糖化産物が神経細胞の老化に関与することの示唆

1. Juntendo University
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137
原 著
順 天 堂 医 学 ．2005，51
P 、137 − 146
非痴 呆 高 齢者 網 膜 に お け る ア ル ツ ハ イ マ ー
病
病 態 関連物 質 の 発現 に 関 す る 免疫 組織 化 学 的検 討
李 麗 梅
＊ 1 ）
LIMEI LI
村 上
高 橋 正
＊ 1 ）
TAI）AsHITAKAHASHI
日 ＊ 3 ）
日 日
AKIRA
MURAKAMI
中 村 眞 二
＊ 2 ）
SHINJI NAKAMURA
新 井 平 伊
＊ 1 ）
HEI［ARAI
目的 ： ア ル ツ ハ イ マ
ー病Alzheimer
’
s disease （AD ）の 脳 に 特徴的 な神経病理所 見 と して は ，
老 人 斑 や 神経 原線 維 変化の 形成 と神 経細 胞 の 脱 落 な どが挙 げ られ る，一方 ，ヒ ト の 網膜 は 1 視 神
経 な ど を通 じて 中枢 神経 系 と直結 し ，両 者 の 発生 起 源 は 神経 外胚 葉で 同
一で あ る こ と な どか ら ，
AD 患者の 脳 内に生 じて い る 病理 所見 と密接に 関係 し た所見 が網膜 や 視神 経 に も認 め られ る可能
性 が あ る．しか し ，網膜 に は加 齢あ るい は老化 に伴 う変化 も存 在 す る こ とか ら，最初 に 非 痴呆 高
齢者の 網膜に お ける 神経細胞 の 老 化や AD 病態 に 関連 し た 物 質 の 局 在 を検討 す る必 要性 が あ る ，
対 象 と方 法 ：対象 は ，死 亡1］寺年齢 が 62歳 か ら78歳 まで の 非 痴呆 高齢者の 剖検眼 6例 ［平均年
齢 （SD ）≡
68，3 （6．1 ）］の 網膜組織 で あ る．神経細胞の 老化や AD の 病態 に 深 く関連す る10種
類 の 物 質 （終 末糖 化産 物
・カ テ プ シ ン D ・ア ミロ イ ド前駆 体蛋 白 ・ユ ビ キ チ ン ・カル レ チ ニ
7 ・
ニ トロ チ ロ シ ン ・α
一シ ヌ ク レ イ ン ・異常 リ ン 酸化 タ ウ 蛋白 1 タ ウ蛋 自 ・single stranded DNA ）
の 発 現 につ い て ，各々 の 抗 体 を用い て 免疫組 織化学に よ っ て 検索 し た ．
結果 ：非痴呆高齢者の 網膜で は ，老人斑の 主要構成成分で あ る ア ミ ロ イ ドβ蛋白の 前駆 体 や 神
経原 線維 変化 の 主 要構成成 分で あ る異 常 リ ン 酸 化 タ ウ蛋 白 な どに つ い て は ，強度の 発 現 は 認 め ら
れ なか っ た もの の ，弱 い 発現 が認 め られ た ．Single stranded DNA を除 くそめ他の 物質 につ い
て は ，中等度か ら強 度に 発現 が認 め られ ，各々 特徴的な 発現 分布 が 認 め られ た．
結 論 ； 非 痴呆 高 齢者 網膜 組織 に お け る神経 細 胞 の 老 化 あ るい は AD の 病態 に 関連す る物質の 組
織 内分布 を初 め て 明 らか に し た ． 今後 ，AD 症例や 若年非痴呆 症例の 網膜 に 関す る更 な る詳細 な
病 態 研究 が 必要 と考 え られ た ．
キ ーワ ード ：高齢者 ，ア ル ツ ハ イマ
ー病 ，網 膜 ，免疫 組 織化学 、老 化
f
＊ 1 ）順天 堂 大学 医学 部 精神 医学 講座
＊ 2 ）順天 堂 大学 大 学 院 医学 研 究 科 研究 基盤 セ ン タ ー細胞病理 イ メ
ージ ン グ 研究部門
＊ 3 ）順 天 堂大学 医学部眼科学講座
＊ 1）DepartmentofPsychiatry，ノuntendo Univers め
f
Sch・ ・ 1 ofMedicine ， Tokyo，
Japan
＊ 2 ）Division ofBiomed ’ca1 ∬maging Research ，
’
Biomedical Research Center，
Juntendo University Graduate School
ofMe ゴ∫C 加 e ． Tokyo， Japan
＊ 3 ）De ρ at
』亡mentof Oρhthalmolog｝
厂，ノuntendo University School ofMe （1icine，
Tokyo ，∫aρan
〔Oct．20，2004 原稿 受領 〕〔Feb，24， 2005 掲載 決定 〕
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138 李他 ：高齢者網膜の 免疫組織化学 的検討
は じ め に
近年 日本 で は ，急速 な人 口 の 高 齢化 と ともに 痴
呆性疾患の 有病者数 も増加 の 一
途 をた ど り ，大 き
な 社会問題 に な っ て い る．本邦にお ける痴呆症の 原
因疾 患 の 中で は ，ア ル ツ ハ イ マ
ー
病 Alzheimer
’
s
disease （AD ）の 比 率が増加 し て い る こ とが 指摘
され て い る もの の ，疾 患特異 的 な他 覚 的検 査 法 あ
る い は有用 な 診断法に つ い て は ，
い ま だ確立 され
て い な い の が 現状 で あ る．
AD 患者 脳 の 病理 学 的特 徴 と し て は ， 大脳 皮 質
