Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TÌM HIỂU VỀ CÁC KỸ THUẬT ỨNG DỤNG TEST
NHANH TRÊN THỰC PHẨM
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN.Nguyễn Hoàng Mỹ
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Huỳnh Trung
MSSV: 107111199 Lớp: 07DSH3
TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ
1
Chương I : GIỚI THIỆU

2
1.1 Đặt vấn đề
Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng để cho chúng ta sống và tồn tại. Từ
ngàn xưa, con người đã biết sử dụng nguồn thức ăn của thiên nhiên để chế tạo ra
nhiều món ăn phong phú tạo thành nét văn hóa ẩm thực riêng biệt cho từng quốc gia
trên thế giới.
Ngày nay, với lối sống hiện đại hóa, công nghiệp hóa các món ăn dần dần đã
được chế biến theo quy mô công nghiệp để đáp ứng theo nhu cầu thị trường. Với sự
can thiệp của máy móc, nguồn thực phẩm đã dần mất đi tính tự nhiên đồng thời cũng
tạo ra nhiều hóa chất độc hại ảnh hưởng đến đời sống của xã hội.
Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nhức nhối trên toàn xã hội. Hằng năm đã
lấy đi không ít sinh mạng của nhiều người dân, làm ảnh hưởng sâu sắc đến cái nhìn
về ngành thực phẩm tại Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung.
Nhận thức được tầm quan trọng trong vấn đề an toàn thực phẩm, con người
đã có các chính sách nghiêm ngặt để bảo vệ sức khỏe của người dân. Với sự tiến bộ
của khoa học, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều phương pháp kiểm tra thực phẩm
khác nhau với độ chính xác và thời gian phát hiện ngày càng được cái thiện. Để tìm
hiểu rõ về phương pháp này, tôi thực hiện đề tài: “ Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng
dụng test nhanh ngộ độc thực phẩm”.
1.2 Mục đích khóa luận
Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm
1.3 Nội dung khóa luận
- Tổng quan về các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm.
- Các phương pháp truyền thống xác định vi sinh vật trong thực phẩm
- Các phương pháp hiện đại áp dụng vào các bộ Kit thực phẩm

3
Chương II : NGỘ ĐỘC
THỰC PHẨM

4
2.1Khái niệm
2.1.1 Chất độc
Chất độc là những chất vô cơ, hữu cơ nhiễm vào trong thức ăn được đưa vào
cơ thể với nồng độ nhất định gây ra ngộ độc, làm rối loạn các hoạt động sinh lý, sinh
hoá bình thường của cơ thể, và biểu hiện bằng những triệu chứng và bệnh lý khác
thường. Tuỳ theo loại chất độc, mức độ nhiễm độc, lứa tuổi và tình trạng sức khoẻ
của cơ thể mà triệu chứng ngộ độc nặng, gây tử vong hoặc nhẹ sau một thời gian dài
tích luỹ mới gây biểu hiện ngộ độc.
Chất độc được sinh ra từ nhiều nguồn gốc khác nhau từ tự nhiên hoặc do con
người. Do có thể là các sản phẩm trao đổi chất độc tố của nấm mốc, tảo, vi khuẩn, vi
nấm. Chúng có thể lẫn vào thức ăn do ô nhiễm môi trường hoặc cũng có thể do con
người vô tình hay cố ý cho thêm vào các nguyên liệu để bảo quản và tăng khẩu vị.
Nghiên cứu về chất độc thực chất đó là nghiên cứu về bản chất hoá học, cơ chế tác
động, phương pháp xác định để từ đó có những biện pháp kỹ thuật loại trừ và hạn
chế tác hại của nó tới cơ thể người và động vật.
2.1.2 Ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thực phẩm, có thể gây ra bởi
nhiều nguyên nhân. Có thể do ăn phải chất độc tiêu thụ một lượng lớn vi sinh vật
hoặc tiêu thụ sản phẩm có chứa độc tố.
2.1.3 Các trạng thái ngộ độc
Ngộ độc cấp tính: là trạng thái ngộ độc sau khi nhiễm chất độc một thời gian
ngắn,xuất hiện những triệu chứng khác thường rất nghiêm trọng hoặc gây ra tử vong
cho ngườivà động vật.
Ngộ độc tích lũy: (ngộ độc mãn tính) là trạng thái mà cơ thể nhiễm chất độc
với liều lượng thấp, chưa gây ra triệu chứng liền mà phải trải qua một thời gian dài
chất độc tích lũy trong cơ thể, làm biến đổi các quá trình sinh lý, sinh hóa lâu dài rồi
mới gây ra triệu chứng.

5
2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và Việt Nam
Ở các nước phát triển có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và nhiễm các
bệnh truyền qua thực phẩm mỗi năm. Ngộ độc thực phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số,
trung bình 175 ca trên 100.000 dân, mỗi năm chết 5.000 người; ở Anh: 190 ca trên
100.000 dân; ở Nhật là 20-40 ca trên 100.000 dân; ở Úc là 4,2 triệu ca/năm.
Tại Việt Nam,. theo báo cáo của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm thuộc Bộ Y
tế, tình hình ngộ độc thực phẩm trong năm 2010 diễn biến phức tạp, cả nước xảy ra
175 vụ ngộ độc (trong đó có 34 vụ ngộ độc hàng loạt trên 30 người) xảy ra tại 47
tỉnh/thành phố, làm 5.664 người mắc và 42 trường hợp tử vong. So với 2006-2009,
số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 9.1%, số mắc giảm 17.6% và số tử vong giảm
19.2%. Khu vực miền núi phía Bắc có số vụ ngộ độc cao nhất (32.6%), tiếp đến là
Tây Nguyên (12%), miền Trung (11.4), miền Đông Nam bộ (10.3%) và thấp nhất là
đồng bằng Bắc bộ (4.6%). Thời gian xảy ra ngộ độc thực phẩm cao nhất vào mùa hè
(tháng 5-9), chiếm trên 70% số ca mắc và tử vong do ngộ độc thực phẩm.
Thời gian qua Nhà nước đã ban hành rất nhiều văn bản luật, pháp lệnh và các
quy phạm pháp luật quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm, bên cạnh đó công tác
kiểm tra, giám sát đối với cơ sở sản xuất, kinh doanh, chế biến thực phẩm của các cơ
quan chức năng thường xuyên được tổ chức, nhưng tình trạng thực phẩm không an
toàn lưu hành trên thị trường vẫn còn rất nhiều và không thể kiểm soát dẫn đến hậu
quả nghiệm trọng cho đời sống nhân dân và xã hội.
2.3 Dấu hiệu và triệu chứng ngộ độc
Khi vừa ăn phải thực phẩm nhiễm độc, cảm giác khó chịu xuất hiện do mùi vị
thức ăn thay, không còn cảm giác hấp dẫn ngon miệng, độ ẩm, mềm của thực phẩm
cũng thay đổi.
Xuất hiện các triệu chứng ngộ độc sớm từ 1- 3 giờ sau khi ăn, chủ yếu là triệu
chứng tiêu hóa như buồn nôn, nôn, đau bụng vùng thượng vị từng cơn co thắt rồi đi
ngoài nhiều lần, lúc đầu có phân, sau phân ít nước nhiều. Các triệu chứng khác có
thể xuất hiện là: ngứa, mề đay, đau đầu, mệt mỏi.

6
Các triệu chứng trên có thể đỡ dần sau khi nôn và đi ngoài nhiều lần, nhưng
cũng có thể nặng lên gây ra suy sụp cơ thể do mất nước, mất điện giải, toan chuyển
hóa và rối loạn thân nhiệt (lạnh hạ nhiệt hay sốt cao, co giật).
Các xét nghiệm tìm độc chất: tốt nhất là xét nghiệm từ các mẫu thức ăn còn
lại hoặc từ các thức ăn mà người bệnh nôn ra. Các xét nghiệm máu, nước tiểu, phân
thường cho kết quả chậm và không chính xác.
Bảng 2.1 : Số lượng các vụ ngộ độc thực phẩm toàn quốc từ năm 2002 – 2010
Năm
Kết quả điều tra
Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người)
2002 218 4984 71
2003 238 6428 37
2004 145 3584 41
2005 144 4304 53
2006 165 7135 57
2007 247 7329 55
2008 204 7828 61
2009 151 5212 35
2010 175 5664 42
Trung bình/năm 202.2 ( 247 – 144) 5.525,1 (7828 –3584) 55.2 (71 – 35)
Tổng cộng 1.820 49.726 497
(Nguồn : Cục thống kê)

7
Chương III : NGUYÊN
NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC
THỰC PHẨM

8
3.1 Nguyên nhân
3.1.1 Chất độc có sẳn trong nguyên liệu làm thức ăn và trong quá trình
chế biến
Trong tự nhiên các loại thực vật cũng như một số loại động vật đặc biệt đều
có chứa một số lượng độc tố nhất định. Đó là những chất tích lũy, sản phẩm trung
gian trong quá trình trao đổi chất của chúng hoặc là những chất được sinh vật tổng
hợp. Ở thực vật, nhất là nhóm cây họ đậu có nhiều chất kháng dinh dưỡng nhằm hạn
chế khả năng phát triển của vi sinh vật. Nhiều loại thực vật có chứa nhóm chất
glucide độc, trong một số loại động vật có chứa những amit độc gây dị ứng rất mạnh
cho cơ thể.
3.1.2 Chất độc do thực phẩm bị biến chất trong quá trình bảo quản
Sự tồn trữ nguyên liệu trong kho lâu ngày, do tác động của oxy trong không
khí oxy hóa hoặc do enzyme trong thực phẩm tác động làm biến đổi các chất dinh
dưỡng trở thành các chất độc hay chất kháng dinh dưỡng.Ví dụ: các chất dầu thực
vật để lâu ngày trong không khí sẽ biến thành các peroxyt, aldehyt độc. Các axit
amin như histidine trong thịt cá tươi dưới tác động của enzyme decarboxylase khử
nhóm cacboxyl trở thành histamin độc gây dị ứng mạnh cho cơ thể. Một số vitamin
bi oxy hóa trở thành chất kháng vitamin.
3.1.3 Chất độc do nấm mốc sinh ra (mycotoxin)
Các loại thức ăn sau khi thu hoạch về không được làm khô và chế biến kịp
thời trước khi đem dự trữ trong kho. Nếu độ ẩm trên 14% rất dễ bị lên men hoặc
nấm mốc phát triển sinh ra độc tố. Tùy theo loại độc tố, tùy theo hàm hượng cao hay
thấp mà có thể gây ra độc cho người hay động vật.
3.1.4 Chất độc do vi khuẩn gây ra
Ngộ độc thức ăn do độc tố vi khuẩn thường xãy ra do thiếu sót trong công tác
kiểm tra. Thực phẩm có nguồn gốc động vật giàu protein như thịt sữa, trứng với tỉ lệ
nhiễm cao.

