1. UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO-BICOCCA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Biotecnologie
Indirizzo Molecolare
“Metabolismo energetico e Neoplasia”
Relatore:
Prof. Marco VANONI
Tesi di laurea di:
Albanese Michele
Matricola n. 064237
Recapito telefonico: 3478713619
Data della seduta della prova finale 14 luglio 2009
SINTESI
In tutte le forme di vita il metabolismo si è evoluto, sotto l’impulso della pressione selettiva, al fine
di soddisfare adeguatamente i fabbisogni dell’organismo. Negli organismi unicellulari la dura
competizione per meglio adattarsi alle condizioni ambientali è stata di stimolo all’ottimizzazione
dell’utilizzo delle risorse, garantendo una proliferazione quanto più rapida possibile in situazioni di
abbondante disponibilità di nutrienti. Negli organismi pluricellulari il discorso è più complesso
perché pur essendo l’attività dell’organismo nel suo insieme il risultato delle funzioni delle singole
cellule, la stringente organizzazione cui sono sottoposte per coordinare efficacemente le
funzionalità organiche determina proprietà peculiari nelle cellule (es. limitazione della crescita,
specializzazione e interdipendenza tra cellule diverse).
Sia nelle forme di vita unicellulari che pluricellulari, la proliferazione è una delle fasi più
impegnative della vita della cellula. La maggior parte delle attività metaboliche focalizza l’utilizzo
delle risorse (carbonio, azoto, energia) verso il sostegno delle vie biosintetiche necessarie per
fornire “blocchi costruttivi” per la realizzazione di una nuova cellula. Negli organismi più evoluti,
come i mammiferi, ogni cellula è sottoposta a una rigorosa vigilanza allo scopo di prevenire una
proliferazione incontrollata e oltre le necessità. La mancanza di segnali inibitori unita alla
stimolazione di fattori di crescita è in grado di scatenare al’interno della cellula i processi necessari
per la proliferazione. Le cellule tumorali sono in grado di aggirare tutti questi controlli. Una delle
più evidenti differenze riscontrate rispetto alle cellule normali è quella che la maggior parte delle
cellule tumorali esibisce una ridotta fosforilazione ossidativa mitocondriale, per soddisfare il
fabbisogno energetico, facendo piuttosto affidamento su un’elevata glicolisi aerobia. Per parecchi
decenni il metabolismo delle cellule tumorali è stato considerato un effetto secondario della
malignità piuttosto che uno degli eventi principali della trasformazione neoplastica. Solo
nell’ultimo decennio sono apparsi studi intensivi sulla funzione e sul controllo della trasformazione
metabolica nel cancro. E’ così apparsa sempre più evidente l’esistenza di uno stretto rapporto tra vie
di trasduzione del segnale coinvolte nella proliferazione, regolazione dei pathway metabolici e
mutazioni oncogeniche. Inoltre una delle caratteristiche principali del cancro, la soppressione dei
meccanismi che inducono la morte programmata, sembra essere associata all’elevata glicolisi e alla

2. trasformazione metabolica. Molte delle osservazioni che hanno permesso di collegare due processi
così apparentemente diversi sono avvenute approfondendo la conoscenza dei complessi fenomeni
che coinvolgono i mitocondri. Sia i processi di apoptosi che diversi pathway metabolici cellulari
(come il ciclo di Krebs) hanno luogo in questi organelli o ne sono regolati.