や 海馬 を中心 とす る神経細胞脱落 ，細胞外 に 沈着
す る老 人斑 senile
plaques （SP ）や脳 血 管 ア ミ ロ
イ ド，神経細 胞 内 な どに 蓄積 す る神 経原 線維 変化
neurofibrillary tangles （NFT ）が挙げ られ る ．
SP は ， AD 発症 の 初期 か ら認 め られ る病理 像 で あ
り ，そ の 主要構成成 分 は ア ミロ イ ドβ蛋 白amy −
loidβprotein（A β）で あ る．こ の A βは ，
ア ミ ロ
イ ド前駆 体 蛋白amyloid precursor protein（APP ）
か ら生理 的に 切 り出 され ， 分 泌 され る1 ）
．こ の A β
が 分泌 ・分解 経路 の 異 常 な ど に よ っ て 凝集 を開始
す る こ とが AD 発 症機 構 に 深 く関 わっ て い る もの
と考 え られ ，ア ミロ イ ドカ ス ケ
ー ド仮説 と し て広
く受け 入 れ られ て い る ．NFT は ，微小管結合蛋白
質の
一
種で あ る タ ウ蛋白tau
protein （Tau ）が 異
常 な リ ン 酸化 を受 け る こ と に よ っ て 線維状 （タ ウ
線 維 ）に 凝集 して 形 成 され る
2 ）3 ）．AD 脳 に 認 め
られ るNFT は ，
paired helical filaments（PHF ）
あ る い は twisted tuble （捻れ細管 ）とstraight
tuble （直細管 ）と呼ば れ る 2種類の タ ウ線維か
ら構成 されて い る．AD 脳 の Tau は ， 異 常 な リ ン
酸 化 ，ユ ビキ チ ン ubiquitin 化 ，糖 化 （グ リコ シ
レ
ーシ ョ ン ）glycosylation な どの さま ざまな修
飾 を受 け ，本来 の 機 能 で ある 微 小管 重合促 進能 を
失 っ て い る 4 ）
．ま た ， 神経 細胞脱 落 （神 経細胞 死 ）
な どの 病理 変化 を形成す る機序 と し て ， 酸化ス ト
レ ス oxidative stress ，終末糖化産物 advanced
glycation end −products （AGE ），神経細 胞 内
カ ル シ ウ ム ホ メ オ ス タ
ーシ ス calcium
homeosta−
sis の 障害 ，小胞 体 ス トレ ス （ER stress ）な どの
関 与 が 注 目 され て い る 5 ）6 ）
． こ れ ら の 機序 は ，
AD な ど の 神 経 変性 疾患 の 病 態 の み な らず ，健常
高齢者の 中枢神経系の 老化過程 に も深 く関与する
こ とが 示 唆 されて い る ．
ヒ トの 老化過 程 に お け る 中枢 神経 系の 関与は 非
常 に 大 き く，身体諸 器官 ・組織 の 機 能 的統 合 と調
節の 役割 を果た し て お り，老化 に 伴 う機能的衰退
は まず中枢神経 系の 統 合機 能 に求め られ る こ とが
明 らか に され て い る． し た が っ て ，ヒ トの 中枢神
経系 の 老 化 は感 覚器 官 の 機 能低 下 と し て 現れ ，視
覚
・聴覚
・
嗅覚 な どの 老 化 は 多 くの 個 体 が 経験 す
る と こ ろ で あ る， ヒ トの 視 力は 45歳 頃か ら低 下 し
は じめ ， 75歳 以 降 に 急 速 に 低 下 す る が ， 加 齢 変
化 に 伴 う水晶体 の 弾 力性 の 低下 ，毛様 体 筋の 緊張
低 下 ，副 交感神経 の 機 能低 下 な どが原 因 と考 え ら
れ て い る ，こ の よ うな老視 の ほ か に も ， 加 齢に 伴
う視 力の 低 下 に は ，水晶体 の 混濁 （老人性 白内障 ），
縮 瞳に よ る 入 射光量 の 減少 ，網膜視細胞 の 減少 ，
視神経伝導路の 機能低下 な どが 関与する ．加齢 に
よ る網 膜細 胞 の 変化に つ い て は ，視細胞 の 中で も
杆体 （rod ）の 減 少 が顕 著 で あ り ，双 極細 胞 ，無
軸索細胞 （ア マ ク リ ン細 胞 ；amacrine ce ］1
），水
平 細 胞 な ども一定 の 減 少 を示 し ，結果 的 に 網膜 全
体 の 厚 さも減 少 す る こ と が 報告 され て い る
7 ＞8 ）．
し か し ，網膜細胞 の 細胞 死 が どの 程度 高齢者 の 視
力低 下 に 関与す る か は 明 らか に され て い な い よ う
に ，加 齢 に 伴 う網 膜 の 細胞 変化 と機能 変化 の 相 互
関係 や 各 々 の 機序 に 関す る詳細 は 明 らか に されて
い ない こ とが多い ．
一方 1 全 身 性疾 患 の 一局 所病 変 と して 視覚 器
（眼 ）と い う独立 した小器官 に認 め られ る局 所病
変の 存在 が 知 られ て い る ．ま た ， 眼球の 外壁 内膜
で ある網 膜 は ，視 神経 を通 じ て 中枢神 経系 と直 結
し ， 両者 は 発生起 源 も神 経 外胚葉 で ある こ と な ど
か ら中枢神経疾患の 脳 内に生 じて い る病理 所 見 と
密接 に 関係 し た 所 見 が認 め られ る可能 性 が考 え ら
れ る ． した が っ て ，中枢神経系の 老化 に 関与す る
物質 や AD 患 者の 脳 内に 生 じて い る特 徴的 な病 理
