫آن‬ .‫شود‬ ‫دناتوره‬ ‫تا‬ ‫برد‬ ‫می‬ ‫زمان‬ ‫ثانیه‬
( ‫شود‬ ‫می‬Tm، ‫دما‬ ‫در‬ ‫کاهش‬ ‫داردکه‬ ‫وجود‬ ‫امکان‬ ‫این‬ ‫حال‬ ‫هر‬ ‫به‬ )
‫جانبی‬ ‫های‬ ‫واکنش‬‫که‬ ‫است‬ ‫خوبی‬ ‫ایده‬ ‫کند.این‬ ‫ایجاد‬ ‫لوله‬ ‫در‬
(‫جرم‬ ‫با‬ ‫ترموکوپل‬ ‫یک‬ ‫با‬ ،‫واکنش‬ ‫لوله‬ ‫داخل‬ ‫دمای‬mass‫توسط‬ ‫)پایین‬
‫های‬ ‫رشته‬ ‫ناقص‬ ‫شدن‬ ‫دناتوره‬ ‫معموال‬ .‫شود‬ ‫بررسی‬ ‫مانیتور‬DNA
. ‫میکند‬ ‫کم‬ ‫را‬ ‫محصول‬ ‫بازده‬ ‫بنابراین‬ ‫خورد‬ ‫می‬ ‫برگشت‬ ‫سریعا‬
‫ب‬ ‫خیلی‬ ‫شدن‬ ‫دناتوره‬ ‫مراحل‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫واضح‬‫خیلی‬ ‫ویا‬ ‫اال‬
‫می‬ ‫آنزیم‬ ‫فعالیت‬ ‫رفتن‬ ‫بین‬ ‫از‬ ‫به‬ ‫منجر‬ ‫و‬ ‫است‬ ‫ضروری‬ ‫غیر‬ ‫طوالنی‬
‫از‬ ‫بیشتر‬ ‫نسبی‬ ‫بطور‬ ،‫مراز‬ ‫پلی‬ ‫فعالیت‬ ‫عمر‬ ‫نیمه‬ .‫شود‬2‫و‬ ‫ساعت‬
05‫های‬ ‫دما‬ ‫در‬ ‫دقیقه‬92.5 95 ,‫و‬97.5.‫است‬ ‫درجه‬
‫سیکلها‬ ‫تعداد‬9
‫از‬ ‫بهینه‬ ‫تعداد‬ ‫باشند‬ ‫شده‬ ‫بهینه‬ ‫پارامترها‬ ‫دیگر‬ ‫هرگاه‬
‫اولیه‬ ‫غلظت‬ ‫به‬ ‫اساسا‬ ‫سیکلها‬DNA‫یک‬ ‫داشت‬ ‫خواهد‬ ‫وابستگی‬ ‫هدف‬
‫که‬ ‫درصورتی‬ . ‫است‬ ‫سیکلها‬ ‫زیاد‬ ‫خیلی‬ ‫نمودن‬ ‫اجرا‬ ‫رایج‬ ‫اشتباه‬
‫از‬ ‫بیشتر‬ ‫خواهید‬ ‫می‬ ‫شما‬01‫تقویت‬ ‫ژنی‬ ‫رشته‬ ‫یک‬ ‫از‬ ‫کپی‬ ‫سیکل‬
‫در‬ ‫جدی‬ ‫بصورت‬ ‫زیادی‬ ‫اشتباه‬ ‫کنید‬PCR.‫آید‬ ‫می‬ ‫بوجود‬ ‫شما‬
‫از‬ ‫ای‬ ‫زمینه‬ ‫محصوالت‬ ‫بودن‬ ‫اختصاصی‬ ‫غیر‬ ‫در‬ ‫سیکلها‬ ‫از‬ ‫درخیلی‬
‫کم‬ ‫تعداد‬ ‫البته‬ .‫شود‬ ‫می‬ ‫ایجاد‬ ‫افزایش‬ ‫مقدار‬ ‫و‬ ‫پیچیدگی‬ ‫نظر‬
‫راهنما‬ ‫خطوط‬ ‫تعدادی‬ .‫کند‬ ‫می‬ ‫ایجاد‬ ‫کمی‬ ‫محصول‬ ‫بازده‬ ‫سیکلها‬
:‫اند‬ ‫شده‬ ‫تهیه‬ ،‫هدف‬ ‫غلظت‬ ‫مقابل‬ ‫در‬ ‫سیکلها‬ ‫از‬ ‫تعدادی‬ ‫برای‬
‫سیکلها‬ ‫تعداد‬‫هدف‬ ‫مولکولهای‬ ‫تعداد‬
