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2019年第4回バイオインフォマティクス実習
- 2. ATAC-seqデータ解析 • bed formatピークファイルをUCSC genome browserにアップロード • ピーク領域の配列をTable Browserで取得 • MEME Suiteでピーク領域配列のモチーフ検索
- 3. カバー率 = (N × L) / G : 1塩基当りの断片数 リード数 : N リード数 : L ゲノム長 : G …AGGTGCATGCCGCATCGATCGAGC… AGGTGCATG GCATGCCGCAT GCATCGATCGAGC paired end single end ゲノム リード Next Generation Sequencer (NGS) DNAを断片化して配列を読む→参照ゲノムにマッピング→配列を再構成する カバー率が十分でないと正確な配列情報が得られない。
- 4. ChIP-seq
- 5. ATAC-seq Tn5 transposase insertion insertion sequence as a primer PCR amplification NGSmapped onto reference genome
- 8. Motif #1 GACAGAAAGGGCAAAGAGGAAGTGAAAGCTAAGAAGACT #2 GTCCCCTGAAAGTAAGAGGAAGTGAAAGCTGTCTGCTGG #3 TGCCAAACATGGAAAGGGGAAGTGAAAGAGACAGACGTA #4 GGTCTCATGGGAAAACAGGAAGTGAAAGCACAACTAAGA #5 TGGCCTGGCTGAAAGGGGGAAGTGAAAGCGAGGTGAACT #6 TCTTAACCTGACAAACAGGAAGTGAAAGTACCTTTCGGG specific sequence repeatedly observed in genome DNA ↓ functionally and biologically significant region ↓ motif
- 9. モチーフ解析 • 30億塩基対の配列から特定の配列を見つける • 総当り 計算時間 → 30億の2乗 不可能 • MEME Suiteを用いたモチーフ検索
- 11. Bed file format 染色体番号 スタートポジション エンドポジション ＩＤ 数値 ストランド chr1 191423 191584 EGFP1_peak_1 71 + chr1 629825 630062 EGFP1_peak_2 763 + chr1 633909 634155 EGFP1_peak_3 764 + ・・・ ピークの位置を記述するフォーマット
- 12. UCSC genome browser http://genome.ucsc.edu Genomes項目から該当する 参照ゲノムを選択する 今回はhg38 add custom tracksボタンをクリック
- 17. ピーク領域の配列を取得 group:Custom Tracks Tracks:User Track output format:sequence output file:ファイル名 get outputボタンを クリック
- 19. FASTA file format >配列名、説明など 配列 >hg38_ct_UserTrack_3545_EGFP1_peak_270 range=chr1:36306876-36307119 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none CGCGGAGGCCGCGCTGTGCGCGCCGCCGAGGTGAGCGCAAGGGCGGGGAC >hg38_ct_UserTrack_3545_EGFP1_peak_578 range=chr1:93847167-93847655 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none GCCTGGGCCTGCAACTCTGGGGTCCCGGCCGGGCTGGAGCGGCCGCCGGA
- 21. MEME Suite upload sequenceのファイルを選択をクリックして FASTAファイルを選択 Start Searchをクリック
- 23. MEME Suite MEME HTML outputをクリックして結果を表示
- 27. MEME Suite TOMTOM HTML outputをクリック
- 29. モンテカルロシミュレーションで円の面積を求める方法 面積=半径 ×半径 × 3.14 面積=(円内の点 / 点の総数)× 四角の面積 10cm 円の面積 10 cm
- 30. #1 GTAAAATCCGTCGTG #2 GTTGTTCCCAAAAGC #3 GTCTGTAAAAGGCTC #4 GAAAATTGCCTCCGT #1 AAAAAAAAAAAAAAA #2 AAAAAAAAAAAAAAA #3 AAAAAAAAAAAAAAA #4 AAAAAAAAAAAAAAA 配列“AAAA”の持つ情報量 #1 GTCACATCAGTCGTG #2 GTTGTTCACAGAAGC #3 GTCTGTACATGGCAC #4 GTAGATAGCCTCCGT 情報量+ 情報量なし 情報量なし