所見 の 形 成 に 関与 す る物 質 に つ い て も，網膜 や 視
神経 に も何 らか の 意義 あ る所見 が 認め られ る 可 能
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順 天 堂 医 学 51巻 2号 （2005） 139
性 が示 唆 され る ．し か し ，こ れ まで の と こ ろ こ の よ
うな観 点 か らの 詳細 な検討 は 報告 されて い な い ．
以上 よ り，本研究 で は ，網膜 組繊 の 加齢 あ るい
は老化 に伴 う細胞 ・組織 変化 の 詳細 な機序 を究 明
する た め に ，非痴呆高齢者 剖検 眼の 網膜 ・
視神経
組織に お け る 中枢神経系の 老化 や AD の 脳 内病態
に 関連す る種 々 の物質の 発現 に つ い て 免疫組織化
学 的 に 網 膜局 在 を検 討 し ， 知 見 を得 た の で こ こ に
報 告 す る ． さ らに ，本研 究 は ，AD 患者の 網膜に
お け る疾患特 異 的変化 の 有無 を検討 す る うえ で も
重 要 な 予備 的研 究 と な る ．
trotyrosine， α
一シ ヌ ク レ イ ン α
一synuclein ，異
常 リ ン 酸化 Tau （PHF −Tau ），Tau ，single
stranded
DNA （ssDNA ）に 対する抗体 を用 い
て 免疫染 色 を行 っ た （表一2 ）．
免疫組 織 化学 は ，パ ラ フ ィ ン切 片の 脱 パ ラ フ ィ
ン を行 っ た 後 ，前 処 理 と し て O ．OIM ク エ ン 酸
Buffer（pH6 ．O ）を用 い た熱 処理 に よ り抗原性 の
賦活 化 を行 っ た （表 一2 ）．非特異 的反 応 を抑 え
る た め 2 ％ BSA で ブ ロ ッ キ ン グ を行 い ，0．3 ％過
酸化水素水で 内因性の ペ ル オ キ シ ダ ーゼ 活性 を阻
止 した ．表 ・2 に示 した各抗 体 で
一晩反 応 し た 後 ，
対 象 と 方 法
表 ・1 対象症例
1、対象 （表 一1 ）
対象 は ，当初は死 亡 時年齢が 59 歳か ら 89歳 ま
で の 非 痴呆 高 齢者 の 剖 検 眼 9 例 と した ． しか し ，
こ れ らの 症例 に は ，組織 の 保 存状態 が 良好 で な い
症 例や パ ラ フ ィ ン包 埋 な どの 組織切 片作成 過 程 に
お い て 網膜 の 層構 造 の 一部 に 剥離 ・破壊 が 生 じ た
症例が 3例含 まれ て い た た め ，最終 的 に は こ れ ら
の 過 程 が比 較 的 良好に 行 わ れ た 死 亡 時年 齢 が 62
歳 か ら 78歳 まで の 6例 に つ い て 検討 し た ［男性 1
例 ，女性 5 例 ，平均 年齢 （SD ）＝
683 （6．1 ）］
（表 一1 ）．すべ て の 症 例 は ，生 理的 な加齢 性 変化
（老 視や 老人 性 白内障 な ど ）を除 く限科疾 患 お よ
び糖尿 病 や慢 性 腎不全 な ど の 代表 的 な 局所眼 病変
をき た す全 身性疾 思 は伴 っ て い なか っ た ．
2 ．方 法
剖検眼組織 は ，10 ％ ホ ル マ リ ン で 固定 され ，
その 後 に パ ラ フ ィ ン 包 埋 した ．各症例 ご と に 約
3．5 μ m 厚 さに 薄切 し ，シ ラ ン コ
ーテ ィ ン グ
・ス
ラ イ ドに 貼付 し て 作成 し た切 片 を免疫 組織 化学 に
使 用 し た ．作成 した 切 片 は ，10層構 造か ら な る
中心窩 ・黄 斑部 以外 の 網 膜後 極外側 部 で あ る ．
各症 例 に つ い て HE 染色 （図一1 ）を行 っ た ．そ
の 後 ，各症例 に つ い て 中枢 神経系の 老 化に 関 連す
る 物 質あ る い は AD の 病態 関連物 質で あ る AGE ，
カ テ プ シ ン Dcathepsin D ，APP ，ユ ビ キ チ ン ，
カ ル レ チ ニ ン ca1
』
retinin ，ニ トロ チ ロ シ ン ni 一
症 例 年齢 （歳 ） 性別
1234
【D
ハ0
2
」48583
6
£U7667
女
女
女
男
女
女
平均年齢 （SD ＞＝68．3 （6．1）
78Q
ゾ
91
Ω
）
568 男
男
男
b
de
09h
図 ・lHE 染 色 （× 100 ）
＊ ：色素上皮細胞 層な し a ：光受容 体細 胞層 b ： 外境 界膜
c ：外 顆粒層 d ： 外網 状 層 e ： 内顆 粒層 f ： 内網状層 g ：神
経節細胞層 h ：神経線維層 i： 内境界膜 （62歳症例 よ り）
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140 李他 ：高齢者網膜の 免疫組織化学．的検討
LSAB 法 9 ）
（labeled streptavidin −biotin method ）
に よ りDAB 発 色 で 検 出 し ，ヘ マ トキ シ リ ン に て
核 染色 を行 い 光 学顕 微鏡 に て 観 察 し た ．
抗原 抗体反 応 の 妥当性を確認す る た め の 陰性対
照実験 と して ，正 常 ウサ ギ血 清 （図 一2L ）あ るい
は 正 常マ ウ ス 血 清 （図一2K ）を
一
次 抗体の 代わ り
に 用 い た 実験 を行 っ た ．
免疫組織化学を行 っ た 網膜 組織 切片ス ラ イ ドを