9
3.1.5 Các hoá chất độc hại lẫn vào thức ăn
Nguyên nhân gây ra sự ngộ độc thực phẩm hoặc không an toàn thực phẩm có
thể do các yếu tố sau đây: Cho thêm vào thức ăn để bảo quản, nhóm này bao gồm:
Các chất sát khuẩn, các chất chống nấm, các chất kháng sinh và các chất chống oxy
hoá...Các chất cho thêm vào thức ăn để tăng khẩu vị, hương liệu của thức ăn. Các
chất tẩy màu hoặc cho vào để thay đổi màu thực phẩm, làm cho dai hoặc xốp thực
phẩm. Các loại chất kích thích tố, hoặc các chất tăng đồng hóa, tăng giữ nước để cho
gia súc tăng trọng nhanh.Các chất gây ô nhiễm môi trường bao gồm kim loại nặng
của nhà máy thải ra hấp thụ vào cây thức ăn, thuốc trừ chuột, trừ sâu, trừ nấm và
virus nhiễm vào thực phẩm
3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính độc lực
3.2.1 Liều lượng chất độc
Có nhiều chất ở liều thấp thì là yếu tố dinh dưỡng, nhưng ở liều cao thì gây ra
ngộ độc. Ví dụ: như các nguyên tố vi lượng…
3.2.2 Yếu tố giống, loài động vật
Cùng một loại độc tố, cùng một liều lượng nhiễm nhưng có gia súc có triệu
chứng trúng độc nhưng có loại lại không. Ví dụ: với tỷ lệ 10% bột lá keo dậu thì ở
gà có hiện tượng bướu cổ, rụng lông nhưng ở gia súc nhai lại với mức trên 30%
trong khẩu phần thì mới có triệu chứng ngộ độc. Hay cùng một tỷ lệ aflatoxin trong
thức ăn thì vịt có biểu hiện ngộ độc trước gà.
3.2.3 Lứa tuổi của động vật
Động vật non nói chung hệ thống đề kháng, hệ thống khử độc và thải độc tố
ra ngoài của cơ thể phát triển chưa hoàn thiện, do đó sức đề kháng với độc tố của cơ
thể gia súc non cũng yếu hơn gia súc trưởng thành. Ngược lại, cơ thể già yếu sự trao
đổi chất cũng giảm xuống, sức đề kháng đối với độc tố cũng giảm.
3.2.4 Giới tính
Ảnh hưởng của độc tố trên giới tính cũng chỉ là khái niệm tương đối. Ở trạng
thái bình thường thì không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 2 loại giới tính trên lĩnh

10
vực đề kháng với độc tố. Tuy nhiên khi gia súc mang thai, sinh sản hoặc nuôi con thì
rất mẫn cảm với độc tố. Ví dụ: độc tố nấm aflatoxin có thể gây chết phôi tỷ lệ cao;
độc tố zearalenone (F2, có trong ngô) do nấm Furarium tiết ra có thể gây ra sẩy thai.
Vì vậy, trong thời gian mang thai cần phải có chế độ ăn kỹ lưỡng hơn bình thường.
3.2.5 Tình trạng sức khỏe và chế độ dinh dưỡng
Sức khỏe cơ thể có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng đề kháng đối với độc tố.
Ví dụ: khi cơ thể bị bệnh viêm gan hoặc viêm thận do nguyên nhân khác không phải
độc tố thì khả năng loại bỏ độc tố của cơ thể rất kém. Vì vậy cũng với một liều
lượng giống nhau, nhưng cơ thể khỏe mạnh có thể vượt qua được. Khẩu phần ăn và
chế độ dinh dưỡng của động vật cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức đề kháng của cơ thể
đối với độc chất.
Ví dụ: khi khẩu phần ăn thiếu cholin hoặcmethiomine sẽ gây ra hiện tượng
tích mỡ gan làm cho chức năng của gan trở nên suy giảm, từ đó đề kháng với độc tố
cũng sẽ kém. Hoặc khẩu phần mất cân bằng giữa năng lượng và chất đạm, quá dư
thừa chất đạm có nguồn gốc động vật, có chứa nhiều chất hữu cơ purine và
pirimidine mà lại thiếu vitamin A sẽ có nguy cơ phát sinh ra bệnh “gout” là chứng
bệnh tích urat trong cơ thể, trong bể thận làm cho chức năng lọc và loại thải chất độc
của cơ thể suy yếu. Từ đó có thể làm cho tình trạng ngộ độc trở nên nặng nề hơn.
3.2.6 Trạng thái vật lý của chất độc
Cùng một loại chất độc, cùng một liều lượng, nhưng chất độc ở trạng thái hoà
tan được trong nước thì sẽ gây ra triệu chứng ngộ độc nhanh hơn, nhưng nó loại thải
ra ngoài cũng nhanh hơn. Ngược lại, ở trạng thái nhũ dầu hoặc ở dạng bột không tan
thì chất độ chấp thu chậm nên gây ra triệu chứng ngộ độc muộn hơn, nhưng loại thải
chất độc ra khỏi cơ thể cũng chậm hơn.
3.3 Các vi sinh vật có thể gây ngộ độc thực phẩm
3.3.1 Salmonella
Số lượng Salmonella đủ để gây ngộ độc là khi chúng hiện diện cả triệu tế bào
trong một gam thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu

11
chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng biểu hiện
thường sau 12 giờ đến 36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Triệu chứng
thường kéo dài ít nhất từ 2 đến 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ
thực phẩm bị nhiễm Salmonella điều có biểu hiện bệnh, ngược lại một số người
không có triệu chứng lâm sàng khi tiêu thụ phải thực phẩm nhiễm vi sinh vật này khi
đó chúng bài tiết ra ngoài.
Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella như thịt gia cầm, sản
phẩm thịt, trứng và các sản phẩm của trứng, thủy sản. Nguồn nhiễm vi sinh vật vào
các loại thực phẩm thường có nguồn gốc từ đường ruột của người và các loài động
vật, chúng có thể được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Salmonella gây nên bệnh sốt
thương hàn thuốc các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C các
dòng này thường không gây bệnh cho các loài động vật.
3.3.2 Campylobacter
Đây là vi sinh vật gây nên bệnh nhiễm đường ruột, bằng các phương pháp
phân lập đã chứng minh vi sinh vật này hiện diện khắp nơi. Campylobacter là một
trong những hệ vi vật của nhiều loại động vật và chim. Nhưng các dòng có khả năng
gây ngộ độc thực phẩm không thể phát triển khi nhiệt độ thấp hơn 30o
C, đây là vi
sinh vật ưa nhiệt bắt buộc.
Sản phẩm sữa và thịt gia cầm là những nguồn có thể gây nên ngộ độc do vi
sinh vật này. Nước cũng là một trong những nguồn mang bệnh này. Campylobacter
là vi sinh vật rất nhạy với nhiệt độ, chúng bị tiêu diệt hoàn toàn bằng phương pháp
thanh trùng Pasteur, chúng không thể sống sót trong thực phẩm có môi trường acid.
Chúng không thể phát triển trong thực phẩm bảo quản trong điều kiện hiếu khí mà
chỉ phát triển trong các loại thực phẩm hút chân không.
Khi nhiễm Campylobacter , thời gian ủ bệnh thường từ 2 đến 11 ngày. Các
triệu chứng do vi sinh vật này gân nên như đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó
chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sản, thỉnh thoảng có những biểu hiện giống như cảm
cúm.

12
3.3.3 Clostridium perfringens
Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây ra đã có
những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây cho
rằng các dòng Clostridium perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan
máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm. Nhưng trong những năm gần đây các dòng
này nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ
độc do vi sinh vật này gây nên.
Clostridium perfringens có khả năng sinh bào tử kháng nhiệt nên chúng
thường sống sót qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp
xúc với nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nẩy
mầm và nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm
cho các dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản.
Các nguồn thực phẩm có thể gây ngộ độc với các vi sinh vật này thường là thịt gia
cầm, nhất là các loại gia cầm lớn đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa.
Clostridium perfringens cũng được tìm thấy trong đất, trong phân người và trong
các loại thực phẩm khác. Các triệu chứng do vi sinh vật này gây ra thường là đau
thắt vùng bụng, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh từ 12 giờ đến 24 giờ..
3.3.4 Clostridium botulinum
Đây là vi sinh vật phân bố khắp nơi trong đất, trong nước và trong các gia
súc, các loài thủy sản. Vi sinh vật này sinh độc tố gây bệnh ngộ độc thịt cho người.
Bệnh biểu hiện rất nghiệm trọng ở người. Bệnh gây ra do độc tố được hình thành bởi
Clostridium botulinum nhiễm trong thực phẩm. Triệu chứng lâm sàng của bệnh là ói
mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối
loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt, có
thể dẫn đến tử vong. Các triệu chứng trên biểu hiện sau 12 giờ đến 36 giờ sau khi
tiêu thụ thực phẩm nhiễm độc tố. Các triệu chứng thường kéo dài 2 đến 6 ngày tùy
theo tình trạng nhiễm độc và sức khỏe của từng bệnh nhân.

