1. Spektrofotometer
Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada besarnya nilai absorbsi suatu zat
terhadap radiasi sinar elektromagnetik. Prinsip kerja spektrofotometri adalah dengan menggunakan
spektrofotometer yang pada umumnya terdiri dari unsur-unsur seperti sumber cahaya, monokromator,
sel, fotosel, dan detektor.
Sumber radiasi spektrofotometer dapat digunakan lampu deuterium untuk radiasi di daerah sinar
ultraviolet sampai 350 nm, atau lampu filamen untuk sinar tampak sampai inframerah. Sinar yang
dikeluarkan sumber radiasi merupakan sinar polikromatis, sehingga harus dibuat menjadi sinar
monokromatis oleh monokromator. Radiasi yang melewati monokromator diteruskan ke zat yang akan
diukur dan sebagian radiasinya akan diserap oleh zat tersebut. Zat yang akan diukur nilai absorbannya
diletakkan pada sel dengan wadah kuvet. Sinar yang diteruskan akan mencapai fotosel dan energi sinar
diubah menjadi energi listrik.
Namun, nilai yang dihasilkan dari spektrofotometer bukanlah nilai absorban (A) melainkan transmitan
(T). Oleh karena itu nilai T tersebut harus dikonversi ke dalam nilai A zatyang diukur. Konversi
menggunakan rumus A= – log % T. Konversi ini dilakukan karena yang terukur adalah nilai transmitan
(besarnya sinar radiasi yang melewati zat dan ditangkap detektor), sedangkan yang diinginkan adalah
nilai absorban (besarnya sinar radiasi yang terserap oleh zat) dari zat yang diukur. berikut ini gambar
spektrofotometer :
Penentuan nilai absorban pada percobaan kali ini adalah untuk mengetahui kadar asam amino pada
sampel kentang. Penambahan ninhirin dan piridin sebagai pereaksinya, yang selanjutnya dilakukan
pemanasan. Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida
pada setiap ujungnya. Pemanasan asam amino dengan ninhidrin akan memberikan kompleks berwarna
ungu. Intensitas warna tersebut sebanding dengan konsentrasi asam amino bebas dalam pengukuran
absorban pada panjang gelombang yang paling tepat. Asam amino lisin mempunyai rantai cabang yang
dapat bermuatan positif maupun negatif, tergantung lingkungannya. Asam amino lisin juga mempunyai
rantai cabang gugus basa.

2. Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di dasarkan pada interaksi
antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau
pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang
dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun
medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai gelombang
2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi
dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.
Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis
maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi. Dari 4
jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu “adanya
interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya
terletak pada panjang gelombang yang digunakan.
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :
sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out (pembaca).

3. Fungsi masing-masing bagian:
1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam
rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer
UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen
VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang
berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat
ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.
Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik
berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai
cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.
Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi
hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel.
Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran
cahaya seperti yang tertera pada gambar.

4. 3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel
- UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa
atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini
disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada
spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.
- IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium
klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan
dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit
dan harganya mahal.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus
listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
Kepekaan yang tinggi
Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
Detektor foto (Photo detector)
Photocell, misalnya CdS.
Phototube
Hantaran foto
Dioda foto

5. Detektor panas
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari
detektor.
Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat,
maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang
memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu
materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi)
dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar
menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang
diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu
molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi
yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio. Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang
untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel
sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai
sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.
Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat
dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau
I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses
penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:

6. Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat bahwa zat sebelum
melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel
Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai
transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi:
“jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau
ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan”.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang
hamburkan:
dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:
dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati
sampel.

7. Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:
A= a . b . c atau A = ε . b . c
dimana:
A = absorbansi
b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).