光 学顕 微鏡 レ ベ ル で 詳細 に観 察 し ， 組織 の 層 構造
ご と の 各物質の 発 現 陽 性 レ ベ ル を 4 段 階 （微陽
性 ± ，弱陽 性 十 ，中等 度陽性 十十 ，強陽性 十 十 十 ）
に 分類 して ，
さ らに その 局 在を検討 し た ．
結 果
非痴 呆 高齢者の 網 膜 組 織 を 10 種類 の 物質の 抗
体を用 い て 免疫組 織化学 的に検索を行 っ た ．各抗
体 ご とに 特 徴 的 な局在 分布 お よび種 々 の 程度 の 免
疫活性陽性所見 を観察する こ と が で きた （表 一3 ）．
全 て の 反 応 に お い て 異 常 蓄 積 の 所 見 は 認 め ら れ
ず，陰性 コ ン トロ ール 実験 で は 陽性反 応 は 認 め ら
れ なか っ た （図 一2K ， L ）．組織 の 保存 状 態 や切
片作 成過 程 が 比較 的 良好 な 6症例 の み を選択 し て
検 討 し た ． し か し ，それ らの 6 症 例 に お い て も，
表・2 免疫組織化学に 用 い た 一次 抗体
抗 体名 会社名 抗 体作成 動物種類 希釈倍率 熱処理
Advanced Glycation End Preducts
Cathepsin D
Amyloid β
一Precursor Protein
Ubiquitin
CalretLnin
Nitrotvrosine
α
一Synuclein
PHF −TauTauSingle
Stranded DNA
TRANSGENIC
NEOMARKERS
ZYMEDCHEMICON
DAKOCHEMICON
CHEMICON
DAKOCHEMICON
DAKO
MouseMouseMouseMouseMouseRabbitRabbitMouseRabbitRabbit1：10001
：601
：5001
：40001
：501
：1001
：20001
：5001
：5001
：400
ACACACACMWACACACAC
（
一）
AC ：121 ℃ ．5min オ
ート ク レ ブ処理．
MW ： 10mm ［｝1／L ク エ ン 酸緩 衝液 ，
pH6 ，0 で の マ イ ク ロ ウ ェ
ーブ 処 理
（500W ，5min × 3 ）．
表 ・3 免疫組織化学染色所見
網膜組織 AGE CathepsinD APP Ubiquit正n Calretinin Nitrotyrositie a ・synuc回 n PHF −Tau Tauss −DNA
光 受容体細胞 層
外 境界膜
外 顆 粒層
外網状層
内顯 粒層
内網 状層
神 経節細胞層
神経 線維層
内境界膜
十 十 十
十十十
十 十 十
十十 十
十十 十
十 十 十
十十 十
＋
士
＋
一
＃
十
±
十一
十｝
十
十
十一
±
十一
十 十 十
十十 十
十 十 十
十一ト十
十十十
十 十 十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
十
＋
＋
＋
＋
幵
幵
幵
籵
±
±
士
IT
土
十「
±
十
十
十
十
十十十
十
十 十 十
十
十
，陰性 ± ，微 陽性 十 ，弱 陽性 十 十 ，中等度陽性 十十十 ，強陽性
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順 天 堂 医 学 51巻 2 号 （2005 ） 141
全 例 で網膜色素上 皮層 （retinal
pigment epithe −
lium ）は 剥 離 して い た た め 観察す る こ と が で き
な か っ た ．ま た ，
一
部の 症例で は光受容体細胞 層
（phtereceptor cell layer
，視細 胞 層 ；vi
’
sual
cell
layer）に つ い て も同様 で あ っ た ．以 上 6症 例の
網 膜 組 織の 免疫 組織 化学 的検討に よ れ ば 110 種
類の 全 て の 抗体に お い て 免疫活性 レ ベ ル の 差は 各
症例 間 で 若干 認 め られ た もの の ，全症 例 で 同様 の
傾向 が示 された ．
1．AGE
AGE は ，外網状層 （outer
plexiform layer ）
を除 く各層 に わ た っ て 強 陽性所 見 を認 め た ．特 に
光受 容体細胞層 ，外顆 粒層 （outer nuclear layer），
内顆粒層 （inner nuclear layer），神経節細胞 層
（ganglion cell layer）の 細胞 の 核 と細胞 質 に 強陽
性所見 を認 め た （図一2A ）．
2． カ テ プ シ ン D
カ テ プ シ ン D は ，外 境界 膜 （outer limiting
membrane ）と外顆粒層お よび 内顆 粒層の 一
部に
顆粒状の 弱陽性所見を認め た ． さら に ，神 経 節細
胞 層内の 神経 節細胞 の 細 胞質 に 中等度陽性所見 を
認 め た （図一2B ）．
3．APP
APP は ，観察す る こ とが で き た全 層に わ た っ て
非 常 に 弱 い 微 陽 性所 見 が認 め られ た （図 一2C ）．
麟籬難
餾
A 欝
町一 ’；
’
lt
’
1
辷監 三．点 ．＿＿＿．＿＿＿＿ ＿ 纛
懸覊 欝 飜蕪
鑼 覊 ．鐸 竃
図 一2 免疫組 織化学 所見 （× 100 ）
A ：抗 AGE 抗体 B ：抗 Cathepsin D 抗体 C ：抗APP 杭体 D ：抗 Ubiquitin抗 体 E ： 抗 Calretinin抗 体 F ：抗 Nitrotyrosine抗