13
Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định lây
nhiễm từ đất, phân động vật hay do chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các
sản phẩm đóng hộp không đúng qui cách cũng có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này rất
cao. Điều kiện thích hợp cho việc hình thành độc tố của vi sinh vật này là điều kiện
môi trường kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh vật khác cạnh tranh. Độc tố
botuline do Clostridium botulinum tiết ra gồm một số loại khác nhau như A, B, C1,
C2, D, E, F, G. Các độc tố này là những protein có trọng lượng phân tử lớn khoảng
1 triệu danton. Nhưng những dạng có tác động mạnh đến con người là A,B và E.
Đây cũng là một trong những loại độc tố sinh học có cường độ mạnh nhất. Trong
những năm gần đây, các vụ ngộ độc botuline gây ra do Clostridium botulinum dòng
E thường được phát hiện khi tiêu thụ cá và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật
này thường xuyên được phân lập từ các mẫu bùn từ các đáy sông.
3.3.5 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi sinh vật có khả năng sản sinh một số loại độc tố
đường ruột bền nhiệt, không bị phân hủy khi đun ở 100o
C trong khoảng 30 phút. Khi
vi sinh vật này lây nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết ra độc tố vào trong sản
phẩm và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phảm có chứa độc tố này, sau 4
giờ đến 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, buồn nôn
và ói mửa, các triệu chứng này thường kéo dài từ 6 giờ đến 8 giờ.
Các loại thực phẩm có chứa hàm lượng muối cao thường có nguy cơ nhiễm vi
sinh vật này như jambon, kem tổng hợp, nước soup…vì các loại thực phẩm này ít
khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40o
C. Các loại thủy sản hay thực phẩm đóng hộp
cũng thường hay bị nhiễm loài vi sinh vật này. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm
chủ yếu từ các khâu chế biến trong nhà bếp. Trong tự nhiên các vi sinh vật này
thường tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng.
3.3.6 Vibrio spp.
Các loài Virio có nguồn gốc từ biển, chúng cần ion Na+
để phát triển. Giống
Vibrio có một số loài có khả năng gây bệnh cho người như V.cholerae,

14
V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.holliase, V.furnsii, V.mimicus, V.fluvialis,
V.alginolyticus.
V. cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới. Loài vi sinh
vật này được chia thành hai kiểu huyết thanh chính đó là O1 và non-O1, kiểu huyết
thanh O1 bao gồm ba kiểu huyết thanh phụ như sau : Ogawa, Inaba (hai kiểu này
được gọi chung là kiểu cổ điển – Classic) và kiểu Eltor (kiểu Eltor còn được gọi là
kiểu O139). Hai kiểu huyết thanh Inaba và Ogawa ngày nay chỉ còn được tìm thấy
tại các nước thuộc khu vực châu Á. Trong khi đó các vụ dịch tả trên khắp thế giới
gây ra do kiểu Eltor. Khi có các trận dịch do V.cholerae gây ra thường lan truyền rất
nhanh qua con người và dịch bệnh ngày càng thêm nghiêm trọng. Vi sinh vật ngày
sản sinh độc tố cholaratoxin, đây là độc tố đường ruột có cường độ mạnh, chỉ cần 5
µg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành. Một
số độc tố khác cũng được vi sinh này tiết ra như hemolysine có độc tính tương tự
tetrodotoxin (độc tố cá nóc) hay độc tố tương tự shiga-toxin.
Các loại thực phẩm có thể lan truyền V.cholerae như nước uống, nước trái
cây, rau quả, sữa và các loại sản phẩm sữa, thậm chí bia cũng có khả năng nhiễm vi
sinh vật này. Các loại sản phẩm thủy sản tươi sống, không qua gia nhiệt, gia nhiệt
nhẹ hay do sự nhiễm chéo sau khi gia nhiệt cũng được khuyến cáo là có nguy cơ
mang V.cholerae khá nghiêm trọng.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây
nên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tư như loài trên. Dĩ nhiên tùy
từng loài và liều lượng mà có những biển hiện bệnh nặng nhẹ khác nhau. Chỉ riêng
loài V.vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột mà chúng gây nhiệm
trùng máu cho người.
3.3.7 Escherichia coli
E. coli là vi sinh vật hiếu khí phổ biến trong đường tiêu hóa của người và các
loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli tồn tại một cách tự nhiên và không
gây hại trong đường tiêu hóa, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong

15
việc ổn định sinh lý đường tiêu hóa. Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây
bệnh cho người và một số loài động vật :
Enterobathogenic E.coli (EPEC)
Enterotocigenic E.coli (ETEC)
Enteroinvasive E.coli (EIEC)
Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)
Rõ ràng E.coli có thể phân lập được dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường có
thể bị ô nhiễm phân hay chất thải. Vi sinh vật này có thể phát triển và tồn tại rất lâu
trong môi trường. Trong những ngăm gần đây các nhà nghiên cứu cũng chứng minh
rằng E.coli cũng có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm
hữu cơ. Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E.coli cũng dễ dàng phân lập được từ các
mẫu thực phẩm do nhiễm vào từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước.
Các dòng E.coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường
thực phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu háo, các biểu hiện lâm sàng
biến động có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người phụ
thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người.
3.3.8 Shigella
Giống Shigella cũng là một thành viên của họ vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriacae, chúng gồm có 4 loài sau : S.dysenteriae, S.plexneri, S.boydii,
S.sonnei. Đây là giống vi sinh vật có tế bào chủ đặc hiệu , chúng chỉ thích nghi à
phát triển trong tế bào chủ là người và các loại linh trưởng. Sự hiện diện của chúng
trong môi trường là do sự nhiễm phân của người và các loài mang sinh vật này.
Shigella có thể tồn tại hơn 6 tháng trong môi trường nước. Các vụ ngộ độc thực
phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở các nước kém phát triển, chế biến thực
phẩm trong điều kiện kém vệ sinh. Bệnh cũng có thể truyền tực tiếp từ người qua
người.
Shigella chủ yếu gây nên các bệnh lị trực trùng. Thời gian ủ bệnh sau khi tiêu
thụ thực phẩm bị nhiễm là 1 đến 7 ngày. Các biểu hiện triệu chứng bệnh có thể nhẹ,

16
biễu hiện không rõ, chỉ thoáng qua như tiêu chảy nhẹ, nhưng đôi khi cũng có những
biểu hiện nghiêm trọng như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc ruột, mất
nước, sốt cao và bị co rút thành bụng. Các triệu chứng trên có thể kéo dài 12 đến 24
ngày hay lâu hơn. Đối với người lớn, các trường hợp tử vong do Shigella hiếm khi
diễn ra, nhưng bệnh biểu hiện rất nghiêm trọng đối với trẻ em và người già. Hằng
năm có khoảng nửa triệu người tử vong do vi sinh vật gây ra trên khắp thế giới.
Sự lây nhiễm vi khuẩn Shigella chủ yếu là đường miệng. Nước là một môi
trường truyền bệnh quan trọng, đặc biệt ở những nơi kém vệ sinh. Tuy nhiên các loại
thực phẩm cũng là nguyên nhân gây nên các bệnh do Shigella . Vi sinh vật này
nhiễm vào thực phẩm qua nguyên liệu hay quá trình chế biến. Đôi khi nhiễm bệnh
do vệ sinh cá nhân kém.
3.3.9 Listeria monocytogenes
Trong những năm gần đây Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân
gây bệnh nguy hiểm. Đối tượng gây bệnh của vi sinh vật này là trẻ em, phụ nữ mang
thai hay những người già. Đối với những vi sinh vật gây bệnh ngộ độc thực phẩm
khác, chúng bộc phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh
các triệu chứng lâm sàng biểu hiện. Ngược lại Listeria monocytogenes hiện diện với
một số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại và chờ cơ
hội. Khi có điều kiện thuận lợi, chúng nhân lên xâm nhiễm vào các mô sâu và gây
bệnh. Các bệnh do vi sinh vật này gây nên bắt đầu từ đường tiêu hóa như tiêu chảy,
sốt nhẹ. Sau đó chúng xâm nhiễm vào các đại thực bào gây nên bệnh nhiễm trùng
máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim mắt, và có thể xâm nhập vào bào thai
gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi.
Listeria monocytogenes thuộc loại vi sinh vật ưa lạnh, chúng có thể phát triển
ở nhiệt độ từ 2 đến 44o
C. Chúng thường được phân lập từ các loại thực phẩm như
phomat sữa, thịt cá rau quả và thậm chí phân lập được từ trong nước mặn. Trong tất
cả các công đoạn chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả đều có khả năng xâm chiếm
vi sinh vật này. Đặt biệt trong công đoạn bảo quản các sản phẩm ở nhiệt độ thấp, vi

17
sinh vật này có cơ hội phát triển thành số lượng lớn. Các sản phẩm thanh trùng
Pasteur và được bảo quản ở nhiệt độ thấp trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh
vật này rất cao.
Salmonella E.coli
Staphylococcus Shigella
Vibrio Campylobacter

