Nghiên Cứu Qui Trình Phân Lập Genistein Từ Hạt Đậu Nành_08315312092019

1. i
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
**********
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12 năm 2009
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP GENISTEIN TỪ
HẠT ĐẬU NÀNH
Giáo viên hướng dẫn:
ThS. Phùng Văn Trung

2. iii
TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện tại phòng Các Hợp Chất Thiên Nhiên-Viện Công Nghệ
Hóa Học-Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam tại Thành Phố Hồ Chí Minh.
Đề tài có tên: “ Nghiên Cứu Qui Trình Phân Lập Genistein từ Hạt Đậu
Nành”.
Đề tài được tiến hành từ tháng 9 đến tháng 12 năm 2009. Để phân lập được
hợp chất genistein từ hạt đậu nành, trước tiên cần chọn dung môi thích hợp sau đó
đậu nành được tiến hành ngâm trong dung môi. Sau 24 giờ thu dịch chiết và đem
cô quay để được dạng Cao. Cao chiết này đem chạy sắc ký cột đồng thời kiểm tra
song song với sắc ký lớp mỏng nhằm thu được hợp chất cần phân tách. Sau khi
phân tách được hợp chất tiếp tục tinh chế lại nhiều lần để được hợp chất sạch tinh
khiết. Chất sạch sẽ được gửi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhằm xác định cấu
trúc của chất sạch.
Sau 4 tháng làm đề tài kết quả đạt được: phân lập được 172mg GDN-3 từ hạt
đậu nành, xác định được cấu trúc GDN-3 là genistein, định tính được các nhóm
hợp chất có trong đậu nành (alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, đường khử…),
thử hoạt tính kháng oxy hóa của genistein.

3. iv
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v
DANH SÁCH CÁC BẢNG vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH viii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix
Chương 1:MỞ ĐẦU 1
Chương 2: TỔNG QUAN 3
2.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC 3
2.1.1. Tên 3
2.1.2. Mô tả thực vật cây đậu nành 3
2.1.3. Phân bố-sinh thái-cách trồng trọt 6
2.2. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 7
2.2.1. Y học dân gian Việt Nam 7
2.2.2. Y học và hóa sinh hiện đại 7
2.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 11
2.3.1. Protein. 11
2.3.2. Lipid. 11
2.3.3. Glucid. 11
2.3.4. Chất khoáng. 12
2.3.5. Vitamin. 12
2.3.6. Isoflavone và các glycoside của nó 12
2.3.7. Saponine. 14
2.3.8. Phytosterol. 15

4. v
2.3.9. Chất ức chế protease. 16
2.3.10. Phytate. 16
2.4. GENISTEIN 17
Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. NGUYÊN LIỆU 20
3.1.1. Hạt đậu nành: 20
3.1.2. Dụng cụ - hóa chất: 20
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.2.1. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt đậu nành. 21
3.2.2. Các phương pháp chiết xuất 29
3.2.3. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất 30
3.2.4. Xác định cấu trúc hóa học 32
3.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 32
Chương 4: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 36
4.1. KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HẠT ĐẬU
NÀNH 36
4.1.1. Phương pháp tiến hành 36
4.1.2. Kết quả 37
4.1.3. Nhận xét 39
4.2. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT 40
4.2.1. Chiết xuất 40
4.2.2. Phân lập và tinh chế các chất từ cao EtOAc 40
4.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA GDN-3 44
4.4. QUY TRÌNH PHÂN LẬP GENISTEIN TỪ HẠT ĐẬU NÀNH 49
4.5. THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 50
Chương 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 53
5.1. KẾT LUẬN. 53
5.2. KIẾN NGHỊ. 53
Tài liệu tham khảo 54

5. vi
DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
CHCl3: Chloroform
13
C-NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance
d: Doublet (NMR)
dd: Doublet of doublet (NMR)
DEPT: Detortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO: Dimethyl sulfoxide
DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EC50: 50% Efficient Concentration Value
IC50: 50% Inhibitory Capacity Value
EtOAc: Ethyl acetate
EtOH: Ethanol
1
H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation
IR: Infrared
J: Coupling constant
m: Multiplet (NMR)
MeOH: Methanol
MS: Mass Spectrometry
NMR: Nuclear Magnetic Resonance
EP: Ether petrole

6. vii
ppm: Parts per million
Rf: Retention factor
s: Singlet (NMR)
TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
UV: Ultraviolet (Tia tử ngoại, tia cực tím)
δ: Chemical shift
HDL: Hight Density Lipid
LDL: Low Density Lipid
ATP: Adenosine Triphosphate

7. viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG Trang
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các chất có trong hạt
đậu nành 37
Bảng 4.2: Kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn thu được sau khi khai triển
sắc ký cột cao EtOAc 42
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 13
C-NMR và DEPT CỦA GDN-3 45
Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 13
C-NMR, 1
H-NMR và HMBC của GDN-3 46
Bảng 4.5: Bảng so sánh dữ liệu phổ của GDN-3 và của genistein được công bố 47
Bảng 4.6: Cách pha các mẫu 51
Bảng 4.7: Độ hấp thu của mẫu thử và mẫu chuẩn ở 517nm 52

8. ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH Trang
Hình 2.1: Cây đậu nành và bộ rễ 4
Hình 2.2: Hoa đậu nành 4
Hình 2.3: Lá đậu nành 5
Hình 2.4: Quả đậu nành tươi 5
Hình 2.5: Quả và hạt đậu nành khô 5
Hình 2.6: Cấu trúc của các isoflavone có trong đậu nành 12
Hình 2.7: Cấu trúc các glycoside của isoflavone 13
Hình 2.8: Cấu trúc hóa học các soyasaponin 14
Hình 2.9: Cấu trúc hóa học các cholesterol và các phytosterol 15
Hình 2.10: Cấu trúc acid phytic 16
Hình 2.11: Genistein 17
Hình 2.12: Sản phẩm Genistein và một số hợp chất Isoflavones 19
Hình 3.1: Hạt đậu nành 20
Hình 4.1: Kết quả định tính các hợp chất có trong hạt đậu nành 39
Hình 4.2: Sắc ký cột thường cao EtOAc 41
Hình 4.3: Sắc ký lớp mỏng cao EtOAc, hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) 41
Hình 4.4: Dạng tinh thể của GDN-3 43
Hình 4.5: TLC của GDN-3 ở hệ CHCl3-MeOH (9:1) 43
Hình 4.6: Dạng bột của GDN-3 43