体 G ：抗 α
・synuclejn 抗体 H ：抗 PHF −Tau 抗体 1 ：
抗Tau 抗体 」：
抗 ss DNA 抗体 K ：
陰性対 照 一ユ L ：陰性対照 一2
（D を除 く A 〜R ： 62歳 症 例 ，D 二 78歳症例 よ り ）
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142 李他 ：高齢者 網 膜 の 免疫組 織化学 的 検討
4．ユ ビ キ チ ン
ユ ビキチ ン は ， 外顆粒 層 ， 内顆粒 層の
一
部 と神
経 節細胞 層 の 種 々 の 細胞 の 核 と細胞 質に 強陽性所
見 を認 め た ．網 膜色 素上 皮層 の み な らず光受容体
層の
一
部 に つ い て も剥 離 ・破壊 さ れて い た た め ，
観察 は で き な か っ た （図 一2D ）．
5．カ ル レ チ ニ ン
カ ル レ チ ニ ン は ，神経 節細胞 層 と内顆 粒層 の
一
部 の 細胞 お よび 内網 状層 に 強 陽 性所 見 を認 め た
（図・2E ）．
6．ニ トロ チ ロ シ ン
ニ トロ チ ロ シ ン は ，光 受容体 細胞 層 か ら神経 線
維層 （nerve fiber layer）まで
一部の 神 経節細 胞
を除 い て ，中等度陽性 所見 を認 め た （図 一2F ）．
7． α
一シ ヌ ク レ イ ン
α
一シ ヌ ク レ イ ン は ，光 受 容体細 胞 層 か ら 外網
状層 が弱陽性所 見 を認 め た 、内顆粒層 の 無軸索細 胞
（amac 血 e cem に 強陽 性所 見 を示 した （図 一2G ）．
8．PHF −Tau
PHF −Tau は ，観察 する こ と が で きた全層 に わ
た っ て 非常に弱い 微陽性所 見で あっ た が ， 内顆 粒
層の 神経細胞 の
一
部 に の み 弱 陽 性所見 を認 め た
（図一2H ）．
9．Tau
Tau は ， 観 察 す る こ と が で き た全層 に わた っ て
陽 性所兒 を示 し ，特 に内顆 粒層 と神経節細胞層 に
強陽性所見 を認 め た （図一21）．
10．ss −DNA
ss −DNA は ，観察する こ とが で きた全 層 にわ た っ
て 陽性所見 は認 め なか っ た （図 一2J ）．
考 察
非 痴呆高齢 者 の 網膜 に お ける 中枢神 経 系の 老化
あ るい は AD の 病態 関連物質 に 関 す る免疫組織 化
学的 検討 を行 っ た．そ の 結果 ，こ れ らの 物 質 の 網 膜
組織 内に お け る発現 レ ベ ル や局在 を明 らか に した ，
Hinton ら lo ）11 ）
は ，AD 患者 の 網 膜 ・視 神経 に
お い て も視神経 の 広 範 な 軸索変性 ， 網膜 の 神経 節
細 胞 の 減少 お よび神経線維層の 厚 さの 狭小 な ど を
見 出 した ． しか し ，AD 患 者の 脳 内に 特徴 的 に認
め られ る細胞 内に 蓄積する神経原線維変化 ，ア ミ
ロ イ ド塊 を 中心 に 種大変性神 経突起 や グ リア反応
を伴 う成熟型老 人 斑 、血管 ア ミ ロ イ ド沈着な どの
所見は 認 め な か っ た と報 告 し た ． さら に ，Blanks
ら
10 ）12 ）／3）も ，AD 患者の 網膜 に お け る神経節細
胞質内の 空包 化 に よっ て 特徴づ け られ る変性所 見
を報告 して い る ．
一
方 ，非痴呆高齢者の 網膜 につ
い て は ，加齢 に 伴っ て 網膜色索上皮 は 変性する こ
とが知 られ て い る 14 ）
． し か し ，本研 究 で は ，全
症例 で 網膜色 素上皮層 が 実験 の 手技 上 の 問題 と考
え られ る剥 離 が生 じ て い た た め に ，加齢 に 伴 う網
膜 色素 上皮 の 変 化の 有 無 に つ い て は検 討す る こ と
が で き な か っ た ．
AGE は グ ル コ ース な どの 還 元 糖 と蛋 白質 と の
間の 非 酵素的糖化反 応 （メ イ ラ
ー ド反応 ）の 後期
段 階 で 生 成 す る 構 造 体 の 総称 で あ る ．AGE は ，
主 と し て 高血 糖状 態 下に 生 成 され ， 糖尿病合併症
（糖 尿病 性網膜症 な ど ）の 発 症 ・進 展 の 原 因の
一
つ と して 注 目 され て い る ． また ，AGE は正 常範
囲内の 血糖値 に おい て も次第 に蓄積 し ，老人 性白
内障 ・動脈硬化な どの 生理 的 な加齢性変化に も影
響 を及 ぼ す こ と が分 か っ て き た ．AGE は 中枢神
経系の ニ ュ
ーロ ン や 血 管系細胞に加 齢に 伴っ て 蓄
積 す る こ と が報 告 され て い る 15 ）
．老 化関 連封 入
体で あ る リポ フ ス チ ン顆 粒
・ア ミロ イ ド小体 ・平
野 小体 ・顆粒空砲変性 な どに もAGE が 認め られ
る こ と か ら ，AGE と脳 の 老 化 と の 関 連 が 推 察 さ
れ て い る ． さ らに ，AD な どの 神経変性疾患 の 発
症 ・進 行へ の 関与 も明 らか に な りつ つ あ る ．最近
で は ，AD 患者脳 の SP や NFT に も AGE の 蓄積が
認 め られ て い る との 報告 5 ）もな さ れ て い る こ と
な どを併 せ て考 慮すれ ば，加齢 ・老 化を危 険因子