18
Clostridium Listeria
Flavobacterium Alcaligenes
Pseudomonas fluorescens Aspergillus Flavus
Hình 3.1 : Một số loại vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm
(Nguồn :Nguyễn Tiến Dũng,2008)

19
3.3.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm
Các đợt dịch bệnh gây ra từ thực phẩm do tác nhân virus cho đến nay vẫn là
vấn đề bí ẩn. Nhưng một số tác giả vẫn tin rằng virus trong thực phẩm là tác nhân
gây nên các bệnh hiễm nghèo. Những tiến bộ trong các nghiên cứu về virus thực
phẩm vẫn còn hạn chế. Cho đến nay các đặc điểm sinh lý của virus đường ruột vẫn
còn biết rất hạn chế. Cho đến nay các phương pháp nuôi cấy để phát hiện virus trong
thực phẩm cho đến nay vẫn chưa thể thực hiện được. Nhưng với các tiến bộ về kỹ
thuật sinh học phân tử như kỹ thuật lai phân tử, kỹ thuât PCR có thể phát hiện được
các virus có hại cho con người trong thực phẩm.
Sự lan truyền virus cho người qua còn đường thực phẩm được biết đến từ
những năm 1950. Các virus gây bệnh đường ruột cho con người chủ yếu có nguồn
gốc từ các sản phẩm thủy sản. Cho đến nay được biết có khoảng hơn 100 loại virus
đường ruột. Nhưng chỉ một vài loài trong số đó có khả năng gây bệnh cho người.
theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có thể gây nguy hiểm cho người.
Bao gồm :Hepatitis type A (HAV), Virus Norwalk, Calicivirus, Astrovirus.
Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, chúng không thể
tự nhân lên trong nước hay trong các sản phẩm thực phẩm cho dù ở bất kỳ điệu hiện
hóa lý như thế nào. Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế
biến, từ nước bị ô nhiễm. Các loài nhuyễn thể ăn lọc có khả năng tích lũy nhiều
virus trong nước. Hằng ngày một con nhuyễn thể có thể lọc 1500 lít nước, theo đó
một số lượng lớn virus có thể vào cơ thể của con vật này và tích lũy tại đó. Vì thế
mật độ virus trong cơ thể nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước
chúng đang sinh sống.
Liều lượng gây bệnh của virus có thể thấp hơn nhiều so với vi khuẩn khi con
người tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Liều lượng gây nhiễm tối thiểu của một số loài
virus đường ruột tương đương với số lượng hiện diện trong thực phẩm mà các phòng
thí nghiệm có thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy.

20
Cơ thể người và các loài động vật là nguồn chứa các virus đường ruột. Virus
được tìm thấy với số lượng lớn trong phân của những người bị nhiễm và tồn tại
trong nhiều ngày đến nhiều tuần. Sự nhiễm phân vào trong thực phẳm bằng con
đường gián tiếp hay trực tiếp là con đường xâm nhiễm virus vào thực phẩm.
Sự sống sót của virus trong môi trường hay trong thực phẩm phụ thuộc vào
yếu tố như nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ bức xạ mặt trời hay sự hiện diện của
các thành phần hữu cơ khác. Virus đường ruột cũng có khả năng tồn tại nhiều tháng
trong nước biển ở nhiệt độ <10o
C thậm chí có thể lâu hơn. Vì thế đây cũng là nhân
tố chỉ thị ô nhiễm phân. Tất cả các virus đường ruột đều kháng với acid, các enzyme
thủy giải, hay muối mật có trong đường tiêu hóa. Một số virus có thể kháng nhiệt
như Hepatits type A, một số khác có thể kháng với các chất tẩy uế như phenolic,
ethanol…Ozon và chlorine là những tác nhân có thể làm bất hoạt một vài virus
đường ruột.
Để ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu
chín, khử virus trước khi tiêu thụ, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai thác
trong những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch
trước khi tiêu thụ.
3.3.11 Coliforms
Coliforms và Feacal coliform đượx xem là vi sinh vật chỉ thị, bởi vì số lượng
của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật
gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliforms
cao trong thực phẩm thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất
lớn. Tuy vậy mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn
đang được tranh cải về khoa học. Theo định nghĩa, nhóm Coliforms bao gồm cả
những vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi, có Gram âm, không sinh bào tử, có
hình que, lên men đường lactos và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng.
Căn cứ vào nhiệt độ vi sinh vật có thể phát triển để chia nhóm Coliforms
thành hai nhóm. Nhóm Coliforms có nguồn gốc từ phân của các loài độc vật, nhóm

21
này được gọi là Coliforms phân và nhóm không có nguồn gốc từ phân của các loài
động vật. Trên thực tế, các phương pháp kiểm nghiệm chỉ xác định Coliforms phân
là xác định nhóm Coliforms có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng
bao gồm các giống như Escherichia : Klebsiella và Enterobater. Một câu hỏi được
đặt ra là có phải tất cả các thành viên của nhóm Coliform phân có ý nghĩa chỉ thị vệ
sinh như nhau hay không ? Cho đến nay vấn đề này vẫn còn đang được bàn luận, tuy
nhiên trong các thành viên của nhóm này thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều
nhất của vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm.
Bảng 3.1 : Các loại bệnh và các biểu hiện lâm sàng do VSV trong thực phẩm gây ra.
Thời
gian ủ
bệnh
Vi sinh vật Nôn
mửa
Tiêu
chảy
Đau
thắt
Sốt Thời
gian kéo
dài
Thực phẩm
thường gặp
30 phút –
4 giờ
B.cereus +++ (+) (+) - Ngắn Gạo
8-12 giờ B.cereus - ++ ++ - 1-2 ngày Soup, sữa
4-6 giờ S.aureus ++ + ++ - 6-12 giờ Thịt lạnh, sữa,
salad, kem,
trứng…
8-22 giờ C.perfringens - ++ ++ - 12-24 giờ Thịt qua gia
nhiệt
8-48 giờ V.paraheamolyt
icus
- +++ - + 2-3 ngày Hải sản
12-48 giờ Salmonella (+) ++ - + 2-7 ngày Gia cầm, thịt,
trứng
24-72 giờ C.botulinum - - - - 3 ngày Rau quả, thịt
2-11 ngày Campylobacter - +++ +++ ++ 3 – 21
ngày
Sữa, nước
uống, thịt, cá
(Nguồn : Nguyễn Tiến Dũng,2008)

22
3.4 Sự phát triển vi sinh vật trong thực phẩm
Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích
đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương
pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa là vi
sinh vật được nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay
đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng
giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian nuôi
cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể
vẽ được đường cong sinh trưởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi.
Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau.
Hình 3.2 : Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín
( Nguồn : Prescott và ctv, 2007)
Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) : Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên
quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tính chất
hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thì giai đoạn tiềm
phát sẽ kéo dài
Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) :
Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản
tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp
độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân
đôi một cách đều đặn

23
Giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân Bằng : Giai đoạn Ổn
định (Stationary Phase) hay Pha Cân bằng : Trong giai đoạn này số lượng tế bào
sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng
tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi
chất.
Giai đoạn tử vong (Death Phase) : Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc
tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trường sống của vi sinh vật,
làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong.
3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm
3.5.1 Yếu tố nội sinh
* Độ ẩm
Tỉ lệ nước trong tế bào vi sinh vật khá cao 75 đến 85% đối với vi khuẩn, 78
đến 82% đối với nấm men, 84 đến 90% đối với nấm mốc. Chính vì vậy, nếu thiếu
hụt hoặc dư thừa quá nhiều nước sẽ làm cho vi sinh vật không thể tồn tại và phát
triển được.
Nếu môi trường thiếu nước ( đặc biệt là nước tự do ) nước sẽ loại khỏi tế bào
vi sinh vật dẫn tới hiện tượng co nguyên sinh và làm cho tế bào chết. Sức đề kháng
vi sinh vật ở trạng thái khô đều khác nhau, trong đó xạ khuẩn có sức đề kháng cao
nhất sau đó là vi khuẩn và cuối cùng là nấm mốc. Ngoài ra, sức đề kháng của bào tử
cao hơn sức đề kháng của tế bào sinh dưỡng. Vì vậy, độ ẩm môi trường là một yếu
tố rất quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật trong thực
phẩm
Nồng độ muối, đường và các chất hòa tan khác trong thực phẩm đều ảnh
hưởng đến aW . Nếu nồng độ muối từ 3 đến 5% sẽ làm chậm sự phát triển của vi sinh
vật trong thực phẩm, từ 10 đến 12% thì sẽ làm mọi hoạt động của vi sinh vật ngưng
lại. Nếu nồng độ đường từ 60 đến 70% sẽ hạn chế hoạt động của vi sinh vật. Tuy
nhiên, các loài nấm mốc vẫn có thể phát triển ở nồng độ đường khoản 80 đến 90%.

24
* pH
Tác động pH của nguyên liệu lên tế bào vi sinh vật chủ yếu vào hai hướng :
Tác động lên hoạt tính enzyme trên thành tế bào của vi sinh vật đồng thời
cũng tác động lên tính thấm của màng tế bào vi sinh vật
Mỗi loài vi sinh vật đều có một giới hạn pH nhất định
 Nhóm ưa axit :pHopt = 3
 Nhóm ưa trung tính : pHopt = 7
 Nhóm ưa kiềm : pHopt = 9 – 10
Bảng 3.2 : Khoảng pH của các nhóm vi sinh vật
Vi sinh vật pH pH tối ưu
Vi khuẩn 4 - 8 6-7
Pseudomonas aeruginosa 5,6 - 8 6
Bacillus stearothermophilus 5,2 - 9,2 6
Clostridium sporogenes 5 - 9 6,5
Bacillus cereus 4,9 - 9,3 6,5
Salmonella 4 - 9,6 5
Escherichia coli 4,4 - 9 5
Lactobacillus spec 3,8 - 7,2 4-5
Nấm men 4 - 8 4-5
Saccharomyces cerevisiae 2,3 - 8 4,5
Nấm mốc 2 - 10 4-6
Penicillium italicum 1,9 - 9,3 5
Aspergillus oryzae 1,6 - 9,3 5
(Nguồn :Lương Đức Phẩm,2001)
pH ở hầu hết trong tế bào vi sinh vật đều được duy trình bằng 7. Vì vậy, khi
tế bào được đặt trong môi trường tối ưu sẽ tạo điều kiện tốt nhất cho vi sinh vật và
nấm phát triển. Khi tế bào được đặt trong môi trường quá cao (dư kiềm) hoặc quá
thấp (dư axit) sẽ làm cho mọi hoạt động của tế bào ngưng trệ hoặc ngừng phát triển.