9. x
DANH MỤC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ Trang
Sơ đồ 4.1: Chuẩn bị các dịch chiết định tính 36
Sơ đồ 4.2: Qui trình phân lập cao EtOAc 40
Sơ đồ 4.3: Phân lập các chất từ cao EtOAc 43
Sơ đồ 4.4: Qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành

10. 1
Chương 1: MỞ ĐẦU
Ngày nay phụ nữ không những đóng vai trò quan trọng trong gia đình mà còn
đảm nhiệm công việc ngoài xã hội. Vì vậy tốc độ lão hóa của cơ thể sẽ trở nên
nhanh hơn. Một trong những nguyên nhân quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lão
hóa của phụ nữ là sự thiếu hụt hormon estrogen (nội tiết tố nữ).
Như đã biết, các hormon của nữ giới gồm hai nhóm chính:
- Các estrogen mà chủ yếu là estradiol có tác dụng tạo nên vẻ đẹp quyến rũ của
nữ giới, tạo vóc dáng, làn da mịn màng và là tác nhân quyết định cho các chu kỳ
kinh nguyệt, tạo trứng chín và rụng để chuẩn bị cho sự thụ thai nếu trứng gặp tinh
trùng.
- Các progestrogen mà đại diện là progesteron có chức phận bảo vệ thai nhi
phát triển và đảm bảo sự tiết sữa cho con bú ở các bà mẹ nuôi con.
Các hormon này được hình thành trong cơ thể ở tuổi dậy thì và đạt hàm lượng
cao nhất ở tuổi 25. Sau đó hàm lượng của chúng giảm dần, nhất là ở thời kỳ mãn
kinh hoặc sau khi sinh. Điều này gây ra nhiều triệu chứng bất lợi cho nữ giới như:
chứng đỏ mặc, huyết áp lên xuống thất thường gây ra khó chịu, tính khí thất thường,
bị nhiều stress, da khô, có nhiều vết nhăn, loãng xương, dòn dễ gãy, vỡ…, cơ thể
nhanh lão hóa.
Để khắc phục tình trạng trên, y học hiện đại đã và đang sử dụng “ liệu pháp
thay thế hormon” (Hormone replacement Therapy; HRT) tức sử dụng hormon có
nguồn gốc tổng hợp. Tuy nhiên lại gây ra một số nguy cơ lớn như ung thư vú, ung
thư màng trong tử cung, buồng trứng, huyết khối tĩnh mạch và đột qụy do thiếu máu
cục bộ, tăng nguy cơ tim mạch.

11. 2
Các hợp chất thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng và được cho an toàn khi
sử dụng. Do đó con người ngày càng quay về với thiên nhiên nơi bắt đầu của mọi sự
sống.
Đậu nành có chứa các chất có hoạt tính tương tự hormon estrogen và an toàn
hơn nhiều. Đó là các isoflavone, còn gọi là “ estrogen thực vật” (phytoestrogen).
Hoạt chất thuộc nhóm isoflavone chủ yếu có trong đậu nành là genistein.
Nhằm phân lập một hợp chất quan trọng và có giá trị này, đề tài luận văn với
tên “Nghiên cứu qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành”.
Mục tiêu của đề tài gồm:
1. Phân lập Genistein từ hạt đậu nành.
2. Phân tích định các nhóm hợp chất từ hạt đậu nành.
3. Chứng minh cấu trúc.
4. Thử hoạt tính kháng oxi hóa của Genistein bằng phương pháp DPPH.

12. 3
Chương 2: TỔNG QUAN
2.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC [1, 11, 20, 23]
2.1.1. Tên
Tên khoa học: Glycine max (L.) Merr.
Tên khác: đậu nành, đậu tương, hoàng đậu miêu.
Tên nước ngoài: soja (Pháp), soya (Anh, Tây Ban Nha), soia (Ý),….
Họ: Fabaceae (họ đậu).
2.1.2. Mô tả thực vật cây đậu nành
Cây thân thảo đứng, sống hàng năm, cao 40-80 cm. Thân cành mảnh, có lông
màu trắng. Lá kép mọc so le, gồm 3 lá chét hình bầu dục hoặc trái xoan, gốc tròn,
đầu nhọn, dài 3-12 cm, rộng 2-8 cm, lá chét bên lệch, hai mặt có lông rải rác. Lá
rụng trước khi quả chín.
Cụm hoa mọc thành chùm ngắn ở kẽ lá, hoa nhỏ màu tím hoặc màu trắng,
đài hình chuông, phủ lông mềm, tràng có cánh cờ rộng, không có tai, nhị một bó,
bầu có lông. Tràng hoa gồm 5 cánh hoa (cánh cờ to nhất ở phía sau, phủ lên hai
cánh bên, hai cánh này lại phủ lên hai cánh trước. Hai cánh trước dính nhau thành
lòng máng). Bầu một lá noãn. Bộ nhị gồm 10 nhị, trong đó 9 nhị dính, nhị thứ mười
rời, ở phía sau. Hoa lưỡng tính, tự giao. Có hiện tượng thụ phấn chéo.
Có 3-8 quả trên một chùm. Qủa đậu có rất nhiều lông mềm, mọc thõng
xuống, dài khoảng 3-4 cm, hơi thắt lại giữa các hạt, hạt 2-5 cm, màu trắng vàng, tùy
loài.