とす る慢 性疾 患 に AGE が深 く関 与 して い る と考
え られ て い る． し か し ，本 研 究 に 用 い た 抗 AGE
モ ノ ク ロ ーナ ル 抗体 （clone No ．6D12 ， トラ ン ス
ジ ェ ニ ッ ク 社 ）の 主要 な エ ピ トープ は ，N 一カ ル
ボ キ シ メ チ ル リ ジ ン N −carboxymethyl lysine
（CML ）で あ り，
CML を特異 的に 認 識す る こ と
が 確認 さ れ て い る ．CML は ，そ の 生 成 に 糖化
N 工 工
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順 天 堂 医 学 51巻 2 号 （2005 ） 143
（glycation ）と酸化 （oxidation ）が 関与 し て い る
た めglyoxidation
productsと も称 され ，生体 内
の 酸 化 ス ト レ ス マ
ーカ ーで もあ り，中枢 神経系 の
ニ ュ
ーロ ン 内で は 領域 に よ る 特徴 は 存在 す る もの
の 加 齢 と と もに 蓄 積量 が 増加 す る こ とが 知 られて
い る
16 ）．CML は 生体 内に 存在 す る全 AGE の 数 ％
に 過 ぎ ず ，どの よ うなAGE 構造物 が 各 種慢 性 疾
患 の 発症 ・進 展 に 関 わ っ て い るの か は い まだ 明 ら
か で は な い が ，本研 究 と同
一の 抗 体 を用 い た 免疫
組織 化学 的検討 に よれば ， 水晶体 （加齢 に 伴 い 増
加 ）・糖尿 病性腎 症 や慢 性 腎不全 患省 の 腎近位 尿
細管
・
糖尿病患者の 網膜
・
糖尿病性神経障害愚 者
の 末梢神経 ・粥状 動 脈硬 化病変部お よび AD 患者
脳 の SP な どに 免疫活 性陽性所見 を認 め た とす る
報告 が あ る 17）
．本研 究 で は ，全症例で 網膜の 外
網状層 を除 く各層の 細胞 を中心 に強 陽性所見 を認
め て い る．本 結果 に よれ ば ，少 な くと も痴呆 ・糖
尿病
・
慢 性腎不 全 の な い 高 齢者 の 網 膜 に お い て
も，加 齢に 伴 う CML の 発現 が認 め られ る こ とが
示唆 され ，そ の 網 膜 局在 を明 らか に し た ．．
酸 化 ス トレ ス とは ，有 害 な 活性酸 素種 reactive
oxygen species （ROS ）や 活性窒素分 子種 reac −
tive nitrogen species （RNS ）の 発生 と こ れ らか
ら生 体 を防護す る た め の 機能の バ ラ ン ス が崩 れ ，
前者が 優勢 に な っ た 状態で あ る． この 酸化ス トレ
ス の 指 標 と され るニ トロ チ ロ シ ン は ，
一
酸化 窒
素 （NO ）と ス ーパ ーオ キ サ イ ド （02 −
）の 反応
に よっ て 生 じ る細胞 毒性 の 強 い ペ ル オ キ シ ニ トラ
イ ト （peroxynitrite ，
ONOO ’
）が 蛋白質中の チ
ロ シ ン 残基 をニ トロ 化 した 結果 の 産物 で あ る ．こ
の ニ トロ チ ロ シ ン は ， 微小 管 （microtuble ）の 形
成不 全 を 介 し て 細胞 傷害 を きた す こ と が 知 られ ，
AD に お い て もその 病態 に 密接に 関与 して い る こ
と が示 唆 され て い る
18 ）．本研 究で は ，非痴 呆 高
齢者 の 網膜 の 光受容 体細 胞層か ら神経線維層に お
い て
一
部の 神経節細胞 を除 く多 くの 細胞 に 中等度
陽性 所見 を認 め て お り，生理 的 な加齢 に お い て も
潜在的 な細胞傷害 を形成 し て い る 可 能性 ある い は
細胞 の 減少 （細胞死 ）に関 わ っ て い る可 能性 が示
唆 され た ． しか し ，細胞死の な か で もア ポ ト
ーシ
ス apoptosis （プ ロ グ ラ ム 細胞死 ；programmed
cell death ）の 指標 の 1 つ と され る ssDNA 免疫活
性 は陰 性 で あっ た ．
AD 患 者 脳 に 特 徴 的 な 病 理 所 見 で あ る SP や
NFT の 主 要 な構成 成分 は A βや Tau で あ り，こ れ
ら に 関連す る APP や Tau ，
PHF −Tau の 検索結果
で は ，Tau が 神 経 節細 胞 に 強 く発現 して い た が ，
タ ウ オパ チ
ー （tauopathy ）の よ うな異 常 蓄積 を
示 す所 見 は認 め られ な か っ た ．Tau は正 常な 神経
細 胞 で は微小 管 に 関連 す る輸 送機 能 に重 要 な機 能
を果 た し ，神 経機 能 が 正常 に 働 くた め に は な くて
は な らな い 蛋 白で あ り，AD 脳 に お い て は ，正 常
な Tau に 比べ か な り の 量 の 異常 に リ ン 酸 化 さ れ
た Tau が 増加 ・蓄積 され て い る こ と が 明 らか に さ
れ て い る
19 ）
．今回 の 非痴呆高齢者網膜 に お け る
組 織 内分 布 をみ る と ，PHF −Tau の 強 い 発 現 は な
かっ た ． しか し ，
一
部の 神経細胞 で PHF −Tau が