25
* Oxy
Các vi sinh vật sẽ thay đổi nhu cầu và phản ứng của chúng đối với oxy và khi
có sự hiện diện của oxy trong môi trường. Môi trường có sự hiện diện của oxy là
môi trường hiếu khí, không có oxy là môi trường kỵ khí. Các nhóm vi sinh vật sau
được phân lập theo từng loại đối với sự hiện diện của oxy trong môi trường:
Vi sinh vật hiếu khí bắt buộc: những vi sinh vật này cần oxy.
Hiếu khí bắt buộc có giới hạn: giống như hiếu khí bắt buộc sinh vật cần oxy
cho sự sống nhưng không thể phát triển ở nồng độ oxy là 20%.
Vi sinh vật kỵ khí tùy ý: những vi sinh vật này có thể phát triển được trên môi
trường có hoặc không có oxy.
Vi sinh vật kỵ khí bắt buộc: các vi sinh vật loại này sẽ chỉ phát triển trong
môi trường không có oxy và giải phóng năng lượng qua con đường lên men.
Vi sinh vật độc lập với oxy: hầu hết vi khuẩn lên men lactic có thể phát triển
trong môi trường có hay không có oxy nhưng vẫn sản xuất ra một lượng chất trung
gian và năng lượng, và vì vậy chúng được gọi là độc lập với oxy.
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của oxy đến sự sinh trưởng của vi khuẩn
(Nguồn : Lương Đức Phẩm, 2001)
* Thành phần hóa học thực phẩm
Để phát triển bình thường vi sinh vật cần một số yếu tố dinh dưỡng trong
thực phẩm như: nước, nguồn năng lượng, nguồn nitơ, vitamin và muối khoáng... Vi

26
sinh vật có sự ưa thích khác nhau đối với các loại thực phẩm khác nhau. Nấm mốc
có nhu cầu dinh dưỡng ít nhất, tiếp đó là nấm men, vi khuẩn gram âm, sau cùng là vi
khuẩn gram dương.
Từ những yếu tố trên người ta phân loại thực phẩm ra làm 2 loại:
Vi sinh vật thích (thực phẩm dễ hư): đạm ở hàm lượng cao, ít axit, đường và
chất béo ở hàm lượng thấp, nước.
Vi sinh vật kỵ (thực phẩm khó hư): đường, muối, mỡ chiếm tỷ lệ cao, cồn,
hóa chất diệt khuẩn (thuốc trừ sâu, kháng sinh... ở dạng dư lượng). Nhìn chung là
các thực phẩm quá ngọt, quá mặn, quá chua, quá khô.
3.5.2 Yếu tố ngoại sinh
* Nhiệt độ môi trường
Mỗi một vi sinh vật có khả năng phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất
định. Ngoài khoảng nhiệt độ đó ra vi sinh vật sẽ bị ức chế.
Theo quan hệ của vi sinh vật với nhiệt độ người ta phân vi sinh vật ra làm ba
nhóm:
 Nhóm ưa nóng (Thermophiles)
 Nhóm ưa ấm (Mesophiles)
 Nhóm ưa lạnh (Psychrophiles). Trong nhóm ưa lạnh lại được chia thành
hai nhóm nhỏ là nhóm ưa lạnh bắt buộc và nhóm ưa lạnh không bắt buộc
Hình 3.4: Phạm vi nhiệt độ sinh trưởng của vi sinh vật
(Nguồn : Prescott và ctv, 2007)

27
Nhiệt độ thường gây cho vi sinh vật những chiều hướng sau:
Đối với nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó tác động
lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm ức chế hoạt động của enzyme làm thay
đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm cho vi sinh vật mất khả năng phát
triển và sinh sản
Đối với nhiệt độ cao: thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng. Đa
số vi sinh vật chết ở nhiệt độ 60 – 80o
C. Một số chết ở nhiệt độ cao hơn. Đặc biệt
bào tử của vi sinh vật có thể tồn tại ở nhiệt độ lớn hơn 100o
C.
* Độ ẩm không khí
Độ ẩm không khí có ảnh hưởng đến hoạt độ của nước aw trong thực phẩm
theo định luật Raoult. Vì vậy độ ẩm không khí có ảnh hưởng đến sự phát triển của
các hệ vi sinh vật trên thực phẩm.
Hơi nước trong không khí và nước hoạt động trong thực phẩm có khuynh
hướng di chuyển qua lại để đạt đến sự cân bằng trên.
* Ánh sáng
Ánh sáng mặt trời có tác dụng trực tiếp đối với đại đa số vi sinh vật. Ánh
sáng trực tiếp tiêu diệt vi sinh vật sau vài phút hay vài giờ. Ánh sáng khuếch tán ức
chế một số vi sinh vật, nó chỉ gây chết khi tác dụng kéo dài. Các loài vi sinh vật
khác nhau chịu tác dụng của ánh sáng khác nhau. Vi khuẩn gây bệnh nhạy cảm với
ánh sáng: trực khuẩn lao chết sau 20 – 30 phút ngoài ánh sáng.
Phần có tác dụng mạnh với vi sinh vật là tia tử ngoại. Tất cả các tia tử ngoại
có bước sóng 2000 – 3000 Ao
đều có tác dụng sát trùng, nhưng có hiệu quả nhất là
bước sóng 2650 – 2660 Ao
. Tia tử ngoại có tác dụng làm phân hủy một số chất hữu
cơ trong tế bào, làm đông tụ protit, làm mất hoạt tính enzyme phá hủy tế bào vi sinh
vật. Tuy nhiên với một lượng nào đó tia này có thể tác dụng lên bộ gen làm ảnh
hưởng đến tính di truyền và gây biến đổi.

28
Bào tử của vi khuẩn, nấm cũng bị tiêu diệt bởi tia tử ngoại nhưng sức chịu
đựng của bào tử cao hơn. Muốn tiêu diệt bào tử phải tăng liều lượng lên gấp 4 – 5
lần so với thể sinh dưỡng.
Tia hồng ngoại ít có tác dụng với vi sinh vật, chỉ làm tăng nhiệt độ môi
trường và thường dùng để sấy khô sản phẩm.
* Siêu âm
Siêu âm được tạo thành do những dao động có tần số cao trên 200000 dao
động/giây (héc), siêu âm tác dụng mạnh lên tế bào vi sinh vật. Nhiều vi sinh vật bị
chết chỉ sau khi bị tác dụng của siêu âm trong 1 phút. Siêu âm gây nên những chấn
động trong dung dịch làm vi sinh vật bị ép và va chạm mạnh có thể làm vỡ vỏ tế bào
đồng thời tạo nên trong môi trường những chất độc đối với vi sinh vật như H2O2,
nitơ oxit. Siêu âm còn tạo nên những bọt khí hòa tan trong nguyên sinh chất và môi
trường làm ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh vật.
Hiện nay người ta đã ứng dụng ảnh hưởng này của siêu âm trong thanh trùng
nước uống, rượu, nước giải khát…
* Thành phần khí quyển
Thực phẩm được bảo quản trong môi trường chân không sẽ ức chế sự phát
triển của nấm mốc và các vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Đã có nhiều nghiên cứu về
việc kết hợp giữa tồn trữ lạnh rau quả với việc điều chỉnh không khí trong phòng tồn
trữ. Sự kiểm soát này bao gồm sự điều chỉnh đơn thuần nồng độ oxy, và khí trong
không khí hoặc có thể bao gồm sự bổ sung hoặc bớt lại khí CO2 hay O2 hoặc bổ
sung thêm ozone.
Kiểm soát khí (CA: control atmosphere) biểu hiện sự thay đổi của nhiều loại
khí khác với nồng độ không khí bình thường. Thông thường điều này được thực hiện
bằng cách tăng nồng độ CO2 hay giảm nồng độ O2.
Một thuật ngữ liên hệ đến sự thay đổi thành phần khí trong không khí (MA:
modify atmosphere). Phương pháp MAP (modify atmosphere packing) là phương

29
pháp đóng gói thực phẩm trong bao PE có chứa thành phần hỗn hợp các khí (CO2+
N2+O2) hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí, nấm mốc.
* Ảnh hưởng qua lại của hệ vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm
Thực phẩm tươi thường bị nhiễm một hỗn hợp các vi sinh vật bao gồm cả vi
sinh vật tự nhiên có nguồn gốc động vật hay thực vật và kể cả sự lây nhiễm từ môi
trường. Trong khi phát triển ở thực phẩm, các loài vi sinh vật không chỉ tác động với
nhau theo kiểu cộng sinh mà còn theo kiểu cạnh tranh, hiện tượng này luôn xảy ra,
đan chéo vào nhau tạo ra một bức tranh sinh thái phong phú và còn được gọi là hiện
tượng giao thoa vi sinh vật.
Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
 Vi khuẩn lactic sản sinh ra acid lactic trong sữa ngăn chặn sự phát triển của
các vi khuẩn gây hư hỏng sữa và gây bệnh
 Nấm men hiện diện trong hạt Kefir sẽ cung cấp vitamin B kích thích sự tăng
trưởng của vi khuẩn lactic
 Vi sinh vật có thể cho thấy sự tương tác hỗ trợ khi có sự kích thích phát triển
qua lại và hiệu quả của hoạt động chung của 2 vi sinh vật được tăng cường.
Điều này xảy ra trong việc lên men yoghourt trong đó sự tương tác giữa
Streptococcus salivarius spp thermophilus và Lactobacillus delbreukii spp
bulgaricus.