35‫تا‬25511×3
35‫تا‬31
8 Denaturation Time and Temperture
9 cyclenumbers

7. 011×105
01‫تا‬35
311×1
05‫تا‬01
51
‫ها‬ ‫پرایمر‬10
‫بین‬ ‫پرایمر‬ ‫غلظت‬1‫و‬0.5،‫پرایمر‬ ‫باالتر‬ ‫.غلظتهای‬ ‫است‬ ‫مطلوب‬
‫و‬ ‫شود‬ ‫محصوالت‬ ‫ویژه‬ ‫غیر‬ ‫تجمع‬ ‫و‬ ‫غلط‬ ‫شدن‬ ‫پخش‬ ‫سبب‬ ‫است‬ ‫ممکن‬
‫چندتایی‬ ‫مستقل‬ ‫فرعی‬ ‫محصول‬ ‫یک‬ ‫ایجاد‬ ‫از‬ ‫احتمالی‬ ‫افزایش‬ ‫امکان‬
‫دایمر‬ ‫از‬-‫ویژه‬ ‫غیر‬ ‫محصوالت‬ .‫کند‬ ‫ایجاد‬ ‫دوره‬ ‫طول‬ ‫در‬ ‫را‬ ‫پرایمر‬
‫دایمر‬ ‫فرعی‬ ‫غیر‬ ‫و‬–‫برای‬ ‫،خود‬ ‫پرایمر‬PCR‫م‬ ‫،محصول‬‫ورد‬
‫هستند‬ ‫آنزیم‬ ‫برای‬ ‫دلخواه‬DNTPs‫در‬ ‫شوند‬ ‫می‬ ‫رقیب‬ ‫پرایمرها‬ ‫و‬
.‫یابد‬ ‫می‬ ‫کاهش‬ ‫دلخواه‬ ‫محصول‬ ‫نتیجه‬
. ‫موثرند‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫کردن‬ ‫طراحی‬ ‫در‬ ‫ساده‬ ‫ی‬ ‫قاعده‬ ‫چند‬
‫کاربردی‬ ‫های‬ ‫پرایمر‬18‫تا‬28‫شامل‬ ‫و‬ ‫دارند‬ ‫طول‬ ‫نوکلئوتید‬51%
‫تا‬61%‫ترکیب‬G+C. ‫باشند‬ ‫می‬Tm‫ی‬ ‫،برای‬ ‫شده‬ ‫محاسبه‬‫جفت‬ ‫ک‬
‫تواند‬ ‫می‬ ‫فرد‬ ‫هر‬ ‫منظور‬ ‫این‬ ‫باشد.برای‬ ‫متعادل‬ ‫بایستی‬ ‫پرایمر‬
‫از‬ ‫محاسبات‬ ‫از‬2C‫برای‬A‫یا‬T‫و‬C0‫برای‬G‫یا‬C
Thein and walace 1989). ‫نماید‬ ‫استفاده‬ )Tm‫بین‬55c‫و‬80c‫مورد‬
. ‫است‬ ‫دلخواه‬
‫انتهای‬ ‫در‬ ‫شدن‬ ‫مکمل‬ ‫از‬ ‫بایستی‬ ‫اینکه‬ ‫اول‬3‫ها‬ ‫پرایمر‬
‫دایمر‬ ‫فرعی‬ ‫محصول‬ ‫تشکیل‬ ‫شدن‬ ‫مکمل‬ ‫این‬ ‫چونکه‬ ‫شود‬ ‫اجتناب‬-
. ‫دهد‬ ‫می‬ ‫کاهش‬ ‫را‬ ‫دلخواه‬ ‫محصول‬ ‫بازده‬ ‫و‬ ‫میشود‬ ‫سبب‬ ‫را‬ ‫پرایمر‬
‫از‬ ‫بیشتر‬ ( ‫دادن‬ ‫امتداد‬ ‫اینکه‬ ‫ودیگر‬3‫از‬ ) ‫تا‬Cs‫یا‬
Gs‫انتهای‬ ‫در‬′3‫امکا‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫از‬‫اشتباه‬ ‫افزایش‬ ‫سبب‬ ‫دارد‬ ‫ن‬