13. 4
Cây đậu nành có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác.
Điều này có được là nhờ hoạt động cố định N2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng
sinh trên rễ cây họ đậu.
Hình 2.1: Cây đậu nành và bộ rễ
Hình 2.2: Hoa đậu nành

14. 5
Hình 2.3: Lá đậu nành
Hình 2.4: Quả đậu nành tươi Hình 2.5: Quả và hạt đậu nành khô

15. 6
2.1.3. Phân bố- sinh thái- cách trồng trọt
Đậu nành là giống cây trồng cổ điển. Cây đậu nành được biết có nguồn gốc
xa xưa từ Trung Quốc và được coi là cây thực phẩm cho đời sống con người từ hơn
4000 năm trước, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ 8, vào
nhiều thế kỷ sau có mặt ở các nước Châu Á như Thái Lan, Malaisia, Korea và Việt
Nam. Cây đậu nành có mặt ở Châu Âu vào đầu thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ là thế kỷ 18.
Hàng năm trên Thế Giới có khoảng 52,6 triệu hecta trồng đậu nành, với tổng sản
lượng 96 triệu tấn. Hoa Kỳ là nước đứng đầu Thế Giới (48% tổng diện tích với 56%
tổng sản lượng), Braxin (10 triệu ha, 16 triệu tấn), Trung Quốc (7,5 triệu ha, 10
triệu tấn)… Diện tích và sản lượng đậu nành của Việt Nam còn ở mức rất khiêm tốn
(14,900 ha; 12,000 tấn), song bước đầu đã có sản phẩm tham gia vào thị Thế Giới.
Cây đậu nành thích hợp với điều kiện khí hậu từ nhiệt đới, cận nhiệt đới đến
cả các vùng có khí hậu tương đối lạnh. Tất cả các loại đất có pH 6-7 đều có thể
trồng đậu nành. Giống như các cây họ đậu khác, đậu nành gieo trồng bằng hạt. Đậu
nành thường được trồng luân canh với cây bắp.
Hạt được gieo theo rãnh ở độ sâu 3-4 cm (nếu đất đủ ẩm) hoặc 4-6 cm (nếu
đất khô). Khoảng cách giữa các rãnh thường từ 30-45 cm, giữa các cây trong rãnh
từ 5-20 cm. Mỗi vụ cần xới đất làm cỏ 2-3 lần. Lần thứ nhất khi cây có 2-3 lá kép,
kết hợp bón thúc cho mỗi ha 50 kg urê (tránh để phân dính lên lá). Lần thứ hai xới
sâu 5-7 cm và vun gốc khi cây đậu tương chuẩn bị ra hoa (sau lần một khoảng 12-
15 ngày). Nếu trời mưa, đất đóng váng có thể xới lần thứ ba. Sau khi cây ra hoa
không nên xới, vun đất vì ảnh hưởng tới việc ra hoa kết quả.
2.2. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
2.2.1. Y học dân gian Việt Nam [1]
Từ lâu đậu nành cùng với một số thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dân
gian dùng làm thuốc để phục hồi sức khỏe và đã đúc kết thành các bài thuốc cổ
truyền để lưu giữa và truyền lại cho ngày sau.

16. 7
• Bài thuốc có đậu nành:
- Chữa cơ thể suy nhược, ra mồ hôi trộm: đậu nành 100g, hạt tiểu mạch lép
50g, đại táo 5 quả, nước vừa đủ, nấu chín, ăn trong ngày.
- Chữa thần kinh suy nhược, kém trí nhớ, hồi hộp, mệt mỏi, kém ăn, mất
ngủ: đậu nành 5g, liên nhục 8g, hoài sơn 4g, ý dĩ 4g, sa nhân 0,8g, sơn tra 2g, cẩn
tích 4g, toan táo nhân 1,2g, tá dược vừa đủ, làm viên chia 2-3 lần uống trong ngày.
Dùng nhiều ngày.
- Thuốc dinh dưỡng cho trẻ em: bột đậu nành phối hợp với bột ngũ cốc và
bột ca cao nấu thành bột đặc cho trẻ em ăn. Tỷ lệ theo kiểu khẩu vị và số lượng theo
nhu cầu của trẻ. Có thể phối hợp bột đậu nành với bột thịt cóc cho trẻ an chữa còi
xương suy dinh dưỡng.
2.2.2. Y học và hóa sinh hiện đại [1, 8, 9, 10, 11, 12]
2.2.2.1. Tác dụng bảo vệ gan
Tác dụng của các soyasaponin 1,2,3 và 4 đã được thử nghiệm theo phương
pháp nuôi cấy tế bào gan. Hoạt tính bảo vệ giảm dần theo thứ tự soyasaponin
3>4>1>2. Kết quả cho thấy các soyasaponin có 3 đơn vị đường. Tác dụng bảo vệ
gan là do một phân tử đường liên kết với aglycon ở C3. Soyasaponin 3 mạnh hơn
soyasaponin 4 có lẽ là do sự hiện diện của một đơn vị galactosyl mang nhóm
hydroxymethyl (CH2OH).
Kinjo và cộng sự (1998): Điều trị trên in vitro các tế bào gan chuột bị gây tổn
thương bằng soysaponin B. Tác động của hai nhóm soyasaponin 1 và 2 tương
đương trong khi tác động của nhóm 3 và nhóm 4 thì hiệu quả hơn nhiều.