30
Chương IV : CÁC PHƯƠNG
PHÁP TRUYỀN THỐNG

31
4.1 Các phương pháp định lượng vi sinh vật
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp
khác nhau, trực tiếp như đếm trên kính hiển vi, gián tiếp thông qua phương pháp đo
độ đục, đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định, định lượng một cách thống
kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN).
4.1.1 Phương pháp đếm trực tiếp
Được đếm bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Thường áp dụng để xác định
mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo…
Ưu điểm của phương pháp đếm này là cho phép xác định nhanh chóng mật
độ vi sinh vật chứa trong mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là không
phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, độ chính xác không cao, dễ nhằm lẫn tế
bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu và không thích hợp với huyền phù vi
sinh vật có mật độ thấp
Phương pháp đếm trực tiếp này có thể được tiến hành trên kính hiển vi bằng
các loại buồng đếm hồng cầu, buồng đếm Breed và buồng đếm huỳnh quang
4.1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc
Cho phép xác định mật độ tế bào còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào còn
sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều
kiện nuôi cấy.
Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất
hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số
khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn sẽ làm các khuẩn lạc chồng chéo lên
nhau hoặc tạo thành màng sinh khối, ngược lại số lượng khuẩn lạc quá nhỏ thì lại
không có ý nghĩa thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250
khuẩn lạc/đĩa.

32
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa tùy thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi
trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn
lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời
gian ủ không đủ dài. Thông thường điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời
gian) cần đảm bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp này dễ sai số
nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa. Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào
hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không biểu hiện chính xác số
tế bào ban đầu được đưa vào môi trường, nên kết quả đếm và mật độ tế bào được
trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit) CFU/g thay vì
số tế bào/ml.
Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong
mẫu.
Quy trình thao tác như sau: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân  trải đĩa
hoặc đổ đĩa  ủ ở điều kiện và thời gian thích hợp  đếm số khuẩn lạc và tính kết
quả.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính theo công thức sau:
N
A (CFU/g hay CFU/ml) =
n1Vf1 + …+ niVfi
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng
4.1.3 Phương pháp MPN
Là phương pháp đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có
xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu. Phương pháp này có thể

33
dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường
lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp.
Đây cũng là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt
thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau (Thông thường, là lặp lại 3
lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng: 3x3=9 ống nghiệm). Số lượng ống
nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn.
Quy trình thực hiện phương pháp này như sau:
- Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng
trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích xác định
dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp.
- Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
- Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật
cần kiểm định trong từng ống nghiệm (phản ứng dương tính), ghi nhận
số lượng ở từng độ pha loãng.
- Sử dụng số liệu này dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật
được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.
4.1.4 Phương pháp đo độ đục
Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. Định lượng mật độ tế
bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm.
Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh
mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng.
phương pháp này cho kết quả nhanh chóng và thường được ứng dụng trong theo dõi
hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí
nghiệm hoặc trong sản xuất tuy nhiên không thích hợp dùng trong kiểm nghiệm vi
sinh vật.
N
A (CFU/g hay CFU/ml) =
n1Vf1 + …+ niVfi

34
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng
4.2 Các thử nghiệm sinh hóa
Có thể định danh vi sinh vật dựa vào các đặc điểm sinh hóa đặc trưng của loài
(hay nhóm) vi sinh vật đó. Có ba cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa
dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống, cách sử dụng các bộ KIT và
dùng các thiết bị tự động.
Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng thường được sử dụng trong kiểm nghiệm
vi sinh vật bao gồm:
 Thử nghiệm khả năng lên men: nhằm xác định khả năng sử dụng một
nguồn cacbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng. Nguồn cacbon này
được chia làm 3 nhóm: đường đơn, đường đa và rượu. Khả năng lên men
được đánh giá sự làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của
chỉ thị pH trong môi trường. Ngoài ra, CO2 được tạo thành sẽ được bẫy lại
thành bọt khí trong ống chuông Durham làm nổi ống chuông này (môi trường
lỏng) hoặc làm vỡ thạch (môi trường rắn). Được dùng để định danh các vi
sinh vật đường ruột.
 Thử nghiệm khả năng oxy hóa – lên men: còn được gọi là thử nghiệm
Hugh – Leifson nhằm xác định vi sinh vật đang thử nghiệm biến dưỡng
hydratcacbon theo phương thức oxy hóa hay phương thức lên men. Thử
nghiệm này được thực hiện bằng cách nuôi cấy chủng thử nghiệm trên môi
trường Hugh – Leifson có glucose là nguồn cacbon duy nhất và chỉ thị pH là
bromothymol blue. Các sản phẩm có tính axit của quá trình lên men sẽ làm
thay đổi màu chỉ thị.

35
 Thử nghiệm Bile esculin: thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trên khả
năng thủy phân liên kết glucoside trong esculin thành esculetin và glucost khi
có sự hiện diện của muối mật. Esculetin phản ứng với muối sắt trong môi
trường tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen.
 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate: môi trường thử nghiệm khả
năng biến dưỡng citrate sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất và có
chứa muối ammonium dùng làm nguồn đạm làm tăng giá trị pH của môi
trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị
pH trong môi trường.
 Thử nghiệm catalase: catalase là enzyme chỉ chứa trong tế bào vi sinh vật
hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2 ngăn cản
sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự giải phóng O2 sẽ
được ghi nhận thông qua hiện tượng sủi bọt khí.
 Thử nghiệm decacboxylase: thường dùng để định danh và phân loại các vi
khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae. Các vi sinh vật này thường cảm
ứng tạo thành các enzyme decacboxylase khi môi trường có tính axit và có
chất cảm ứng đặc hiệu (một loại axit amin nào đó: lizin, ornithin, arginin,…)
trong tất cả các trường hợp, CO2 sinh ra làm tăng pH của môi trường và được
ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.
 Thử nghiệm coagulase: một số loài vi khuẩn đặc biệt là nhóm
Staphylococcus, có khả năng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác
dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương. Thử nghiệm này được dùng
ở bước cuối cùng trong các chỉ tiêu thử nghiệm để định danh các loài trong
giống Staphylococcus: Staphylococcus aureus (+), Staphylococcus
epidermidis (-).
 Thử nghiệm urease: một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp urease để
thủy phân ure. Sự phóng thích NH3 và CO2 làm tăng pH của môi trường và

36
có thể được theo dõi qua sự đổi màu chất chỉ thị pH. Thử nghiệm urease đặc
trưng cho các loại Proteus spp.
 Thử nghiệm gelatinase: một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhóm
enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin trong môi trường nuôi trường
nuôi cấy. Trong thử nghiệm này, phản ứng (+) khi môi trường đặc tan chảy
thành dạng lỏng.
 Thử nghiệm khả năng tăng sinh H2S: trong quá trình phân giải các axit
amin chứa lưu huỳnh khí H2S được giải phóng, tạo tủa màu đen với chỉ thị
sulfite có trong môi trường.
 Thử nghiệm khả năng sinh indol: một số vi sinh vật có khả năng oxy hóa
tryptophan thành các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được
thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-
Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng
quinon có màu đỏ.
 Thử nghiệm KIA, TSI: môi trường KIA (Kligler Iron Agar) và môi trường
TSI (Triple Sugar Iron agar) được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời
khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng
sinh H2S của chủng vi sinh vật. Nếu vi sinh vật chỉ lên men đường glucose thì
sau 18 – 24 giờ nuôi cấy môi trường thạch nghiêng phần trên sẽ có màu đỏ,
phần sâu sẽ có màu vàng. Nếu vi sinh vật lên men cả đường glucose và
lactose thì thị sau 18 – 24 giờ toàn bộ môi trường sẽ có pH acid, môi trường
có màu vàng. Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn cacbon trên
thì chỉ có phần trên thạch chuyển sang màu đỏ. Trong các trường hợp trên
nếu sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí thì sẽ làm vỡ thạch.
 Thử nghiệm nitratase: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng tổng hợp
hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrit và nitơ phân tử của vi
sinh vật.

