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Procida giusy ctf

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Procida giusy ctf

  1. 1. SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI AMMINOACIDI MODIFICATI CON GRUPPI FOTOATTIVI Relatore: Ch.ma Prof.ssa Simona Concilio Candidata: Giusy Procida Matr. 0730200068 Anno Accademico 2009/2010 UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI SALERNO Tesi sperimentale in Chimica Generale ed Inorganica
  2. 2. Gli azocomposti sono composti che presentano il gruppo funzionale R-N=N-R', in cui R e R' possono essere un arile o un alchile. I derivati più stabili contengono due gruppi arilici. Gli azocomposti alifatici (R e/o R' = alifatico) sono meno comuni dei loro corrispettivi arilici.
  3. 3. AZO COMPOSTI Proteine Enzimi Canali ionici Costruzione di probe Materiali fotoresponsivi Usati per il controllo temporaneo di:
  4. 4. Gli Azobenzeni subiscono una isomerizzazione fotochimica reversibile cis- trans. I due isomeri differiscono in geometria e dipolo. Collocando l’azobenzene in prossimità del sito di legame di un ligando o di un enzima, e modulando lo switch è possibile ad esempio controllare l’attività di una proteina. Mohua Bose, Dan Groff, Jianming Xie, Eric Brustad and Peter G. Schultz.The in corporation of a Photoisomerizable Amino Acid into Protein in E.Coli. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (2)
  5. 5. GLI AZO- AMMINOACIDI Possono essere utilizzati per Azo-Prodrugs Biomateriali Azo-Peptidi Jovita Juodaityte and Norbert Sewald.Synthesis of photoswitchable amino acids based on azobenzene chromophores: building blocks with potential for photoresponsive biomaterials journal of biotechnology volume 112, issues 1-2 26 August 2004, Pages 127-138
  6. 6. Obiettivo della tesi Sintesi di “builnding blocks” potenzialmente utili per la realizzazione di: biomateriali intrinsecamente antimicrobici, con la possibilità di “accendere/spegnere” l’attività.  peptidi antimicrobici.
  7. 7. L’incorporazione del motivo azobenzenico nello scheletro di un polimero consente di avere sistemi “on/off”. Lo switch fotoindotto potrebbe influenzare l’organizzazione strutturale di sistemi polimerici e modificarne l’attività, attivandola e spegnendola. Convenient preparations of azo-dye labeled amino acids and amines. 2008 Jul 7;6(13):2400-4. F. Karush, J. Phy. Chem., 1952, 56, 70
  8. 8. SCELTA DEI SUBSTRATI DI REAZIONE (—) Fenilalanina (Phe, F) (—) Tirosina (Tyr, Y) Uno screening di diverse sequenze di AMP note ha mostrato un’abbondanza relativa di questi residui amminoacidi, che son stati scelti pertanto come strutture di base per la sintesi di diversi azo-monomeri. I residui utilizzati sono Fmoc protetti.
  9. 9. I perché della scelta 1. L’abbondanza dei residui amminoacidici Tyr e Phe ne favorisce una buona sostituzione con i sistemi azo-amminoacidici prodotti. 2. I residui di tirosina e fenilalanina hanno un’elevata tendenza a ripartirsi all’interfaccia della membrana favorendo il meccanismo d’azione tipico del modello barrel-stave degli AMP. 3. Gli aminoacidi aromatici Phe, Tyr possiedono un fenile, al quale è possibile connettere un gruppo diazoarile, per l’ottenimento di un azocomposto arilico sull’amminoacido finale.
  10. 10. La protezione con il gruppo Fmoc è utile per lo step successivo: la sintesi peptidica. C CH3 H3C CH3 O C O Boc Fmoc H2C O C O 1. Il Fmoc offre un’ alternativa ai gruppi rimovibili in ambiente acido. 2. Assorbe fortemente nell’UV, in particolare a 267 nm 290nm e 301 nm. Questo permette in monitoraggio spettrofotometrico sia della reazione di accoppiamento che di deprotezione. 3. La sintesi peptidica offre migliore purezza dei prodotti e rese più soddisfacenti se condotta a partire da amminoacidi Fmoc protetti.
  11. 11. Solo poche strategie sintetiche sono disponibili per la sintesi di derivati azobenzenici: 1. La reazione di diazocopulazione di uno ione arendiazonio con composti aromatici ricchi di elettroni. 2. La condensazione dei nitroso-composti con l’anilina. STRATEGIE SINTETICHE
  12. 12. Azo-amminoacido ottenuti via nitrosobenzene Azo amminoacidi sintetizzati tramite diazocopulazione N N HO H N OHO Fmoc N N OH HO H N OHO Fmoc HO N N HO NH2 O OH O OH HN Fmoc N N 1) AzoTyr-Fmoc 2) CH3AzoTyr-Fmoc 3) NO2 –OH-AzoTyr-Fmoc 5) OH-AzoTyr-Fmoc 6) OH-CH3-AzoTyr 4) AzoPhe-Fmoc A partire da Fmoc-Tyr e Fmoc-Phe sono stati sintetizzati: OH N N HO HN O OH N+ O - O Fmoc
  13. 13. Metodologie sperimentali di caratterizzazione 1) Osservazione al microscopio in luce polarizzata 2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1 H NMR) 3) Spettroscopia UV-VIS 4) Spettroscopia di Fluorescenza 5) Spettroscopia IR Le misure IR sono state effettuate in ATR (riflessione totale attenuata) grazie al “performer plate ZnSe flat”, direttamente su polveri di campione. 6) Calorimetria differenziale a scansione (DSC)
  14. 14. Composto 1: AzoTyr-Fmoc A) Formazione del sale di diazonio 0-5°C B) Formazione dello ione fenato pH=9-10 C) Reazione di Sostituzione Elettrofila Aromatica (diazocopulazione) pH=9-10 T= max 15°C Resa del 70% NH2 HO COOH NHFmoc HCl (aq) NaNO2 (aq) 0-5 °C NaOH (acq) NaHCO3 (acq) N2 + - O COOH NHFmoc + NaOH 15°C HO COOH NHFmoc N N anilina
  15. 15. Il prodotto mostra un aspetto microcristallino. 1) Osservazione al microscopio AzoTyr-Fmoc: caratterizzazione 2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1 H NMR) OH HN O HO N N O O 6.88 7.15 7.62 3.16;2.91 4.85 11.0 8.0 5.0 7.937.46 7.46 7.46 7.93 4.70 4.46 7.55 7.28 7.38 7.84 7.84 7.38 7.28 7.55
  16. 16. Lo stretching del gruppo azo è visibile a 1500 cm-1 . 4) Spettroscopia IR Il composto fonde a 153,3 °C, ma non subisce alcuna cristallizzazione in raffreddamento. 5)Calorimetria differenziale a scansione (DSC) I segnali a λmax = 262 nm, 285 nm e 301 nm sono attribuibili al Fmoc La banda a λmax = 330 nm, è attribuibile all’azocomposto. 3)Spettroscopia UV-VIS Segnali del Fmoc Banda dell’ Azo-composto OH C=O N=N
  17. 17. Composto 2: CH3AzoTyr-Fmoc A) Formazione del sale di diazonio 0-5°C B) Formazione dello ione fenato pH=9-10 C) Reazione di Sostituzione Elettrofila Aromatica (diazocopulazione) pH=9-10 T= max 15°C Resa del 90% NH2 HO COOH NHFmoc HCl (aq) NaNO2 (aq) 0-5 °C NaOH (acq) NaHCO3 (acq) N2 + - O COOH NHFmoc + NaOH 15°C HO COOH NHFmoc N N p-toluidina CH3 CH3 H3C
  18. 18. Il composto ha un aspetto polveroso. 1) Osservazione al microscopio CH3AzoTyr-Fmoc: Caratterizzazione N N HO H N OHO O O 7.26 7.26 7.81 7.81 6.88 7.15 7.62 2.35 5.0 3.16;2.91 4.85 8.0 11.0 4.46 7.55 7.28 7.38 7.84 7.84 7.38 7.28 7.55 4.70 2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1 H NMR)
  19. 19. I segnali a λmax=263,33 nm e a 300 nm sono attribuibili al Fmoc mentre la banda a λmax=345 nm, è attribuibile all’azo composto. Lo stretching del gruppo azo è visibile a 1510 cm-1. 3)Spettroscopia UV-VIS 4) Spettroscopia IR Il picco del punto di fusione è visibile a 190 °C. 5)Calorimetria differenziale a scansione (DSC) Fmoc Azo OH C=O N=N CH3
  20. 20. Composto 3: NO2-OH-AzoTyr- Fmoc A) Formazione del sale di diazonio 0-5°C B) Formazione dello ione fenato pH= 9 C) Reazione di Sostituzione Elettrofila Aromatica (diazocopulazione) pH= 8,5-9 T= max 10-12°C Per aggiunta di acido acetico è interrotta la reazione. pH finale=5.5 Resa del 53% SALE DI DIAZONIO ISOLATO IN FORMA SOLIDA NH2 HO COOH NHFmoc HCl (aq) NaNO2 (aq) 0-5 °C NaOH (aq/EtOH) NaHCO3 (aq/EtOH) N2 + - O COOH NHFmoc + HO COOH NHFmoc N N NO2 NO2 O2N HO OH HO isolato in forma solida 10-15°C
  21. 21. 1) Osservazione al microscopio NO2-OH- AzoTyr-Fmoc: caratterizzazione Al M.O il composto appare cristallino. 2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1 H NMR) HO N N HO HN O OH N+ O - O O O7.86 8.02 7.95 5.0 6.88 7.15 7.62 5.0 3.16;2.91 4.85 8.0 11.0 4.70 4.46 7.55 7.28 7.38 7.84 7.84 7.38 7.28 7.55
  22. 22. Si notano due bande di assorbimento, una incentrata a λmax=396 nm, attribuibile all’assorbimento del sistema azobenzene coniugato, e a λmax = 267, 291 e 300 nm, ritroviamo il Fmoc. 3) Spettroscopia UV-VIS 4) Spettroscopia IR ll gruppo azo è confermato a 1500 cm-1. Il picco del punto di fusione è visibile a 140 °C. Il composto subisce una decomposizione termica, per cui non sono evidenti segnali di cristallizzazione in raffreddamento 5) Calorimetria differenziale a scansione (DSC) Fmoc Azo C=O N=N NO2
  23. 23. Composto 4: AzoPhe-Fmoc Facendo reagire i nitrosoderivati aromatici con le ammine aromatiche primarie in soluzione di acido acetico, si ottengono derivati azobenzenici (reazione di Mills). Il meccanismo di reazione proposto per questa sintesi è diverso dalla diazocopulazione. Resa del 33% Anspon, H.D., "p-Phenylazobenzoic Acid", Org. Synth. . 1955 Vol. 3: p. 711. H2N COOH N H O O Nitrosobenzene N O acido acetico glaciale 8h N HOOC NH O O N
  24. 24. Il composto è stato isolato in due forme cristalline, una ottenibile per precipitazione da CH2Cl2/MeOH (Tf = 167°C) e l’altra per cristallizzazione da THF/acqua (Tf =230°C). 1) Osservazione al microscopio O OH HN O O N N 7.32 7.32 7.88 7.88 3.16;2.91 4.85 11.0 8.0 4.46 7.55 7.28 7.38 7.84 7.84 7.387.28 7.55 4.70 7.93 7.46 7.46 7.46 7.93 2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1 H NMR)
  25. 25. I picchi visibili nello spettro sono facilmente attribuibili tramite i valori di assorbanza al gruppo azo λmax= 330 e al gruppo Fmoc. 4) Spettroscopia IR 3) Spettroscopia UV-VIS Lo stretching del gruppo azo è visibile a 1500 cm-1 Il composto non cristallizza in discesa e il punto di fusione è ben visibile a 231°C. 5) Calorimetria differenziale a scansione (DSC) Fmoc Azo N=N
  26. 26. PROCEDURE SINTETICHE IN VIA DI OTTIMIZZAZIONE Composto 5: OH-AzoTyr-Fmoc Composto 6: OH-CH3 -AzoTyr Il difficile ottenimento di questi ulteriori azo-prodotti, ci ha posti dinanzi alla necessità di procedere con ulteriori studi, al fine di ottimizzare la procedura sintetica considerata e raggiungere l’obiettivo proposto. OH NHFmoc O HO N NHO OH NH2 O HO N NH3C HO
  27. 27. Formazione del Sale di diazonio T = 0-5°C; Evito la formazione di prodotti secondari. pH compreso tra 9 e 10 Facilito l’attivazione dell’amminoacido. SOLUZIONE PROPOSTA Eccesso di nitrito rispetto alle moli della tirosina Sposto l’equilibrio verso la formazione dell’azo composto. BASSE RESE PROCEDURE SINTETICHE IN VIA DI OTTIMIZZAZIONE Temperature di reazione tra 5°C e 10-12°C e pH compreso tra 7,5-8 durante la SEA favoriscono la copulazione.
  28. 28. Conclusioni  Sono state realizzate unità azo-monomeriche, che aprono la strada a numerose possibilità di applicazione.  Sono state utilizzate procedure sintetiche semplici ed economiche per sviluppare nuove molecole utilizzabili come “building blocks” per l’ottenimento di nuovi materiali.
  29. 29.  La progettazione di unità azo-amminoacidiche può risultare di notevole interesse, sia per sfruttare la fotoattività dei suddetti sistemi in materiali polimerici, sia per la realizzazione di nuovi peptidi antimicrobici. Nonostante gli studi siano da ampliare, le possibilità offerte dal presente lavoro aprono la strada a numerose prospettive future.
  30. 30. Grazie a tutti per l’attenzione! Un grazie alla mia prof. Simona, a Stefano e ai ragazzi del laboratorio con cui ho condiviso tanto in questo tempo.
  31. 31. Potenziali Applicazioni degli azo- polimeri antimicrobici  Materiali per uso biomedico (in odontoiatria, nei fili di sutura, come patch o sistemi mucoadesivi etc..);  Superfici antimicrobiche per prevenire infezioni batteriche;  Food packaging
  32. 32. Veicolazione di farmaci Vescicole lipidiche azo-modificate
  33. 33. Controllo temporaneo di enzimi Molecular scissors under light control
  34. 34. Costruzione di Probe New Product - Azobenzene phosphoramidite for the introduction of photo-regulated functions in DNA Investigare sui meccanismi di formazione e dissociazione dell’elica.
  35. 35. Idrogel a rilascio modificato
  36. 36. Reazione1 Reazione 2 Reazione 3 Reazione 4 Reazione 5 H2 0 14,3 mL 5,2 mL 9,6 mL 20 mL 9,6 mL HCl 3,7 mL (0.045 moli) 1.3mL (0.016 moli) 2,4 mL (0,029 moli) 5 mL (0,06 moli) 2,4 mL (0,029 moli) p-amminofenolo 1.20g (0.011 moli) 0,54 g (0.0049) 1,20 g (0.011 moli) 1,20 g (0.011 moli) 1,20 g (0.011 moli) Nitrito di sodio Sciolto in mL 2.4 di H2 O 0.84g (0,012 moli) 0.37g(0,0054 moli) 0,84 g (0,012 moli) 0,84 g (0,012 moli) 0,84 g (0,012 moli) SOLUZIONE BASICA per formare lo ione fenato NaOH 0.09 g Na2 CO3 in EtOH NaOH 0.09 g NaOH 0.09 g NaOH 0.022 g NaHCO3 0.34 g NaHCO3 in EtOH NaHCO3 0.034 g NaHCO3 0.034 g NaHCO3 0.085 g Fmoc-Tyr 2 g (0.0049 moli) 2 g (0,0049moli) 1g (0,0025 moli) 1g (0,0025 moli) 1g (0,0025 moli) TEMPERATURA di reazione per la S.E.A 10- 15 °C T ambiente 0-5 °C 10-12 °C 5°C pH durante la S.E.A. 9-10 9-10 7,5– 8 7,5- 8 7,5 -8 RISULTATO Il prodotto non si è formato Il prodotto non si è formato Il Prodotto non si è formato Bassa resa Bassa resa DIVERSE CONDIZIONI DI REAZIONE USATE PER L’OH-AzoTyrFmoc
  37. 37. L’analisi al M.O mostra un composto che fonde intorno ai 230°C. 1) Osservazione al microscopio OH-AzoTyr-Fmoc caratterizzazione N N OH HO H N OHO O O 6.93 6.93 7.76 7.76 6.88 7.15 7.62 5.0 5.0 3.16;2.91 4.85 8.0 11.0 4.46 7.55 7.28 7.38 7.84 7.84 7.38 7.28 7.55 4.70 2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1 H NMR)

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