17. 8
Jun và cộng sự (2002): Điều trị các tế bào gan người bị ung thư bằng
soyasaponin. Kết quả các soyasaponin ức chế sự đột biến gen tùy thuộc vào liều và
ngăn cản sự hình thành khối u.
2.2.2.2. Tác dụng ức chế monoaminoxydase A (MAO)
Nghiên cứu hoạt tính của MAO dùng serotonin làm cơ chất cho thấy
Flavonoid của đậu nành có tác dụng ức chế MAO.
2.2.2.3. Tác dụng chống oxy hóa (antioxydant)
Sự peroxyd hóa lipid được tiến hành trên microsom tim và gan của chuột
cống trắng. Dùng adriamycin là chất sinh ra các gốc tự do, nên làm tăng sự oxy hóa
lipid. Tác dụng chống oxy hóa của isoflavone chiết từ đậu nành được nghiên cứu so
sánh với α-tocopherol. Kết quả cho thấy isoflavone có tác dụng mạnh hơn α–
tocopherol 80-100 lần.
Goodman và cộng sự (1997): Cộng đồng hawai (n=332 ca ung thư, 511 ca
chứng) được cho ăn đậu nành và chất xơ trong 8 năm. Kết quả cho thấy chế độ ăn
nhiều đậu nành làm giảm đáng kể nguy cơ bị ung thư màng trong tử cung.
Zheng và cộng sự (1999): Nghiên cứu sự đào thải qua nước tiểu của
isoflavone ở phụ nữ bị ung thư vú. Kết quả sự đào thải qua nước tiểu của các
isoflavone thấp nhất là ở những phụ nữ bị ung thư.
Dalais và cộng sự (2004): 29 bệnh nhân nam bị ung thư tuyến tiền liệt được
cho ăn chế độ ăn nhiều hoặc ít chất isoflavone. Kết quả chế độ ăn giàu isoflavone
làm giảm các kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt. Người ta cho rằng cơ chế
tăng sinh các tế bào ác tính.
Adlercreutz (2002): Nghiên cứu tác động bảo vệ của các isoflavone và các
lignan chống lại ung thư vú, tuyến tiền liệt. Kết quả các isoflavone ức chế sự tăng

18. 9
sinh các khối u ở vú, tuyến tiền liệt và ở ruột. Tác động chống lại sự hình thành khối
u của các isoflavone hiệu quả hơn khi được tiêu thụ từ tuổi vị thành niên.
2.2.2.4. Tác dụng làm giảm cholesterol máu
Chế độ ăn uống nhiều đậu nành thì ít chất béo bão hòa và cholesterol, ít
năng lượng hơn nhiều so với chế độ ăn thịt. Mặc khác, chế độ ăn giàu đậu nành góp
phần đáng kể làm cải thiện lipid máu: làm giảm triglycerid, giảm cholesterol toàn
phần, giảm LDL (Low Density Lipid) nhưng lại làm tăng HDL (Hight Density
Lipid).
Anderson và cộng sự (1995): Tổng hợp từ 38 nhiên cứu những người ăn
hằng ngày protein chiết từ đậu nành với lượng khác nhau. Hiệu quả cao hơn ở bệnh
nhân cao cholesterol máu. Tác dụng không thấy khác biệt nhiều ở các nồng độ
protein 50%, 70% hay 90%.
Zhan và cộng sự (2005): Tổng hợp từ 23 nghiên cứu từ 1995-2002 đánh giá
tác động phòng chống nguy cơ bệnh tim mạch của protein và isoflavone đậu nành.
Protein đậu nành làm giảm cholesterol máu, giảm LDL, giảm triglycerid một cách
hiệu quả, đồng thời làm tăng HDL.
West và cộng sự (2005): 18 phụ nữ mãn kinh và 14 đàn ông cao cholesterol
máu tuân theo chế độ ăn 25g/ngày protein đậu nành có bổ sung 90mg isoflavone
hoặc uống sữa 25g/ngày trong 6 tuần lễ. Có sự giảm mức cholesterol máu đáng kể
khi ăn protein đậu nành
2.2.2.5. Tác dụng phòng chống các bệnh tim mạch
Nhiều nghiên cứu cho thấy tác động của globuline glycinine và β-
conglycinine chống lại các bệnh tim mạch.

19. 10
Anthony và cộng sự (1997): cho khỉ ăn protein đậu nành có bổ sung
isoflavone. Nhận thấy có sự ức chế hình thành các tổn thương và xơ vữa động
mạch.
Hallund và cộng sự (2006): 30 phụ nữ mãn kinh được cho ăn ngũ cốc có
hoặc không có isoflavone trong vòng 8 tuần lễ. Thức ăn ngũ cốc có chứa isoflavone
có khả năng gây dãn động mạch.
2.2.2.6. Tác dụng kiểu estrogen
Trong đậu nành, có các hợp chất giống như estrogen gọi là phytoestrogen tức
là estrogen thực vật. Thử nghiệm trên phụ nữ mãn kinh, khi nồng độ estrogen giảm
thường xuất hiện các cơn bốc hỏa người rạo rực, khó chịu. Dùng đậu nành 25g (2
cốc sữa đậu nành hoặc 1 bì đậu phụ) sẽ làm giảm các biểu hiện trên.
Các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh 2 chất phytoestrogen trong đậu nành là
daidzein và genistein ngoài tác dụng kiểu estrogen còn có tác dụng ngừa ung thư vú
ở phụ nữ, ngừa ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới và ngừa ung thư dạ dày cho cả
nam nữ.
2.2.2.7. Tác dụng dinh dưỡng:
Đậu nành có một tỷ lệ các chất đạm, chất béo, chất đường, chất khoáng và
các nguyên tố vi lượng. Đặc biệt chất béo trong đậu nành có một tỷ lệ acid béo thiết
yếu tới 50% là acid linoleic, 6,5% là acid linolenic. Các acid béo này là thành phần
rất quan trọng của màng tế bào thần kinh. Vì vậy chúng có vai trò rất quan trọng
cho sự phát triển cơ thể kể cả hệ thần kinh và quá trình tái tạo lại tế bào.
2.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC [1, 10, 11, 22]
2.3.1. Protein