37
 Thử nghiệm oxidase:thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ
enzyme oxidase ở vi sinh vật.
 Thử nghiệm ONPG: Xác định sự có mặt của enzyme β-galactosedase có vai
trò xúc tác sự thủy phân lactose trong tế bào vi sinh vật dựa vào một cơ chất
tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPD). Sự thủy phân của cơ
chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol có màu
vàng.
 Thử nghiệm MR (methyl red): Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật
dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng
có tính axit bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Thử
nghiệm MR phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy. Khi kéo dài thời gian
nuôi cấy, các vi sinh vật có phản ứng MR (+) có đặc tính là tích lũy axit trong
môi trường ngày càng nhiều, pH trong môi trường ngày càng giảm. Các vi
sinh vật có phản ứng MR (-) sẽ tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm có tính axit
thành các sản phẩm trung tính, pH sẽ chuyển về phía trung tính. Chỉ thị metyl
red giúp phân biệt nồng độ H+
hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật
lên men.
 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer): thử nghiệm VP giúp phân biệt các
loài trong họ Enterobacteriaceae dựa trên sự oxi hóa acetoin.
 Thử nghiệm CAMP: Là phản ứng phối hợp giữa nhân tố protein và nhân tố
β-hemolysin tiết ra bởi chủng Staphyloccocus aureus gây ra hiện tượng làm
tan máu hồng cầu của cừu hoặc bò trên môi trường thạch máu. Nếu thử
nghiệm (+) thì sẽ xuất hiện đường tan huyết phân biệt rõ với vùng sẫm màu
còn lại trong môi trường.
 Thử nghiệm tính di động: khả năng di động của vi sinh vật có thể theo dõi
được trên môi trường thạch mềm. ngoài ra, triphenyltetrazolium chloride
(TTC) có thể được bổ sung vào môi trường để giúp phát hiện dễ dàng vị trí

38
hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên
trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.
Ngày nay các thử nghiệm sinh hóa truyền thống để định danh vi sinh vật đã
có thể được thực hiện ỏ các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy.
Ngoài ra, còn có các bộ kit cho phép thực hiện hàng loạt các phản ứng sinh
hóa theo một quy trình lựa chọn để định danh vi sinh vật. Các bộ kit này sản xuất
dưới dạng thương phẩm có ưu điểm ví dụ như mỗi bộ kit chỉ cho phép định danh
được một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn. Ngoài ra, nhu cầu phân tích
số lượng mẫu lớn của thực tế công tác kiểm nghiệm nhanh để rút ngắn thời gian từ
khi nhận mẫu đến khi có kết quả. Do vậy, nhiều thiết bị được chế tạo nhằm tự động
hóa công tác kiểm nghiệm, đặc biệt là không yêu cầu kiểm nghiệm viên luôn phải có
mặt để giám sát công việc, có thể thực hiện qua đêm.
4.3 Một số chỉ tiêu vi sinh vật xác định bằng phương pháp truyền thống
4.3.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí (TPC) :
Chỉ số này còn có tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên
đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá
mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh
và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm.
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc
trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2). Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện
diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một
lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào
hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc
(colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.

39
Sơ đồ 4.1 :Quy trình phân tích TPC
4.3.2 Coliforms và Escherichia coli
Coliforms là những trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử hiếu khí hoặc kỵ
khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh axit và sinh hơi ở 37o
C trong 24 – 48
giờ, hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Chúng bao gồm:
Escherichia coli, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp. Số lượng hiện
diện của chúng trong thực phẩm được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi
25g mẫu + 225ml SPW
Pha loãng trong nước muối sinh lý
(10-2
,10-3
,10-4
)
Đồng nhất 30s
Độ pha loãng 10-1
Cấy 1ml trên 2 đĩa petri
Đổ môi trường PCA làm
nguội trong 45o
C
Ủ ( t:30o
C, 72h)
Lắc đều
Úp ngược
Tính toán theo công thức
(3.1.2)
Đọc kết quả từ 25-250
khuẩn lạc

40
sinh vật gây bệnh khác. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện
qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges Proskauer (VP) và Citrate
(iC) thường được gọi chung là IMViC.
Sơ đồ 4.2 : Quy trình phân tích Coliforms
Đồng nhất 30s
Đổ môi trường TSA làm
nguội trong 45o
C
Đổ VRB lên TSA
Chọn và đếm khuẩn lạc (màu đỏ sậm, có
quầng tủa muối mặt, d > 0.5mm)
Ủ ở t = 37o
C
Time = 24h
Ủ ở t =37o
C, 24h
Chọn mỗi đĩa 3-5 khuẩn
lạc, cấy sang mt BGBL
A=
nVf
N
*R
R=
n
n1
n1 : khuẩn lạc trong BGBL
n : khuẩn lạc đã cấy

41
4.3.3 Staphylococcus aureus:
S. aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó cần xác định để biết
mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng
hay không.
Staphylococcus. aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và
phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi
trường phân lập.
Sơ đồ 4.3 : Quy trình định lượng Staphylococcus Aureus
Đồng nhất 30s
mt BP( có egg yolk)
Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào
mt TSA
Ủ, t = 37o
C
Thời gian : 48h
Khuẩn lạc : tròn, lồi, tâm
đen và có quần sáng
Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2
ml huyết tương thỏ
Đọc kết quả và tính toán
Ủ, t = 37o
C
Theo dõi :2h,4h,6h,8h

42
4.3.4 Clostridium
Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần
lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng
lượng. Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt
và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là
C.botulinum và C.perfringens.
C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi
trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng trong
loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký
hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy giài protein tạo nên
một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, còn các
kiểu C, D, E không có khả năng này. Kiểu A thường thấy trên các mẫu thịt trong khi
kiểu E chỉ được phân lập trên các mẫu cá.
C. perfringens là loài kỵ khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các
môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử trên môi trường
nuôi cấy Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline. Loài
này có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A thường
gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm.
Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có
chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37o
C trong 1 – 2 ngày. Nếu
nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 50o
C. Trên môi trường này các khuẩn lạc
Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-
) và ion sắt (Fe2+
) có
trong môi trường.
4.3.5 Salmonella:
Salmonella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng di
động, không tạo bào tử, lên men glucose và manitol sinh axit nhưng không lên men
saccharose và lactose, không sinh indol, không phân giải ure, không có khả năng
tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết đều sinh H2S.

43
Sơ đồ 4.4 : Quy trình định tính Salmonella
Đồng nhất 30s
Ủ, t = 37o
C
Thời gian : 24h
0,1 ml dd 10ml mt RV
Cấy chuyển qua mt XLD
Ủ, t = 42o
C
Thời gian : 24h
Ủ, t = 37o
C
Thời gian : 24h
Khuẩn lạc : tròn, lồi, tâm
đen, mt chuyển màu đỏ
Cấy chuyển qua mt TSA
Ủ, t = 37o
C
Thời gian : 24h
Cấy chuyển qua mt TSI,
Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC broth
Ủ, t = 37o
C
Thời gian : 24h
Biểu hiện : TSI (đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)),
Mannitol (+), Urea (-), LDC (+)
Kết luận

44
4.3.6 Tổng số nấm men, nấm mốc:
Trong thực phẩm, sự hiện diện của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi
màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu
của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố hay gây ngộ độc thực phẩm.
Mật độ nấm mốc, nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng
số nấm mốc, nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi
trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal
Chloramphenicol agar (DRBC).
Khuẩn lạc đặc trưng Coliforms Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella
Khuẩn lạc đặc trưng Staphylococcus Aureus Khuẩn lạc đặc trưng Clostridium
Hình 4.1 : Các dạng khuẩn lạc đặc trưng của vi sinh vật

45
Ưu điểm các phương pháp truyền thống :
 Thực hiện với các thao tác đơn giản, không phức tạp.
 Chi phí để phát hiện vi khuẩn không cao.
 Được nhiều nước công nhận và đã trở thành những phương pháp tiêu chuẩn
Nhược điểm :
Tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm, sai lệch, mất nhiều công sức và ngày
càng tỏ ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện
nay.
Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều
phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát triển dựa trên nhiều
nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau.
Các phương pháp mới này nhằm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm
thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện và có độ nhạy và độ chính xác
cao.
Như vậy, để xác định vi sinh vật trong thực phẩm có nhiều phương pháp
khác nhau. Tuy nhiên các phương pháp này đều đòi hỏi thời gian, môi trường hóa
chất và luôn tuân theo một quy trình nghiêm ngặt. Để khẳng định kết quả cần dựa
trên kết quả tổng hợp của nhiều thí nghiệm khác nhau đòi hỏi người thực hiện có
kiến thức và kinh nghiệm chuyên sâu.
Do đó, để hỗ trợ cho công tác phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm nhanh
chóng và tiện lợi hơn, hiện nay đã có nhiều công trình ứng dụng các kỹ thuật mới
trong lĩnh vực này.

46
Chương V : CÁC PHƯƠNG
PHÁP HIỆN ĐẠI

47
5.1 Tổng quan
Ngày nay, với tiến bộ của khoa học kỹ thuật đã tạo một bước tiến vượt bậc
trong mọi lĩnh vực khoa học nói chung và sinh học nói riêng. Các nghiên cứu khoa
học gần đây đã cải thiện đáng kể về các phương pháp xác định vi sinh vật trong thực
phẩm. Tăng hiệu suất công việc cũng như đáp ứng nhu cầu của thị trường thế giới.
Được nghiên cứu và phát triển vào những năm 1960, sinh học phân tử đã mở
ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh
vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi
sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh
vật.
Với ưu điểm nhanh và chính xác, các phương pháp hiện đại đã dần thay thế
các phương pháp truyền thống trong việc xác định vi sinh vật. Việc áp dụng phương
pháp hiện đại trong lĩnh vực nghiên cứu đã mở ra một cách nhìn nhận hoàn toàn mới
về vi sinh vật.
Hiện tại các phương pháp hiện đại đã được áp dụng một cách rộng rãi trên
toàn thế giới. Áp dụng phương pháp này người ta đã chế ra các bộ kit dùng trong
thực phẩm, phục vụ cho mọi công tác kiểm tra vi sinh cũng như đảm bảo an toàn
cho đời sống nhân dân. Du nhập vào Việt Nam vào đầu những năm 1990, các
phương pháp hiện đại đã dần thay thế các phương pháp truyền thống. Hiện nay, trên
thị trường đã không ít các bộ kit áp dụng các phương pháp hiện đại áp dụng và một
số kit đã được chế tạo trực tiếp tại thị trường Việt Nam.
5.2 Các nghiên cứu về Kit thực phẩm tại Việt Nam
Kit kiểm tra nhanh là sản phẩm của các chuyên gia thuộc Viện kỹ thuật Hoá
sinh và Tài liệu nghiệp vụ (Tổng Cục Kỹ thuật-Bộ Công an). Chúng được sản xuất
dưới dạng ống thuỷ tinh, que nhựa hoặc túi nhỏ, bằng nguyên liệu sẵn có trong
nước. Những loại kit này có chung một đặc điểm là phát hiện sự hiện diện của một
loại hoá chất độc hại trong thực phẩm thông qua sự thay đổi màu sắc của thuốc thử
nằm sẵn bên trong kit, do vậy có thể dễ dàng đọc kết quả bằng mắt thường.