- 31. #1 GTAAGTACAGATAGCCACAG #2 GTATGTTCCCGATAAGTTTA #3 GTATGTTCATGTCTGATACT #4 GCATGATAGCTGCCCAAGTT #5 GTATGTTGACGATATTACTT #6 GTAAGTATCCAGATATTACT 問題 20 塩基 6 配列中に4塩基のモチーフ
- 32. Step 1 #1 GTAAGTACAGATAGCCACAG #2 GTATGTTCCCGATAAGTTTA #3 GTATGTTCATGTCTGATACT #4 GCATGATAGCTGCCCAAGTT #5 GTATGTTGACGATATTACTT #6 GTAAGTATCCAGATATTACT 配列を一つランダムに選択
- 33. Step 2 1 2 3 4 A G T A T C C C T G T C C C A A A T C C GTAAGTACAGATAGCCACAG GTATGTTCCCGATAAGTTTA GTATGTTCATGTCTGATACT GCATGATAGCTGCCCAAGTT GTAAGTATCCAGATATTACT #1 #2 #3 #4 #6 1 2 3 4 A 2 0 1 2 T 2 1 2 0 G 0 2 0 0 C 1 2 2 3 4塩基配列をランダムに選択
- 34. 1 2 3 4 A 0.4 0 0.2 0.4 T 0.4 0.2 0.4 0 G 0 0.4 0 0 C 0.2 0.4 0.4 0.6 塩基の確率 最初の塩基がAの確率 T G C 二番目の塩基がAの確率 T G C
- 35. Step 3 #5 GTATGTTGACGATATTACTT K i M j i ij p p F 1 1 2log4 最初に選んだ配列中の4塩基配列の確率 GTAT : -∞ TATG : -∞ … TGAC : 4log2(0.4/0.342)+4log2(0.4/0.208)+4log2(0.2/0.283)+4log2(0.6/0.167)=10.055 1 2 3 4 A 0.4 0 0.2 0.4 T 0.4 0.2 0.4 0 G 0 0.4 0 0 C 0.2 0.4 0.4 0.6 pi 34/120=0.283 41/120=0.342 25/120=0.208 20/120=0.167
- 36. position-specific scoring matrix (PSSMs) L j CGTA jCGTA P P 1 },,,{ },,,,{ 2logPSSMs pij : probability that jth bases is {A, T, G, C} pi : frequency of {A,T,G,C} 長さL の塩基配列の確率 L base motif 1 2 3 4 … L A G G C T
- 38. 1 2 3 4 A 0 0.8 0.4 0.8 T 0 0 0.6 0.2 G 0.6 0.2 0 0 C 0.4 0 0 0 GTAAGTACAGATAGCCACAG GTATGTTCCCGATAAGTTTA GTATGTTCATGTCTGATACT GCATGATAGCTGCCCAAGTT GTATGTTGACGATATTACTT GTAAGTATCCAGATATTACT #1 #2 #3 #4 #5 #6 pi 34/120=0.283 41/120=0.342 25/120=0.208 20/120=0.167 PSSM最大となる配列を選択
- 40. • 宿題 GEOデータベースからGSM4073848のデータを取得し、モチーフ 解析を行ってみてください • アンケートにご協力ください。 「先端研 バイオインフォマ ティクス解析室」ホームページまたはQRコードにアクセスし 回答してください。 https://www.yokohama- cu.ac.jp/amedrc/section/support/bioinfomatics2.html
Editor's Notes
- 次世代シーケンサーでは従来のシーケンサーと異なり、DNAを断片化して配列を読むのが特徴である。この断片の配列を参照とするゲノム上に割り当てて、元の塩基配列を再構成する。この作業をマッピングと呼ぶ。このとき問題となるのがカバー率である。断片の量と多様性が不十分だとゲノム全体をカバーすることができない。
- SOX4的遺伝子の中にclioquinolで発現が増加している遺伝子が観察され、それらの遺伝子のGO解析ではagingが有意にエンリッチされたGO termとして挙がっていた。clioquinolで発現が増加した遺伝子のプロモータ解析では、FOXO3の結合配列がエンリッチされていた。FOXO3は長寿に関連する遺伝子として良く知られている。ここではFOXO3に着目して、FOXO3のゲノム上における結合領域を調べた。ChIP-seqはゲノムDNA上の転写因子の結合をゲノムワイドに調べる方法である。DNAをクロスリンクした後に断片化し、目的とする転写因子の抗体で免疫沈降して転写因子結合領域のDNAを濃縮する。断片の配列を次世代シーケンサーで読み、転写因子結合領域をゲノムワイドに調べる。