I due articoli analizzati in questa tesi entrano in merito ai meccanismi e alle alterazioni che
caratterizzano la complessa interazione fra trasformazione metabolica e silenziamento
mitocondriale delle cellule tumorali. Nel primo articolo uno studio degli effetti del dicloroacetato
(DCA) su linee cellulari umane di cancro, le quali esibivano un profilo caratteristico (potenziale di
membrana mitocondriale iperpolarizzato, bassa espressione dei canali del potassio voltaggio-
dipendenti, elevata attività del fattore trascrizionale nucleare 1 dei linfociti T attivati), ha permesso
di individuare e descrivere un asse tra mitocondri - canali del potassio voltaggio-dipendenti - fattore
di trascrizione NFAT. La reversione metabolica indotta dal dicloroacetato è stata in grado di
stimolare l’apoptosi, rallentare la proliferazione e inibire la crescita tumorale, come confermato da
saggi di tumorigenicità in ratti. Il secondo articolo, investigando i meccanismi che determinano la
chemioresistenza di molti tumori, è entrato in merito al ruolo di una proteina della membrana
interna mitocondriale, la proteina disaccoppiante 2 (UCP2). Sovraesprimendo UCP2 in linee
cellulari umane di cancro al colon, caratterizzate da bassi livelli di UCP2 endogena, si sono
riscontrati effetti sulla funzionalità mitocondriale e sul controllo dello stress ossidativo. La
resistenza ai trattamenti con chemioterapici delle cellule tumorali sovraesprimenti la proteina
disaccoppiante 2 è stata confermata anche da studi su xenotrapianti in topo. Inoltre la proteina
disaccoppiante 2 ha dimostrato avere delle implicazioni sulla stimolazione dell’effetto Warburg
(elevata glicolisi aerobia), come hanno mostrato alcuni saggi biochimici e la vitalità cellulare in
risposta a trattamenti con inibitori glicolitici. La crescente conoscenza acquisita negli ultimi anni
sulle proteine disaccoppianti 2 ha messo sempre più in risalto lo stretto rapporto di queste proteine
con la trasformazione metabolica. Pertanto i due articoli, pur trattando aspetti distinti e specifici
all’interno del complesso fenomeno della trasformazione metabolica delle cellule tumorali, hanno
messo in evidenza che l’impatto delle attività metaboliche non ha solo effetti sul metabolismo in
senso stretto, ma coinvolge anche la sopravvivenza e la resistenza alla morte programmata. Lo
stretto legame tra questi processi potrebbe essere sfruttato per nuove strategie antitumorali. Il primo
articolo suggerisce che un approccio terapeutico volto a colpire l’attivazione/inibizione di un
determinato pathway metabolico mitocondriale potrebbe essere una strategia antitumorale efficace
sia perché in grado di revertire la trasformazione metabolica verso il fenotipo caratteristico delle
cellule non maligne, sia perché in questo modo si andrebbe a interessare i meccanismi che
determinano la sensibilità dei mitocondri all’induzione dei pathway apoptotici. Il secondo articolo
propone invece una strategia inversa. Un intervento incisivo su alcuni dei componenti chiave della
resistenza all’apoptosi mitocondriale (come le proteine disaccoppianti 2) potrebbe essere di grande
interesse perché oltre a contrastare le capacità adattative (chemioresistenza) si avrebbero degli
effetti anche sui pathway metabolici che sostengono la trasformazione maligna.
Numerose recenti pubblicazioni stanno riaccendendo l’attenzione su quest’ampia area della
trasformazione neoplastica dalle promettenti potenzialità. Molto si deve ancora approfondire sul
cancro sia a livello del metabolismo cellulare che sistemico. La maggior parte delle conoscenze sui
pathway metabolici è ampiamente basata su osservazioni in cellule non proliferative e differenziate.
Una dimostrazione di quanto poco ancora si sappia arriva da diversi studi clinici che hanno
mostrato degli inaspettati effetti benefici antitumorali di farmaci utilizzati contro malattie
metaboliche, come il diabete. In aggiunta, poiché negli organismi multicellulari il bilancio e il
rifornimento delle necessità metaboliche dei tessuti e delle singole cellule sono regolati a livello
sistemico, potrebbe essere molto intrigante e importante approfondire come il metabolismo
dell’intero organismo interagisce con il metabolismo tumorale. Ciò permetterebbe di migliorare la
definizione di eventuali rischi e predisposizioni, e soprattutto offrirebbe nuovi spunti per interventi
terapeutici.