陽 性 を示 し た こ とは ，AD 患者 の 脳 内に 生 じ て い
る A βや PHF −Tau の 蓄積の レ ベ ル に は 至 らな い
もの の ，非痴 呆高 齢者 の 網膜 に お い て も ，こ れ ら
の 発現 が 弱 い なが ら も認め られ た こ と は 網膜 の 加
齢 に お け る変化 に もAPP や PHF −Tau が 関与 して
い る こ とが示 唆 され た ．今後の 研 究 で AD 症例 の
網膜神経細胞 に お け る 異常 な リ ン 酸化 タ ウの 増
加
・
蓄積の デ ータが 得 られ れば ，診 断 の 手 が か り
の
一つ に な る可能性 が考 え られ る ．
α
一シ ヌ ク レ イ ン は ，
レ ビ
ー
小体の 主要構成成
分 で ある が ，AD 脳の 病 態 へ の 関与 が示 唆 され て
い る 20）21＞．本研究で は ，網 膜 内顆 粒層 の 無軸 索
細 胞 に 陽性所見 を認 め た ．パ ーキ ン ソ ン 病に お い
て も何 ら か の 原因で コ ン フ ォ メ
ーシ ョ ン異常 を生
じ ，神経 細胞 中に蓄 積 し T 細 胞死 を導 くこ とが 報
告 され て い る ． α
一シ ヌ ク レ イ ン の 機能 は 未 だ不
明で あ る が ，正常脳 の シ ナ プ ス 前末 端 に 豊富 に 存
在す る可 溶性蛋白で あ る こ とか ら ，本研 究結果 と
併せ て 考慮すれ ば ，
非 痴呆 高齢者網 膜 に も存在 し ，
加 齢に よる変化あ る い は 何 らか の 機能に 関与 して
い る こ と が示 唆 され た ．
Rakocz￥らは ，眼疾 患 の ない 40 歳代 か ら90 歳
代 の 網膜 組織 に お い て ，カ テ プ シ ン D の 発現 が 認
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144 李他 ： 高齢者網膜 の 免疫組織化 学的検 謝
め られ る こ と ，加 齢 に よる 減弱 は 認 めな か っ た こ
と を報 告 し て い る
22 ）．また ，細胞 内 の 不 用 な ポ
リ ペ プ チ ド鎖 は 可 溶性で あれば ユ ビ キチ ン ープ ロ
テ ア ソ ーム 系 で分 解 され ，不溶性 で あれ ばオ
ー ト
フ ァ ジ ー
（自食作用 ）に より リ ソ ゾ ーム 系で 分解
され るこ とが 示 され て い る ．多 くの 神経 細胞 死 で
オ ー トフ ァ ジ ーが 誘導 され ， 特 に 小胞体 ス トレ ス
との 関連性 が 高 い よ うな 脳虚 血 に 伴 う遅 延型 神経
細 胞死 で は ， リ ソ ゾーム ／ オ ー トフ ァ ジ ーが 関与
す る積極 的細 胞死 で あ る こ とが 明 らか に され て い
る
23 ）．最 近 で は ，脳 虚 血 の み な らずハ ン チ ン ト
ン 病 や AD 患 者脳 に お い て もそ の 存 在が 指摘 さ
れ ，リソ ゾーム の カ テ プ シ ン群 ，特 に カ テ プ シ ン
D が 細胞 死 促進 因子 と して 働 くこ と も分 か っ て き
た 24 ）．本 研究結果に お い て も神経 細 胞 層内の 神
経節 細胞 に お い て カ テ プ シ ン D の 中等度陽性所見
の み な らず ユ ビ キ チ ンの 強 い 陽 性反応 発 現 が非 痴
呆高 齢者 の 網膜 に 認め られ た こ と は ．Rakoczy ら
の 報 告 を支持 す る もの で あ る．
カ ル レ チ ニ ン は ，カ ル シ ウ ム 結 合 蛋 白 （calci −
um binding
protein）の 一
種で あ り ，細胞 内カ
ル シ ウ ム イ オ ン 上昇時の 緩 衝作 用 を有 し ，カル シ
ウ ム ホ メ オ ス タ ーシ ス の 維持に 寄与 し て い る こ と
が知 ら れ て い る ．中枢神経系で は GABA 作動性
神経 の
一
群 に 多 く存 在 し ，網膜 に も発 現 が報 告 さ
れ て い る 25）26）．本研 究 で も，神経 節細 胞層 と内
顆粒 層の
一
部 の 細胞 お よび 内網状 層 に 強 陽性 所 見
を認 め て お り ，従来の 報告 を ほ ぼ 支持す る結果 が
得 られ た ．
本研究に よ っ て 非痴呆高齢・
者網膜 組織 に お け る
細胞 の 老化 や AD 病態に 関連 する物質の 発現 お よ
び 局 在 に 関 する知 見 が 得 られ た が ，検 討組 織数 が
い まだ少数 で あ り，更 な る今後 の 検討 が 必 要で あ
る． また ，今後の 展望 と して は ，AD 症例や 若年
非痴 呆症例 の 網膜 に関 す る詳細 な研究 が必 要で あ
る と考え られ た ．
結 語
非痴 呆高齢 者の 網膜 に お け る 中枢神経系の 老 化
および AD 患者 脳 の 病態 に 関連 す る 10種類の 物 質
につ い て 免疫組織化 学的検索 を行 っ た ．そ の 結果 ，
こ れ らの 物質の 発現 や 網膜組織内に お け る局在分
布 を詳 細 に 明 らか に した ．
本 研究 を進 め る に あた り ，実験 等 の ご指 導 ご協
力 を い た だ い た 順天 堂大学 医学 部精 神医学 講座 の
板倉 省 子氏 に 厚 く感 謝の 意 を表 す ．
文 献