20. 11
Protein của đậu nành có giá trị cao không chỉ về sản lượng thu hoạch mà nó
còn chứa đầy đủ tám loại acid amin thiết yếu cho cơ thể con người: isoleucin,
leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin và threonin. Hàm lượng
lysin trong đậu nành cao hơn hẳn so với các loại rau củ khác. Các acid amin có hàm
lượng thấp hơn trong đậu nành là methionin và cystein.
Trong phân đoạn protein đậu nành, người ta còn tìm thấy một lượng đáng kể
β-amylase, cytochrome C, lectine, lipoxygenase, urease, lunasin và protease-
inhibitor. Tuy nhiên, trong hạt đậu nành còn có chứa khoảng 1% lipoxygenase. Chất
này oxy hóa chất béo không bão hòa thành aldehyd mạch ngắn, gây ra vị đắng khó
chịu cho các sản phẩm từ đậu nành.
2.3.2. Lipid
Đậu nành chứa ít lipid nhưng trong hạt đậu nành chứa 18-20% lipid toàn
phần, trong đó đến 85% là các hợp chất của acid béo không bão hòa (acid linoleic,
acid linolenic).
Trong đậu nành cũng chứa lượng đáng kể lecithin, được sử dụng trong công
nghiệp sản xuất nhũ tương.
2.3.3. Glucid
Đậu nành nói chung có chứa α-galactooligosacharid khó tiêu hóa như
rafinose, stachyose hay verbascose. Các hợp chất này bị chuyển hóa bởi hệ vi khuẩn
ruột tạo khí, gây triệu chứng đầy hơi.
2.3.4. Chất khoáng
Các chất khoáng có trong đậu nành là kali, phosphor, magne, kẽm, canxi.

21. 12
2.3.5. Vitamin
Trong hạt đậu nành có chứa nhiều vitamin, không chỉ là các vitamin tan
trong dầu như các vitamin A, D, E, K mà còn có các vitamin tan trong nước như các
vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Riboflavine (B2), Niacine (B3), Acid pantotheic
(B5), Pyroxidin (B6), Acid folic (B9). Trong hạt đậu nành còn chứa một lượng đáng
kể vitamin nhóm E (tocopherol và tocotrienol), vốn là nhóm vitamin có hoạt tính
chống oxy hóa cao.
2.3.6. Isoflavone và các glycoside của nó:
Người ta đã tìm thấy trong đậu nành có chứa 12 chất thuộc nhóm isoflavone,
dưới dạng các aglycol hoặc dưới dạng glycosid. Ba aglycol được tìm thấy trong đậu
nành là daidzein, genistein, glycitein (Hình 2.6).
O
OH O
OH
HO O
O
OH
HO
MeO
Genistein Glycitein
O
O
OH
HO
Daidzein
Hinh 2.6: Cấu trúc của các isoflavone có trong đậu nành.
Các dẫn chất glycosid của genistein, daidzein và glycitein tạo thành các chất như:
genistin, daidzin, glycitin (Hình 2.7).

22. 13
O
OH O
OH
O
HO
OH
OH
HO
Genistin
O
O
OH
O
MeO
HO
OH
OH
HO
Glycitin
O
O
OH
O
HO
OH
OH
HO
Daidzin
Hình 2.7: Cấu trúc các glycoside của isoflavone
Hàm lượng các isoflavone trong đậu nành phụ thuộc rất nhiều vào giống đậu
nành, điều kiện khí hậu, sinh thái. Trong hạt đậu nành hàm lượng isoflavone thay
đổi từ 1-3%.

23. 14
2.3.7. Saponin
Soyasaponin nhóm A Soyasaponin nhóm B
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
R3
OAc
OAc
OAc
OH
CH2OH
OH
OH
OR2
OH
COOH
OH
R1
O
O
O
O
OH
CH2OH
OH
OH
OR2
OH
COOH
OH
R1
HO
R''
CH2OH
R'
Sapogenol A (R’=R’’=OH), B (R’=H, R’’=OH)
Soyasaponin nhóm A
R1 R2 R3
A1 CH2OH β-D-glucose CH2OAc
A2 CH2OH H CH2OAc
A3 H H CH2OAc
A4 CH2OH β-D-glucose H
A5 CH2OH H H
A6 H H
Soyasaponin nhóm B
R1 R2
CH2OH α-L-rhamnose
H α-L-rhamnose
CH2OH H
H H
CH2OH β-D-glucose
Hình 2.8 : Cấu trúc hóa học của các soyasaponin

24. 15
Saponin đậu nành là một nhóm các hợp chất có cấu trúc triterpen phức tạp
gồm khung aglycol kỵ nước nối với một hay nhiều nhóm đường thân nước. Các
soyasaponin nhóm A có hai chuỗi đường trong khi nhóm B chỉ có một chuỗi đường
và có thể mang thêm nhóm 2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one
(DDMP).
2.3.8. Phytosterol
Các phytosterol có cấu trúc tương tự như cholesterol. Các phytosterol chính
là β-sitosterol (24-α-ethylcholesterol), campesterol (24-α-methylcholesterol) và
stigmasterol (Δ22
,24-α-ethylcholesterol).
HO HO
Cholesterol Campesterol
HO HO
Stigmasterol β-sitosterol
Hình 2.9: Cấu trúc hóa học của cholesterol và của các phytosterol
Các phytosterol có những hoạt tính dược học quan trọng như làm giảm
cholesterol máu, kháng khối u, kháng tiểu đường, kháng viêm,… Các phytosterol
cũng tham gia thành phần cấu tạo của màng tế bào. Nhờ cấu trúc tương tự như
cholesterol nên các phytosterol có trong đậu nành ức chế sự hấp thu và sinh tổng
hợp cholesterol.

25. 16
2.3.9. Chất ức chế protease
Hai chất ức chế protease được nghiên cứu nhiều nhất là Bowman-Birk (BBI)
và Kunitz (KI). BBI là một peptid ngắn 7900Da có khả năng ức chế trypsine và
chymotrypsine trong khi KI chỉ ức chế trypsine.
Hoạt tính bảo vệ chống lại các tổn thương gây ra bởi tia xạ hay các gốc tự do
của BBI đã được chứng minh trên các tế bào của các cơ quan hay mô khác nhau và
ở chuột, cho thấy khả năng phòng nhiều loại bệnh ung thư khác nhau như ở ruột,
phổi, da hay ở khoang miệng.
2.3.10. Phytate
R
R
R
R
R
R
6
1
5
4
3
2
R=OPO3H2
Hình 2.10 : Cấu trúc của acid phytic
Acid phytic: inositol-1,2,3,4,5,6-hexaphosphate hay myo-insitol
hexakisphosphate (Hình 2.13)
Acid phytic vừa có tác động không có lợi cho cơ thể ở pH sinh lý. Ban đầu,
người ta cho rằng acid phytic tạo phức với các ion Fe2+
, Ca2+
, Mg2+
và Zn2+
; ức
chế sự hấp thu các ion này. Hơn nữa, acid phytic còn tương tác với protein, làm ức
chế một vài enzyme như α-amylase làm chậm sự tiêu hóa amidon và làm giảm
glucose trong máu.
2.4. Genistein [7, 13, 14, 17, 18, 21, 24]

26. 17
O
OH O
OH
HO
Hình 2.11: Genistein
Tên IUPAC : 5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-one
Tên khác : 4´
,5,7,-Trihydroxyisoflavone
Công thức nguyên : C15H10O5
Trọng lượng phân tử : 270,24g/mol
Trạng thái : tinh thể màu vàng, hình kim
Độ tan : dễ tan trong methanol, DMSO
Điểm nóng chảy : 297-298o
C
Genistein thuộc nhóm các isoflavone, có hàm lượng cao trong đậu nành cũng
như các sản phẩm từ đậu nành. Ngoài ra genistein cũng có mặt trong nhiều loại rau
quả và ngũ cốc (cỏ ba lá đỏ, củ sắn dây…) với hàm lượng khác nhau. Genistein đã
được chứng minh là một phytoestrogen và có khả năng phát huy nhiều tác dụng
cũng như ảnh hưởng khác nhau khi có mặt trong cơ thể.
Cơ chế tác động của genistein:
• Hoạt tính anti-estrogen: Do cấu trúc tương tự hormon estrogen của người
nên genistein có khả năng gắn với các receptor của estrogen, do đó làm giảm nồng
độ estrogen trong máu.
• Ức chế hoạt tính các enzyme đặc hiệu như tyrosine kinase (enzyme có khả
năng xúc tác cho quá trình chuyển nhóm phốt phát từ ATP đến tyrosin), AND-
topoisomerase I và II (enzyme tháo xoắn AND) có trong các tế bào tăng sinh.
• Ức chế enzyme caspase, enzyme tác động trong quá trình thoái biến neuron
nên genistein có tác động tốt trong việc phòng bệnh Alzheimer.

27. 18
• Nhờ hoạt tính chống oxy hóa nên genistein có khả năng ức chế các sản
phẩm peroxyd, các gốc tự do, các chất oxy hóa có khả năng gây đột biến DNA.
Các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu hoạt tính của genistein và đạt được
các kết quả như sau:
Singh và cộng sự (2006): Khảo sát tác dụng của genistein in vitro và in vivo
trên các tế bào ung thư bàng quang của chuột. Trên in vitro và in vivo nhận thấy sự
ức chế tăng sinh tế bào ung thư phụ thuộc vào liều, làm giảm khoảng 50% kích
thước khối u ở chuột.
Li và cộng sự (2005): Điều trị in vitro các tế bào ung thư (tuyến tiền liệt, vú,
tụy và phổi) bằng genistein trong 24 giờ. Kết quả genistein ức chế đáng kể sự tăng
sinh của các khối u.
Lin và cộng sự (2005): Tác động của daidzein và genistein trên các tế bào
ung thư vú. Cả hai chất đều có tác động ức chế phosphodiesterase ở các mô tăng
sinh.
Cao và cộng sự (2006): Điều trị các tế bào ung thư tuyến tụy bằng daidzein
hay bằng genistein. Cả hai chất làm giảm khả năng sống các tế bào ung thư.
Hedlund và cộng sự (2006): Điều trị các tế bào ung thư tuyến tiền liệt bằng
các isoflavone khác nhau như genistein, daidzein, glycitein. Genistein và daidzein
làm giảm hẳn sự tăng sinh tế bào biểu mô lành tính. Glycitein làm giảm đáng kể sự
tăng sinh của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt.
Tuy nhiên, các nhà khoa học thuộc trường King’s College Lodon (2006) đã
phát hiện genistein sẽ tiêu diệt tinh trùng trước khi chúng kịp kết hợp với trứng. Vì
vậy phụ nữ chuẩn bị có thai được khuyến cáo nên tránh ăn những thức ăn có chứa
đậu nành trong một vài ngày.
• Một số sản phẩm về Genistein trên thị trường thế giới:

28. 19
Hình 2.12: Sản phẩm Genistein và một số hợp chất Isoflavone

29. 20
Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. NGUYÊN LIỆU:
3.1.1. Hạt đậu nành
Hạt đậu nành được mua ở siêu thị sản phẩm của công ty trách nhiệm hữu hạn
thương mại và dịch vụ Xuân Hồng. Địa chỉ: 44/12 Phan Xích Long – phường 16 -
Quận 11 - Thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2. Dụng cụ - hóa chất
3.1.2.1. Dụng cụ
• Máy cô quay
• Máy đo UV DR2000
• Máy đo điểm chảy Electrothermal 9100; mao quản dùng để đo điểm chảy.
Hình 3.1: Hạt đậu nành

30. 21
• Cột sắc ký
• Đèn UV 254 và UV 365.
• Cân phân tích PRECISA XB 220A.
• Bản sắc ký Silicagel F254 MERCK (Silicagel 60 F254, 20×20cm)
• Dụng cụ thực hành các loại.
3.1.2.2. Hóa chất
• Etyl acetat • Dimethylsulfoxid
• Acidchlohydric • Ethanol
• Acid sulfuric 10% trong cồn • Ether petrole
• Chloroforme • Methanol
• Diethylether • Nước cất
• Iod
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
3.2.1. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt đậu nành [2, 3, 5]
Nguyên tắc: chiết tách hỗn hợp các chất có trong hạt đậu nành thành ba phân
đoạn theo độ phân cực tăng dần bằng cách chiết hạt đậu nành lần lượt với các dung
môi: ether ethylic, ethanol và nước. Sau đó xác định các nhóm hợp chất bằng các
phản ứng đặc trưng.
3.2.1.1. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid
• Thuốc thử alkaloid: Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa
với alkaloid.
-Thuốc thử Mayer
Công thức: 1,35 g HgCl2 hòa tan trong 100 ml dung dịch KI 5%.

31. 22
Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa màu trắng vàng.
-Thuốc thử Dragendoff
Công thức:
+Dung dịch A: 850 mg Bi(NO3)3.5H2O trong 40 ml H2O và 10 ml acetic.
+Dung dịch B: Hòa tan 8 g KI trong 20 ml H2O.
Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử.
Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ.
-Thuốc thử Wagner
Công thức: Hòa tan 5 g Iod trong 100 ml dung dịch KI 10%.
Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen.
-Thuốc thử Bouchardat
Công thức: I2 2,5 g và 5,0 g KI hòa tan trong 10 ml nước cất.
Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm.
-Thuốc thử Hager
Acid picric bão hòa trong H2O.
Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu từ vàng cam đến đỏ.
3.2.1.2. Khảo sát sự hiện diện của hợp chất coumarine
• Thuốc thử coumarine
- Dung dịch NaOH 10%.
- Dung địch HCl đđ.
- Nước cất.
- Dung dịch Na2CO3 10%.

32. 23
- p-Nitroaniline 3 - 5 giọt.
• Định tính coumarine
Lấy dịch trích ethanol 98% làm mẫu thử.
- Phản ứng mở vòng lactone:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử, thêm vào một trong 2 ống 0,5
ml NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm
vào mỗi ống 4 ml nước cất.
Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là
dương tính. Tiếp tục đem acid hóa ống có kiềm với vài giọt HCl đđ, nếu dung dịch
đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính.
- Phản ứng diazo hóa:
Lấy 2 ml mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml dung dịch Na2CO3 10% và 4
ml nước cất. Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dấu hiệu dương
tính.
3.2.1.3. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid
•Thuốc thử flavonoid
Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với
acetate chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với sắt (III) clorur, FeCl3.
Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Shinoda
hay Cyanidin của Willstater. Thuốc thử là tập hợp các hóa chất gồm: dung dịch
HCl đậm đặc, bột Mg kim loại, rượu isoamylic [CH3(CH3)CHCH2CH2CH2OH].
Kết quả phản ứng cho màu tím.
3.2.1.4. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycosid
• Thuốc thử glycosid
-Thuốc thử Tollen

33. 24
Công thức: pha 0,5 ml dung dịch AgNO3 10% với 0,5 ml dung dịch NaOH
10%. Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa.
Dấu hiệu nhận biết: có Ag kết tủa.
-Thuốc thử Molish
Công thức: nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1 ml H2SO4 đậm đặc.
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện màu đỏ thẫm.
-Thuốc thử Baljet
Công thức: pha dung dịch acid picric 1% trong cồn với dung dịch NaOH
10% trong nước theo tỷ lệ thể tích 1:1.
Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ 3 - 4 giọt thuốc thử vào 1 ml chất thử, nếu có màu
vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính.
-Thuốc thử Legal
Lấy 1 ml mẫu thử cho vào 2 - 3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch Natri
nitroprussiat 0,5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2 N.
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện màu đỏ tím.
3.2.1.5. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid
• Thuốc thử steroid
- Thuốc thử Liebermann-Burchard
Anhydrid acetic: 20 ml.
H2SO4 đậm đặc: 1 ml.

34. 25
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có
màu từ hồng đến xanh lá.
- Thuốc thử Rosenheim
Cl3COOH 90%.
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện kết tủa và kết tủa sẽ tan khi có dư thuốc thử.
- Thuốc thử Salkowski
H2SO4 đặc: 1 ml.
Dung dịch tách làm 2 lớp: lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ.
3.2.1.6. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin
• Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin
a. Cơ sở của phương pháp
Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của
saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1 cm sau khi lắc
trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định.
b. Cách tiến hành thử nghiệm và dấu hiệu nhận biết
Cân 1 g bột dược liệu cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi. Tiếp
tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nước cất
cho đến 100 ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm. Cho
vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5… 10 ml dịch lọc. Thêm nước cất vào mỗi
ống cho đủ 10 ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15
giây, mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút, sau đó đo chiều cao các cột bọt.

35. 26
Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, thì coi như
không có saponin.
Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức: CSB=100 x 10i
CSB:Chỉ số bọt
i: ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1 cm.
Ví dụ: Bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1 cm. Khối lượng này coi như đã pha
loãng 100 lần. Như vậy, nguyên liệu có chỉ số tạo bọt bằng 500.
• Dựa vào các phản ứng đặc trưng
- Thuốc thử Liebermann
Anhydrid acetic.
H2SO4 đậm đặc.
Dấu hiệu nhận biết:
+ Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có
saponin triterpene.
+ Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin
steroid.
-Phản ứng Kahlenberg
SbCl3 bão hòa trong CHCl3
Dấu hiệu nhận biết:
+ Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene.

36. 27
+ Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid.
3.2.1.7. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin
• Thuốc thử tanin
- Thuốc thử Stiasny
Formol (36%) 20 ml.
Dung dịch HCl đậm đặc 10 ml.
Dấu hiệu nhận biết: tủa vàng nâu.
- Thuốc thử gelatin mặn
Gelatin 2 g.
Dung dịch NaCl bão hòa 10 ml.
Dấu hiệu nhận biết: tủa trắng.
- Thuốc thử acetate chì
Pha bão hòa trong nước.
Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu vàng nhạt.
-Dung dịch FeCl3
Pha 1% trong nước.
Dấu hiệu nhận biết: tạo phức màu đen.

37. 28
3.2.1.8. Khảo sát sự hiện diện của đường khử
• Thuốc thử đường khử: Feling
Feling A: CuSO4 tinh thể 0,6928g , nước cất vừa đủ 10ml.
Feling B: Kali natritactrat 3,46g, NaOH 1g, nước cất vừa đủ 10ml.
Dấu hiệu nhận biết: kết tủa đỏ gạch khi đun nóng.
3.2.1.9. Khảo sát sự hiện diện của acid hữu cơ
• Thuốc thử: Na2CO3. Dấu hiệu nhận biết: sủi bột khí.
3.2.2. Các phương pháp chiết xuất [2, 3, 5]
Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết xuất
và cách chiết.
Một phương pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể được hoạch định một khi đã
biết rõ thành phần hóa học của cây. Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau
trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung
áp dụng cho tất cả các hợp chất trong cây.
3.2.2.1. Phương pháp ngâm dầm
Kỹ thuật chiết ngâm dầm không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ
dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng
thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình nhựa vì
dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa
trong cây. Có thể tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều
lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc nhẹ.
Sau 24 giờ, dung môi trong bình được rót ra và đổ dung môi mới vào.