‫از‬ ‫غنی‬ ‫های‬ ‫توالی‬ ‫شدن‬ ‫پخش‬G+C‫اجتناب‬ ‫این‬ ‫از‬ ‫بایستی‬ ‫و‬ ‫شده‬
‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫که‬ ‫داشت‬ ‫خواهد‬ ‫وجود‬ ‫امکان‬ ‫این‬ ‫هم‬ ‫زمانی‬ . ‫شود‬
‫برای‬ ‫دیگر‬ ‫آشکار‬ ‫دلیل‬ ‫یک‬ .‫باشند‬ ‫پالیندرومی‬ ‫های‬ ‫توالی‬ ‫فاقد‬
‫گانه‬ ‫دو‬ ‫ساختار‬ ‫حضور‬ ،‫کار‬ ‫خوردن‬ ‫شکست‬ ‫و‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫از‬ ‫تعدادی‬
‫در‬DNA. ‫است‬ ‫ای‬ ‫رشته‬ ‫دو‬
‫جانشین‬ ‫مورد‬ ‫این‬ ‫در‬2-‫آز‬ ‫دی‬1-2‫داکسی‬GTP‫برای‬dGTP
‫در‬ ‫پیشنهادی‬ ‫مخصوص‬ ‫های‬ ‫پرایمر‬ ‫طراحی‬ . ‫است‬ ‫بوده‬ ‫مفید‬ ‫خیلی‬
‫است‬ ‫ممکن‬ ‫پرایمر‬ ‫مختص‬ ‫طور‬ ‫به‬ . ‫است‬ ‫شده‬ ‫مطرح‬ ‫دیگر‬ ‫صفحات‬
‫الحاقی‬ ‫بخش‬ ‫شامل‬5‫محدود‬ ‫آنزیم‬ ‫برای‬ ‫اشتباه‬ ‫اتصال‬ ‫سایتهای‬ ‫یا‬
‫باشد‬ ‫کننده‬‫شروع‬ ‫کدون‬ ‫یک‬ATG‫درون‬ ‫در‬ ‫پروموتور‬ ‫توالی‬ ‫یا‬
. ‫هدف‬ ‫توالی‬
10 primers

8. ‫صورت‬ ‫به‬ ‫توانند‬ ‫می‬ ‫اند‬ ‫شده‬ ‫متصل‬ ‫اشتباه‬ ‫که‬ ‫هایی‬ ‫باز‬
‫می‬ ‫ها‬ ‫پرایمر‬ ‫شدن‬ ‫فاسد‬ ‫ها‬ ‫موتاژنز‬ ‫برای‬ . ‫گیرند‬ ‫قرار‬ ‫درونی‬
‫هم‬ ‫به‬ ‫شبیه‬ ‫های‬ ‫باز‬ ‫روی‬ ‫جدید‬ ‫های‬ ‫ژن‬ ‫شدن‬ ‫جدا‬ ‫به‬ ‫منجر‬ ‫تواند‬
. ‫شود‬ ‫آمینه‬ ‫اسید‬ ‫توالی‬ ‫یا‬
‫ازم‬ ‫ای‬ ‫عده‬‫به‬ ‫را‬ ‫پرایمرها‬ ‫در‬ ‫اینوزین‬ ‫از‬ ‫استفاده‬ ‫ولفان‬
‫از‬ ‫زمانیکه‬ ‫اند‬ ‫کرده‬ ‫پیشنهاد‬ ‫شده‬ ‫فاسد‬ ‫پرایمرهای‬ ‫جای‬
)‫(انحطاط‬ ‫شدن‬ ‫دژنره‬ ‫به‬ ‫منجر‬ ‫شود‬ ‫استفاده‬ ‫شده‬ ‫فاسد‬ ‫پرایمرهای‬
‫انتهای‬ ‫در‬3‫غیر‬ ‫صورت‬ ‫به‬ ‫ها‬ ‫باز‬ ‫اشتباه‬ ‫اتصال‬ ‫میشود،زیرا‬
. ‫یابد‬ ‫می‬ ‫افزایش‬ ‫اختصاصی‬
‫فالت‬ ‫اثر‬11
‫نهایی‬ ‫محصول‬ ‫انباشت‬ ‫میزان‬ ‫توصیف‬ ‫برای‬ ‫فالت‬ ‫اثر‬ ‫اصطالح‬ ‫از‬