3. ABSTRACT
In all known life forms metabolism has evolved, under the influence of selective pressure, in order
to adequately meet the needs of organism. In unicellular organisms the hard competition in order to
adapt to environmental conditions has been a stimulus to the optimization of resource utilization,
ensuring proliferation in conditions of good nutrient availability. In multicellular organisms,
proliferation of individual cells needs to be strictly coordinated in order to fulfill higher order
requirements of the tissue, organ, and organismal level. Hence, sophisticated control mechanisms
have evolved to avoid uncontrolled proliferation. Lack of inhibitory signals in conjunction with
growth factors stimulation can trigger cellular processes needed for proliferation. Cancer cells
overcome all these controls. One of the most important differences between cancer and normal cells
is that they exhibit reduced mitochondrial oxidative phosphorylation to meet energy needs, relying
on aerobic glycolisis. For several decades, metabolism of tumor cells was considered a secondary
result of malignancy rather than one of the main events of neoplastic transformation. In the last
decade intensive studies about function and control of metabolic transformation in cancer provided
evidence supporting a close dependence between signal transduction pathways involved in
proliferation, regulation of metabolic pathways and oncogenic mutations. Furthermore an essential
feature of cancer, evasion of programmated cell death (apoptosis), seems to be connected with high
glycolysis and metabolic transformation. Several studies, which investigate the complex processes
that involve mitochondria, have demonstrated the close connection between those seemingly
different pathways. Both apoptosis and several metabolic pathways converge in the mitochondria
and are dependent from it. This thesis discusses two articles that dissect mechanisms and changes
that characterize the complex interaction between metabolic transformation and mitochondrial
silencing in tumor cell. In the first article, a study of dichloroacetate (DCA) effects on human
cancer cell lines, which have a distinctive profile (hyperpolarizated mitochondria, low expression of
the voltage-gated K+
channels (Kv), high activated nuclear factor of activated T-cells (NFAT)), has
allowed to identify and detail a mitochondria – voltage-gated potassium channel - transcription
factor NFAT axis. Experiments in vitro have supported that DCA-induced metabolic normalization
exerts positive effects, inducing apoptosis and decreasing cancer growth and proliferation. The
second article, approaching mechanisms that underlie chemoresistance in cancer cell, has discussed
about the function of a protein situated in the inner mitochondrial membrane, the uncoupling
protein 2 (UCP2). Overexpression of uncoupling protein 2, in human cancer cell lines with low
endogenous UCP2 levels, influence mitochondrial activities and facilitate an efficient control of
oxidative stress. Analyses of tumor xenografts in mice, using cancer cells that stably overexpress
UCP2, have supported the in vivo effects of uncoupling protein 2 on drug resistance. Findings via
biochemical and cell viability assays in response to treatments with glycolytic inhibitors have
suggested that uncoupling protein 2 is involved with induction of the glycolytic phenotype
(Warburg effect). The close relationship between uncoupling proteins 2 and metabolic
transformation have been underlined in recent studies.
Although those two articles approach the same complex phenomenon of metabolic
transformation in tumor cells under different perspectives, they show that the influence of metabolic
activities not only impinges of metabolic pathways but also affects survival and resistance to
programmed death. The close link between these processes could be exploited for new anticancer
strategies. The first article suggests in fact that a therapeutic approach aimed to targeting a specific
activated/inhibited mitochondrial metabolic pathway could be an effective anticancer strategy.
Normalization of metabolic transformation can reverts to characteristic phenotype of non-malignant
cells, and consequently it would affect the mechanisms that determine the sensitive of mitochondria
to induction of apoptotic pathway. The second article proposes an inverse strategy. An incisive
action on some of the key components of mitochondrial apoptosis resistance (such as uncoupling
proteins 2) could be of great interest because in addition to contrast the adaptive capacity

4. (chemoresistance) of cancer cell it will have positive results against the metabolic pathways that
support the malignant transformation. There is much that still needs to be learned about cancer
metabolism in both individual cells and organismal level. Some clinical studies have shown an
unexpected anticancer beneficial effects of drugs used against metabolic diseases, such as diabetes.
Hence, it could be interesting and important to investigate how metabolism of whole-body interacts
with tumor metabolism. Moreover it could lead to the definition of possible risks and
predispositions, especially provides new insights for therapeutic interventions.