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2019年度 第1回バイオインフォマティクス実習
- 2. • Graphical User Interface (GUI) コンピュータのディスプレイ上で、アイコンや画像などを多用し、マウスなどの ポインティングデバイスで直感的操作を可能とするユーザーインターフェース • Character User Interface (CUI) コマンドや情報を文字によって表示し、コンピュータの操作を行うユーザーイン ターフェース PCの基本的操作
- 3. • CUI環境を提供するプログラム • ターミナル上でコマンドを入力して、プログラムを実行する。 • 実行結果がターミナル上に文字で表示される。 • 全てのプログラム～ネットワークツール～仮想UNIX環境をクリック して実行 ターミナル（端末）
- 5. Z: Desktop Document ・ ・ ・ Cygwin X $ ls ls : フォルダ内のファイル名を表示するコマンド フォルダの階層構造
- 6. proxyサーバ 実習室PC1 実習室PC2 ・・・ 実習室PC用ネットワークストレージ 課題配布フォルダ ユーザフォルダ inter net Cygwin X $ export http_proxy=“http://proxy.med.yokohama-cu.ac.jp:8080” 8080 port proxyサーバの設定 横浜市大学内LAN
- 7. 従来型シーケンサー 次世代シーケンサー 日数 13年間 3.5日 費用 1400万ドル 1000ドル ヒトゲノムプロジェクト 1990年 アメリカのプロジェクトとして開始 2003年 完成版が公開される 1000＄ゲノムプロジェクト ヒトゲノムを1000＄で読めるシーケンサーを開発する 技術革新によるデータ産生量の爆発的な増加
- 8. Reuter JA, Spacek DV and Snyder MP Mol Cell 2015 May 21;58(4):586-97 データ量の飛躍的な増大→解析手法の開発 Development of NGS platform
- 9. 次世代シーケンスデータ ゲノム長: G リード数 : N リード長: L カバー率 = (N × L) / G …AGGTGCATGCCGCATCGATCGAGC… AGGTGCATG GCATGCCGCAT GCATCGATCGAGC paired end single end ゲノム リード
- 10. SRA Sequence Read Archive raw sequence dataが登録されているデータベース https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
- 11. SRA Toolkit SRA toolkit : NCBIが配布している解析ツール download siteからダウンロードして解凍すれば使用できる https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software
- 12. 解凍したsratoolkitフォルダ内のbinフォルダで shit + 右クリックして “PoweShellウィンドウをここに開く”を選択 SRA ToolkitをPowerShellで起動する
- 13. Dataのダウンロード→FASTQに変換 Windows PowerShell X > prefetch.exe SRR6887399 > fastq-dump.exe SRR6887399.sra prefetchを実行するとユーザフォルダ下に ncbi/public/sraフォルダが作成され、その中に.sra ファイルがダウンロードされるので、fastq-dump でfastqフォーマットに変換する。 今回使用しているデータ SRR687399 EGFR mutant lung cancer cell scRNA-seqデータ single end
- 14. • 1行目：＠配列ID • 2行目：塩基配列 • 3行目：+配列ID 説明 • 4行目：クオリティー値（シーケンスエラーの生じる確率） ＠Seq-ID AGGTGCATCGATGCGCGAATAAT + !1’’*))++//?”AAA{{ FASTQフォーマット 配列情報を記載する標準的書式
- 16. • マッピングツールの一つ。 • Burrows Wheeler transformを利用している。 • 並列化に対応しており高速であるが、メモリの消費は少ない。 • http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml Latest releaseから最新版をダウンロードして、展開するだけで使用可能です。 Bowtie2
- 18. Bowtie2の実行 Cygwin X $ export PATH=$PATH:/bowtie2を展開したフォルダ名 $ bowtie2 –p CPU数 –x 参照ゲノム –U fastqファイル名 –S 出力ファイル名 -x : 参照ゲノムを指定 6個のファイルで構成されている。 拡張子は.1.bt2, .2.bt2, .3.bt2, .4.bt2, .rev1.bt2, rev2.bt2 拡張子前までのファイル名で指定 -U : シングルエンドの場合 fastqファイル名 -1 : ペアエンドの場合 fastqファイル名 その1 -2 : ペアエンドの場合 fastqファイル名 その2 -S : 出力ファイル名 SAMフォーマットで出力 -p : 使用するCPU数
- 19. Samtools https://www.htslib.org/ samフォーマット : 配列断片の位置情報を記載するフォーマット 染色体番号、ポジションなどが記載されている。 Samtools : samフォーマットファイルを操作するツール
- 20. Cygwin X $ samtools view –bS test_output.sam > test_output.bam sam→bam変換の書式 samtools view –bS samファイル名 > bamファイル名 SAM → BAM変換 Bamフォーマット：内容はsamフォーマットと同じだが、容量が小さくなる。
- 21. http://www.broadinstitute.org/igv/ Integrative Genomics Viewer (IGV) マッピングされた配列断片の可視化ツール
- 24. viewメニューからpreferenceを選択 設定ウィンドウが開くのでproxyを選択 proxy host:proxy.med.yokohama-cu.ac.jp proxy port:8080 proxy type:HTTP Proxyの設定
- 27. • igvtoolsでbamファイルを染色体順にソートします。 コマンドメニューからsortを選択 Input fileからbam fileを選択 runボタンをクリック bam file.sorted.bamファイルが出力されます。 BAM fileのソート
- 28. • igvtoolsでインデックスを作成 コマンドメニューからIndexを選択 Input fileからbam file.sorted.bamを選択 runボタンをクリック indexの作成
- 29. TDFファイルの作成 • igvtoolsでインデックスを作成 コマンドメニューからCountを選択 Input fileからbam file.sorted.bamを選択 runボタンをクリック
- 30. fileメニュー Load from Fileから bam file.sorted.bam.tdfを選択してアップロード fileのupload
- 32. • GEOデータベースからSRA toolkitのprefetchでファイルを取得 • fastq-dumpでfastqに変換 • bowtie2でマッピング • samtoolsでsamファイルをbamファイルに変換 • IGVで表示 • 例題SRR493938：lung cancer RNA-seq paired end reads 宿題
- 33. • バイオインフォマティクスフォーラム https://163.212.171.228/bioinformaticsforum バイオインフォマティクス実習に関する質問、バイオインフォマティクス全般に関する質問など投稿し てください。 • 実習の資料について 「先端研 バイオインフォマティクス解析室」ホームページにslide shareのURLを掲載しています。 https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/section/support/bioinfomatics2.html 2018年度以前のパスワード：bijishu 2019年度のパスワード：実習後にお知らせします。 • アンケートにご協力ください。 「先端研 バイオインフォマティクス解析室」ホームページまたは ＱＲコードにアクセスし回答ください。 https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/section/support/bioinfomatics2.html お知らせ