‫چرخه‬ ‫اواخر‬ ‫در‬ ‫که‬PCR‫تجمع‬ ‫با‬ ‫همزمان‬ ‫بطور‬Pmol0.3‫تا‬1‫از‬
‫واکنش‬ ‫شرایط‬ ‫در‬ ‫شده‬ ‫استفاده‬ ‫است‬ ‫شده‬ ‫گرفته‬ ‫نظر‬ ‫در‬ ‫محصول‬ ‫این‬
‫تاثیر‬ ‫تحت‬ ‫است‬ ‫ممکن‬ ‫زیر‬ ‫موارد‬ ‫از‬ ‫بیشتر‬ ‫یا‬ ‫یکی‬ ‫ای‬ ‫زنجیره‬
‫منظو‬ ‫استفاده‬ ‫مورد‬ ‫(سطح‬ ‫فالت‬(.‫گیرد‬ ‫قرار‬ ) ‫باشد‬ ‫می‬ ‫ژل‬ ‫ر‬1)
( ‫سوبستراها‬ ‫از‬ ‫استفاده‬DNTPs( )‫پرایمرها‬ ‫یا‬2‫)پایداری‬
‫یا‬ ‫(آنزیم‬ ‫واکنشگرها‬DNTPs( )3‫محصول‬ ‫توسط‬ ‫شدن‬ ‫مهار‬ )
‫فسفات‬ ‫(پیرو‬ ‫نهایی‬-DNA( )‫ای‬ ‫رشته‬ ‫دو‬0‫واکنش‬ ‫رقابت‬ )
‫پرایمر‬ ‫اختصاصی‬ ‫غیر‬ ‫محصوالت‬ ‫تولید‬ ‫برای‬ ‫ها‬ ‫دهنده‬-( ‫دایمر‬5)
‫اتصال‬‫باالی‬ ‫غلظتهای‬ ‫در‬ ‫ویژه‬ ‫محصول‬ ‫مجدد‬M8-
10‫ممکن‬ ‫پدیده‬ ‫(این‬
‫توسط‬ ‫شده‬ ‫مریزه‬ ‫پلی‬ ‫فرایند‬ ‫سرعت‬ ‫است‬Taq DNA‫مهاجرت‬ ‫یا‬
( ‫دهد‬ ‫کاهش‬ ‫را‬ ‫گر‬ ‫آغاز‬ ‫جابجایی‬ ‫و‬ ‫محصول‬ ‫رشته‬6‫شدن‬ ‫دناتوره‬ )
‫باشد‬ ‫باال‬ ‫محصول‬ ‫غلظت‬ ‫زمانی‬ ‫محصول‬ ‫از‬ ‫رشته‬ ‫شدن‬ ‫جدا‬ ‫یا‬ ‫ناکامل‬
.
‫درست‬ ‫توجهات‬12
‫ال‬ ‫که‬ ‫وضعیتهایی‬‫شامل‬ ‫دهند‬ ‫می‬ ‫افزایش‬ ‫را‬ ‫اشتباه‬ ‫شدن‬ ‫حاق‬
‫هستند‬ ‫پایین‬ ‫خیلی‬ ‫نوکلئوتیدها‬ ‫داکسی‬ ‫غلظتهای‬ ‫که‬ ‫است‬ ‫زمانی‬
(<1µm‫یک‬ ‫غلظت‬ ‫که‬ ‫زمانی‬ ‫یا‬ )DNTP‫پایین‬ ‫دیگر‬ ‫تای‬ ‫سه‬ ‫به‬ ‫نسبت‬
.‫باشد‬
‫از‬ ‫ای‬ ‫برابرشده‬ ‫غلظتهای‬ ‫کنیم‬ ‫می‬ ‫توصیه‬ ‫ما‬DNTPs‫بکار‬
‫شدن‬ ‫الحاق‬ ‫زیرا‬ ‫شود‬ ‫کم‬ ‫الحاق‬ ‫اشتباه‬ ‫خطاهای‬ ‫تا‬ ‫شود‬ ‫گرفته‬
‫.(چون‬ ‫شود‬ ‫گیری‬ ‫غلط‬ ‫تواند‬ ‫نمی‬ ‫بازها‬Taq‫فعالیت‬ ‫فاقد‬
‫از‬ ‫اگزونوکانازی‬3‫به‬5‫بطور‬ ‫بازها‬ ‫شدن‬ ‫الحاق‬ ‫اشتباه‬ ‫و‬ )‫است‬
‫عمل‬ ‫طی‬ ‫در‬ ‫که‬ ‫شدن‬ ‫جفت‬ ‫کند.خطاهای‬ ‫می‬ ‫پیدا‬ ‫گسترش‬ ‫موثری‬PCR
‫زن‬ ‫انتهای‬ ‫ختم‬ ‫افتد‬ ‫می‬ ‫اتفاق‬‫دهدو‬ ‫می‬ ‫افزایش‬ ‫را‬ ‫جیر‬
‫میشود‬ ‫تقویت‬ ‫معیوب‬ ‫مولکولهای‬ ‫توسط‬ ‫زنجیر‬ ‫ختم‬ ‫محدودیتهای‬
‫جفت‬ ‫یک‬ ‫که‬ ‫زمانی‬ ‫میکند‬ ‫جلوگیری‬ ‫عمل‬ ‫درست‬ ‫شدن‬ ‫انجام‬ ‫از‬ ‫واین‬
‫شود؟‬ ‫می‬ ‫چه‬ ‫بیفتد‬ ‫اتفاق‬ ‫اشتباه‬ ‫شدن‬
11 plateau Effect
12 fidelity considerations

9. petruska‫در‬ ‫وهمکارنش‬1688‫آنزیم‬ ‫یک‬ ‫برای‬ ‫دادند‬ ‫نشان‬
Drosophila DNA polymerase‫ا‬ ‫که‬‫اشتباه‬ ‫شدن‬ ‫طوالنی‬ ‫برابر‬ ‫در‬ ‫ختالف‬
‫به‬ ‫اساسی‬ ‫بستگی‬ ‫زنجیر‬ ‫انتهای‬ ‫شدن‬ ‫الحاق‬Km‫متفاوت‬ ‫های‬
‫اشتباه‬ ‫اتصال‬ ‫یک‬ ‫دارد.اخیرا‬A-T‫گسترش‬ ‫که‬ ‫شده‬ ‫پیدا‬ ‫انتهای‬
‫آن‬211‫یک‬ ‫اتصال‬ ‫از‬ ‫سریعتر‬ ‫برابر‬C-T‫یک‬ ‫و‬T-T‫بوده‬
‫برای‬ ‫همین‬ ‫احتماال‬DNA poly‫باشد‬ ‫درست‬.‫بینی‬ ‫پیش‬ ‫بنابراین‬‫می‬
‫غلظت‬ ‫شود‬DNTPs‫واکنش‬ ‫در‬PCR‫صحت‬ ‫بر‬ ‫توجهی‬ ‫قابل‬ ‫اثر‬ ‫بایستی‬
PCR‫باالی‬ ‫درغلظتهای‬ (‫باشد‬ ‫داشته‬DNTPs()>1mM‫اتصال‬ )
‫باال‬ ‫حرارت‬ ‫درجه‬ ‫درمجموع‬ .‫یابد‬ ‫می‬ ‫گسترش‬ ‫موثرتری‬ ‫بطور‬ ‫اشتباه‬
(>55‫پایین‬ ‫غلظت‬ ‫و‬ ‫گسترش‬ ‫آنیالینگ‬ )dNTP(10‫تا‬µm50‫هر‬ ‫از‬
‫باالیی‬ ‫درجه‬ )‫کدام‬‫نهایی‬ ‫محصول‬ ‫صحت‬ ‫از‬PCR.‫دهد‬ ‫می‬ ‫رابدست‬
‫که‬ ‫است‬ ‫این‬ ‫شود‬ ‫می‬ ‫حاصل‬ ‫ژل‬ ‫سطح‬ ‫از‬ ‫که‬ ‫مهم‬ ‫نتیجه‬ ‫یک‬
‫اشتباه‬ ‫از‬ ‫حاصل‬ ‫ویژه‬ ‫غیر‬ ‫محصوالت‬ ‫پایین‬ ‫غلظت‬ ‫در‬ ‫واکنش‬ ‫درآغاز‬
‫تقویت‬ ‫سبب‬ ‫است‬ ‫ممکن‬ ‫که‬ ‫اتفاقاتی‬ ‫شود‬ ‫می‬ ‫ایجاد‬ ‫بازها‬ ‫شدن‬ ‫جفت‬
‫ت‬ ‫سازی‬ ‫بهینه‬ ‫برای‬ ‫روش‬ ‫بهترین‬ ‫شود‬ ‫ویژه‬ ‫غیر‬ ‫محصوالت‬‫عداد‬
‫سیکلهای‬PCR.‫است‬ ‫زمینه‬ ‫محصوالت‬ ‫تقویت‬ ‫از‬ ‫اجتناب‬