38. 29
3.2.2.2. Phương pháp ngấm kiệt:
Dụng cụ gồm một bình ngấm kiệt, hình trụ đứng, bằng thủy tinh, ở dưới đáy
bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung môi chảy ra, khi đã ngâm mẫu
cây trong dung môi sau một thời gian nhất định. Dung dịch chảy ra được hứng trong
một erlen để bên dưới, trên cao có một bình lóng chứa dung môi để nhỏ vào bình
ngấm kiệt này.
Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất sẽ được liên
tục thay thế bằng dung môi mới.
3.2.2.3. Chiết bằng Soxhlet:
Quá trình ly trích được tự động, liên tục nên nhanh chóng. Nhược điểm của
phương pháp này là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu cây, trong suốt quá
trình chiết xuất mẫu cây luôn luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên những hợp chất
kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị phân giải.
3.2.2.4. Chiết bằng cách đun hoàn lưu:
Bột cây và dung môi hữu cơ được chứa trong một bình cầu có gắn ống sinh
hàn. Đun hoàn lưu trên bếp cách thủy ở nhiệt độ sôi của dung môi, sau một thời
gian cần thiết dung dịch chiết được lấy ra và lọc qua giấy lọc. Dung môi mới được
cho vào và tiếp tục chiết 3,4 lần đến khi kiệt.
Hiếm khi người ta đun bột cây với dung môi là nước vì nước có nhiệt độ sôi
cao và áp suất hơi nhỏ nên rất khó cô cạn. Để chiết xuất những hợp chất tan nhiều
trong nước, người ta thường dùng hỗn hợp Methanol-Nước hoặc Ethanol-Nước.
3.2.2.5. Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước:
Đây là phương pháp đặc biệt để ly trích tinh dầu và những hợp chất dễ bây
hơi có trong cây.

39. 30
3.2.3. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất:
Trong phần thực nghiệm, ta sử dụng phương pháp sắc ký cột để tách các
phân đoạn từ cao thu được và phương pháp sắc ký lớp mỏng để kiểm tra sơ bộ phân
đoạn thu được.
Sắc ký là một quy trình trong đó các chất tan được tách riêng ra bởi quá trình
dịch chuyển khác nhau về động lực học của chất này trong hệ thống hai hay nhiều
pha. Một trong các pha này chuyển động một cách liên tục theo một hướng nhất
định và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau là do có sự
khác nhau giữa chúng về sự phân bố, sự hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ
hòa tan và áp suất hơi.
3.2.3.1. Sắc ký cột
Nguyên tắc: Trong sắc ký cột thì pha tĩnh được nhồi trong một cột bằng thép
không rỉ hay bằng thủy tinh. Trong sắc ký cột, cơ chế tách thường là cơ chế hấp
phụ. Đó là kỹ thuật sắc ký trong đó sự phân tách các chất tan là do sự cân bằng hấp
phụ trên bề mặt của chất tan giữa các tiểu phân chất rắn của pha tĩnh với pha động.
Chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha động chảy qua chất hấp
phụ.
3.2.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là phương pháp sắc ký đơn giản và nhanh
chống cho phép khảo sát để tìm ra dung môi khai triển thích hợp nhất để tiến hành
sắc ký cột; kiểm tra sơ bộ thành phần có trong các phân đoạn thu được từ sắc ký cột
và khảo sát sơ bộ độ tinh khiết của một chất phân lập được.
Trong sắc ký lớp mỏng, cơ chế tách thường là cơ chế hấp phụ, trong đó sự
tách chủ yếu dựa vào ái lực hấp phụ khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ
rắn (silicagel). Trong phần thực nghiệm, ta cũng sử dụng sắc ký lớp mỏng với cơ

40. 31
chế phân bố, trong đó pha tĩnh được tẩm trong giá mang. Ví dụ hệ khai triển:
chloroform- methanol (9:1).
3.2.3.3. Phương pháp kết tinh
Nguyên tắc: Phương pháp kết tinh là phương pháp thường được sử dụng để
làm tinh khiết các chất có dạng tinh thể. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là
tính tan của một chất trong dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thay đổi theo nhiệt độ.
Muốn áp dụng phương pháp này thì cần phải tìm cho được một dung môi mà trong
đó chỉ có chất cần làm tinh khiết kết tinh được hoặc các tạp chất dễ tan.
Để tiến hành kết tinh một chất, cần phải:
1. Sử dụng một lượng ít nhất dung môi để hòa tan hết các tạp chất ở nhiệt độ
cao hoặc nhiệt độ sôi của dung môi.
2. Ta thường làm lạnh bằng thau đá hay để vào tủ lạnh. Trong quá trình làm
lạnh, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng để các tinh thể không đóng ở thành
bercher. Độ tinh khiết phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh.
3. Dùng pipet pasteur để hút dung dịch tạp chất ra mà không làm xáo trộn
các tinh thể. Trong phần thực nghiệm này, ta không sử dụng phễu lọc ở nhiệt độ
thấp dưới áp suất chân không vì lượng chất cần kết tinh ít.
4. Rửa lại tinh thể với lượng dung môi ít nhất.
5. Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của chất cần kết tinh bằng sắc ký lớp mỏng,
kết tinh nhiều lần cho đến khi các tinh thể được tinh khiết.
3.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học [4]
Để xác định cấu trúc hóa học của một chất, ta sử dụng các phương pháp sau
đây:

41. http://bit.ly/KhoTaiLieuAZ