48
Hiện Viện đã chế tạo được 15 bộ kít khác nhau có thể thử nhanh và cho ngay
kết quả nhiều lọai độc chất thường được cho vào thực phẩm như nitrit trong thịt đã
chế biến, chì trong thực phẩm, thức uống… Ngoại trừ kit kiểm tra thuốc trừ sâu cho
kết quả sau khoảng 50 phút, các loại kit còn lại cho kết quả sau không quá 5 phút
với độ nhạy và chính xác cao. Với những ưu điểm này, các cơ quan quản lý nhà
nước và người tiêu dùng có thể sử dụng kit thử nhanh để kiểm tra ngay tại cơ sở sản
xuất, chế biến thực phẩm, các chợ và cửa hàng.
Theo Thạc sĩ Lê Trọng Văn, Phó trưởng phòng kỹ thuật sinh học nghiệp vụ,
công nghệ sản xuất kit kiểm tra nhanh từ lâu đã được áp dụng để phục vụ trong
ngành công an từ nhiều năm nay. Chỉ đến gần đây, công nghệ sản xuất kít đã được
mở rộng sang lĩnh vực dân sự để bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng. Mỗi loại kit kiểm
tra được chế tạo bằng một công nghệ khác nhau, tuân thủ các quy định của Bộ Y tế,
Tiêu chuẩn Việt Nam hoặc Dược điển Việt Nam. ''Đây hoàn toàn là kết quả nghiên
cứu của chúng tôi - một loại sản phẩm hoàn toàn của Việt Nam'', Thạc sĩ Văn khẳng
định.
Để nghiên cứu, sản xuất những loại kit thử nhanh, tiện lợi và đơn giản cho
người tiêu dùng, nhóm nghiên cứu đã phải thử hàng chục phương án khác nhau, dần
dần khắc phục các nhược điểm và hiện đang sản xuất trên quy mô nhỏ.
Không dừng lại đó, để phục vụ các cơ quan quản lý Nhà nước về VSATTP,
nhóm đã thiết kế một loại valy gọn nhẹ, phù hợp với công tác kiểm tra cơ động,
chứa 15 loại kit trên cùng với một số dụng cụ phục vụ việc xử lý mẫu, thu thập mẫu
cho xét nghiệp tiếp theo trong phòng thí nghiệm.
Trên phương diện quản lý Nhà nước, các kit này đã được thử nghiệm thực tế
tại Viện Dinh dưỡng và một số trung tâm y tế dự phòng. Chi cục Bảo vệ thực vật Hà
Nội cũng đã tiến hành thử nghiệm bộ kit kiểm tra nhanh thuốc trừ sâu trước khi áp
dụng thực tế. Theo đánh giá của Chi cục, sản phẩm này có cách sử dụng đơn giản
hơn so với sản phẩm ngoại nhập cùng loại và cho kết quả chính xác. Hiện nay Chi
cục đã mua sản phẩm này để áp dụng cho công tác kiểm tra hàng năm.

49
Riêng trên thị trường nước ta, hiện chưa có các loại kit nội tương tự dành cho
người tiêu dùng. Các kit ngoại thì chưa phù hợp lắm với điều kiện của Việt nam, khi
sử dụng phải đong, đo hoá chất từ các lọ nhỏ đóng sẵn, vì vậy không loại trừ được
sai số chủ quan do người sử dụng gây ra. Còn lượng hoá chất trong các kit thử của
Viện Kỹ thuật Hoá Sinh và Tài liệu nghiệp vụ (Tổng Cục Kỹ thuật-Bộ Công an) đã
được định lượng sẵn, do vậy loại bỏ được sai số nói trên.
5.3 Phương pháp phân tích vi sinh vật trong các Kit test nhanh thực phẩm
5.3.1 Phân loại các kit :
Các phương pháp nhanh và tự động hóa trong phân tích vi sinh vật thực phẩm đều
dựa trên nguyên tắc của vi sinh học, sinh hóa học, hóa lý, miễn dịch học, sinh học
phân tử học để phát hiện và định lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại
của chúng trong thực phẩm, môi trường. Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến
việc thu và chuẩn bị mẫu, phân tích….đều được nghiên cứu cải tiến theo hướng tự
động hóa, đơn giản hóa cho kết quả nhanh và chính xác.
Sơ đồ 5.3.1 : Phân loại các phương pháp áp dụng trong Kit
Phương pháp xét nghiệm nhanh thực phẩm
Phương pháp
PCR
Phương pháp
lai DNA
Phương pháp
sinh hóa
Phương pháp
vi sinh
Phương pháp
sinh học phân tử
Phương pháp
miễn dịch
Phương pháp
ELISA
Phương pháp
hóa lý
Phương pháp phát
quang sinh học ATP

50
5.3.2 Phương áp dụng trong kit :
5.3.2.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh
Nguyên tắc :
Nguyên tắc chung của quy trình phát quang sinh học này như sau: Mẫu được
thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhỏ nhất định trên bề mặt
dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch trích ly ATP, xử lý với
ATPase và cho phản ứng phát sáng.
Gần đây, nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa
chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của
dụng cụ quẹt mẫu, sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát
ra.
Để biết mật độ vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường
chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã biết
trước.
Cơ chế :
Adenosin triphotphat (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống nên sự
phát hiện ATP là dấu hiệu nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được
phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp
với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có thể phát hiện được
1pg (10-12
g) tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15
gATP/ tế bào). Độ
nhạy này có được khi sử dụng các hóa chất thương mại đắt tiền, sự phân tích thường
chỉ diễn ra vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi
hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc.
Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật
đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi
nhiều sự cải tiến trong việc thiết kế máy đo lượng ánh sang phát ra (giảm giá thành
và có thể mang đi được) và những hóa chất ổn định sự phát sang. Phương pháp này
được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những chất lỏng như

51
nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. để đánh giá
chất lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải được
tách chiết ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng
phát ra.
Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm trải qua hai giai đoạn:
E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1)
E – LH2 AMP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2)
Phản ứng có thể được viết lại như sau:
E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi
(E: Luciferase; LH2: Luciferin)
Phản ứng phát sáng của đom đóm là có hiệu quả nhất, được biết đến như
phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP. Phản ứng này đòi hỏi D-
Luciferin và ion Mg2+
để hoạt động, đây là thành phần cơ bản trong bộ kit thương
mại. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với
oxi và phức hợp Mg – ATP. Sau đó, ánh sáng vàng - xanh (bước song cao nhất là
562nm) được phát ra. Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất,
chế biến thực phẩm, tổng vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm, người ta xác định
tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của
eukaryote và của tế bào vi sinh vật. Thông thường ATP không có nguồn gốc là của
tế bào vi sinh vật sẽ được tách chiết bởi những chất tẩy không ion ví dụ như Triton
X-100. ATP này sau khi tách chiết khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý
với enzyme ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ
được ly trích bằng chất tricloaxetic 5%. Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng
được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp.
Các sản phẩm áp dụng phương pháp ATP :
Ngày nay sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá
chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh

52
giá chất lượng thực phẩm, mĩ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, nhanh chóng
chỉ trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa.
Các sản phẩm bao gồm :
 ProbesATP Kit
 Máy đo APT được nối với máy tính và đo bằng chương trình Advance.im
 Và còn một số sản phẩm hiện đại khác trên thị trường thế giới…
Hình 5.1 : Máy đo 3MTM
Clean-TraceTM
Surface ATP
Ưu điểm :
 Nhanh, chính xác và thao tác đơn giản
 Tiết kiệm thời gian, tăng năng suất công việc
 Thực hiện mẫu trong các loại sản phẩm khác nhau
Nhược điểm :
 Cồng kềnh, khó di chuyển
 Tốn chi phí rất lớn cho việc mua mẫu ATP và các lọ thuốc thử
 Đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn cao

53
5.3.2.2 PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay)
Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát
triển của các kỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh. Các phương pháp này tỏ ra rất
hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh. Ngày
nay phương pháp này còn được phát triển để xác định các chất độc hại trong môi
trường như dộc tố, dư lượng kháng sinh…Nguyên tắc của phương pháp ELISA dựa
trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Phản ứng
miễn dịch xảy ra được phát hiện bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh
dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme).
Nguyên lý :
Phương pháp ELISA là phương pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme
(enzyme-linked immunosorbent assay). Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng
kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngoài những giếng (well) nhỏ nhằm
mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu. Những kháng nguyên thu giữ được
phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme phát tính hiệu
(thường là horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase). Khi cho vào hỗn hợp
phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm
làm đổi màu phản ứng. Như vậy, chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của
kháng nguyên.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng
thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này
được gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín
hiệu có thể xác định được.

54
Hình 5.2 : Nguyên tắc phản ứng ELISA
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT. Sự
hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.
Cơ chế :
ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:
Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được
cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập
đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa
tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.
Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như
albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể
cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng
ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của
đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của
huyết thanh.
Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ
một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN
đã gắn với enzyme).
Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.

Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm

Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm

Similar to Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm