1. يتم فصل بروتينات العينة باستخدام الفصل الكهربائي . فصل
البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربة
Isoelectric point (pI) ، ، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية
أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة
.معالجة العينة وطبيعة الهلام
إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف
هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي
على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl
Sulfate (SDS).
أي ) الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم
متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة
مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل
إختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. )مثل تحويل
الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH و SH) و بذلك يسمح لفصل
البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة
بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب
الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام.
البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل
البروتينات حسب الحجم )عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD ،
kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد
تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية
.العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات

2. الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة
الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue
يتم تحميل العينات في آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ
درج أو العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات
معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تظُهر حزم
ملونة مرئية. أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية
الكامل المدى لشركة GE ( كما في الشكل(. عندما يتم تطبيق فرق
الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه
المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم )حركات الفصل الكهربائي
.المختلفة( تفُصل إلى حُزم ضم كل سطر
من الممكن أيضاً استخدام الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل
البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب
النقطة متوازنة الكهربة )تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون
فيه الشحنة متعادلة( في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في
.البعد الثاني
النقل

3. من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للأكتشاف بالأجسام
المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز
أو الـ PVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة
من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في
محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية
Capillary action .، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء
ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية
.وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء
البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من
النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات
عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات
على سطح رقيق للإكتشاف )أنظر أسفلاً(. كلا نوعي الغشاء
نيتروسيليلوز أو ( PVDF) يتم إختيارهم لخاصية الإلتصاق غير
المحدد بالبروتيات )أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة
متساوية(. إلتصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا
الماء hydrophobic interactions) ، بالإضافة إلى
التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية
النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF ، ولكنهم هشة أكثر
ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes [كثيرة.] 3
التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن
التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو
بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية

4. من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء
[تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.] 4