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10. Juntendo University
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146 mfte: rtrctxu"suopteRwt&fttsptf,if
Summary
'
Immunohistochemicalstudy of proteins related to the pathophysiologyof Alzheimer's
diseaseinthe human retina of elderly patientswithout dementia.
Objective: The pathological featuresof Alzheimer'sdisease(AD )includeneuritic plaques
(NP )composed of amyloid-beta peptide (AP )fibrils,neurofibrillary tangles(NIJ"I')ofhy-
perphosphorylated Tau, and neurotransmitter deficits.Human retinal synapses directlyas-
sociate with the central nervous system (CNS )through theoptic nerve, and the bilateraloptic
nerves are both derivedfrom the same origin, neural ectoderm. Therefore,itispossible th'atthere
would be neuropathological changes intheretina ofAD,patient$ similqr to those inthe CNS. As
there are age-related changes observed inthe retina, itwould'be impgrtantto investigatethe lo-
cation of protein$ related to the neurodegeneration and pathophysiology ofAD inthe retina. In
this study ,
we investigatedthe existence and expression pattern of AD-relatedneuropatholeg-
icalchanges inthe retina and optic nerve of elderly patients without dernentia.
Subjectsand methods: Retinalsamples of six individualswithout dementiawere obtained
from the eye bank ofJuntendo Universityhospital.The mean age ± SD was 68.3± 6.1years.By
immunohistochemical analysis ,the presence of ten kinds of proteins related to neurodegener-
ation and AD pathology (advanced glycationend-products , cathepsin D , amyloid P -precursor
protein , ubiquitin , calretinin, nitrotyrosine , a -synuclein , PHF-Tau, Tau, single stranded
DNA )were detectedusing separate antiboclies,
Results: We foundthatPHF-Tau, an importantcomponent of amyloid P -precursorprotein and
a major component of NP and NFI", was strongly expressed in the retina except for single-
stranded DNA. Other proteins also shewed medium to strong signals with particular patterns.
Conclusion: These findingsdemon$trateforthe firsttime the locationof proteinsrelated to
AD inthe retina of elderly patients without dementia, indicatinga relationship between the ag-
ingprocess and neurodegeneration inthehuman retina. Furtherneuropatho]ogical studies of the
retina from bothyoung patientswithout dementiaand patientswith AP should be investigated
inthe future.
Keywords : elderlyperson , Alzheimer'sdisease(AD ), retina,
immunohistochemistry, aging process