Download to read offline
Uploaded byBioinformaticsInstitute
No56 matrichnye processy
Документ описывает молекулярную биологию, включая процессы репликации, транскрипции и трансляции, а также роль ДНК, РНК и белков в жизни клетки. Приведены основные эксперименты и открытия, которые подтвердили генетическую роль ДНК и механизмы репликации и транскрипции. Упоминается высокая точность различных ДНК-полимераз и их функции в процессе репликации у прокариот и эукариот.
More Related Content
Similar to No56 matrichnye processy
No56 matrichnye processy
- 1. Молекулярная биология для биоинформатиков •Академический университет • Ефимова Ольга Алексеевна В презентации выборочно использованы слайды из курсов «Биохимия» и «Молекулярная биология» и «Молекулярная генетика СПбГУ
- 2. • Репликация • Транскрипция •Трансляция Лекция 5,6 – Матричные процессы Направление матричных процессов всегда соответствует 5’ – 3’, т.е. присоединение новых нуклеотидов происходит на 3’ конце
- 3.
- 4. Жизнь зависит от3 молекул • ДНК – Содержит информацию о работе клетки • РНК (мРНК) – Передает эту информацию в различные части клетки – Служит матрицей для синтеза • Белки – Образуют ферменты, катализирующие различные процессы в клетке – Образуют основные структурные компоненты живого организма
- 5. ДНК: основа жизни •Деоксирибонуклеиновая кислота • Полимерная молекула – Углеводно-фосфатный скелет – Основания одной цепи соединяются с другой цепью путем водородных связей
- 6. Двойная спираль ДНК •Модель Уотсона-Крика – Используя рентгеновские снимки структуры ДНК • В соответствии с этой моделью ДНК: – Спираль из 2 комплементарных анти-параллельных цепей – Правозакрученная – Стабилизованная водородными связями – Основания находятся внутри спирали • Пуриновые основания образуют водородные связи с пиримидиновыми.
- 7. Доказательства генетической ролиДНК Трансформация бактерий. Ф.Гриффитс, 1928 г. – доказал, что ДНК способна переносить наследственные свойства между штаммами пневмококков S-форма – патогенна для мышей, имеет полисахаридную оболочку, образует гладкие блестящие колонии на питательной среде. Формы: IS, IIS, IIIS и т.д. R-форма – непатогенна для мышей, нет полисахаридной оболочки, образует шероховатые колонии на питательной среде. Формы: IR, IIR, IIIR и т.д. Если ввести мышам убитые нагреванием клетки формы IIIS и добавить живые клетки IIR, то мыши погибают и из их трупов можно выделить клетки IIIS. Следовательно, живые клетки IIRтрансформируются в присутствии убитых нагреванием клеток IIIS, приобретая свойства патогенности. О.Эвери, К.МакЛеод, М.МакКарти, 1944 г. – идентифицировали трансформирующий агент как ДНК.
- 8. Доказательства генетической ролиДНК PLAY Размножение бактериофагов. А.Херши, М.Чейз, 1952 г.
- 9. Репликация ДНК • Доказательстваполуконсервативного способа репликации ДНК (Meselson, Stahl, 1958) • Ферментативный аппарат репликации ДНК
- 10.
- 11. Использовали колонии бактерийE.coli, которым давали единственный источник азота – 15NH4Cl М.Мезельсон, Ф.Сталь предложили спопоб, позволяющий различать исходные молекулы ДНК и молекулы-потомки: Равновесное центрифугирование в градиенте плотности CsCl. Для мечения вновь синтезируемых молекул использовали утяжеляющую метку - 15N
- 12. Эксперимент Мезельсона иСталя Градиент: 1,66 – 1,76 г/см3 Центрифугирование в течение 50 – 60 часов при 100 000 g приводит к формированию градиента плотности CsCl и образованию полос ДНК Увеличениеплотности в
- 13. :Исходная ДНК /тяжелая тяжелая 1-:епоколениевся тяжелая/легкая 2- :епоколение 2 тяжелые/легкие 2 /легкие легкие 3- :епоколение 2 тяжелые/легкие 6 /легкие легкие Центрифугирование в течение 50 – 60 часов при 100 000 g приводит к формированию градиента плотности CsCl и образованию полос ДНК Репликация Репликация Репликация
- 15.
- 16. В 1958 г.А. Корнберг открыл ферментативную реакцию синтеза ДНК из мономеров путем конденсации нуклеотидтрифосфатов и впервые выделил из клеток E.coli фермент ДНК- полимеразу I. Нобелевская премия, 1959 г. А. Корнберг (1918) Трехмерная структура фрагмента Кленова ДНК- полимеразы I
- 17. Участники реакции: ОН 1. Матрица 2.Затравка 3’-ОН (праймер) 3. Нуклеозидтрифосфаты 4. ДНК зависимая ДНК-полимераза
- 18. Впоследствии было открытоеще 2 полимеразы: ДНК-полимераза II ДНК-полимераза III Истинной репликазой оказалась ДНК-полимераза III Но: ни одна из ДНК-полимераз не может начать синтез сама, всем требуется затравка – наличие свободной –ОН группы
- 19. СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-ПОЛИМЕРАЗE.coli ДНК-полимеразы IV и V (1999) вовлечены в необычные формы репарации ДНК
- 20. CУБЪЕДИНИЧНЫЙ СОСТАВ ХОЛОФЕРМЕНТАДНК- ПОЛИМЕРАЗЫ III E.coli
- 21. Структура ориджина репликации (ori)E.coli Инициация репликации (E.coli)
- 22. Инициация репликации (E.coli) Связываниеинициаторного белка dnaA c ДНК OriC:
- 23. Присоединение геликазы ипраймазы
- 24. 3 Полимераза III 5’ → 3’ Лидирующаяцепь Пары оснований 5’ 5’ 3’ 3’ Общая схема репликации ДНК. Элонгация репликации Геликаза + Инициаторные белки ATP SSB-белки РНК-праймер праймаза 2Полимераза III Отстающая цепь Фрагменты оказаки 1 РНК-праймеры замещаются ДНК-полимеразой I, разрывы соединяются ДНК-лигазой
- 25. Как ДНК-полимераза перемещаетсяк точке начала синтеза нового фрагмента Оказаки?
- 26. БЕЛОК ФУНКЦИЯ МОЛ.ВЕС kDa Элонгациярепликации Геликаза (Dna B) Расплетание двойной цепи 300 SSB Связывает одноцепочечную ДНК 75,6 ДНК-полимераза III α Элонгация вновь образующейся цепи полимеразная активность 130 ε корректирующая 3’-5’- экзонуклеазная 27 β скользящий зажим 40 δ γ загрузчик зажима (clamp loader) 32 52 τ димеризация кора 71 χ Взаимодействие с SSB-белками 16,6 ψ Взаимодействие с γ и χ субъединицами 15,2 θ ? 10 ДНК-полимераза I удаление РНК-праймеров 103 ДНК-лигаза соединение разрывов в отстающей цепи 74 ДНК-топоизомераза II Снятие торсионного стресса при расплетании 400
- 27.
- 28. За корректирующую активностьответственна ε- субъединица ДНК-полимеразы III
- 29.
- 30.
- 31.
- 32. Хромосома E. coli(4,2 млн. нуклеотидов) – один репликон 84 min C
- 33. Организация области терминации репликацииу E. coli tus (tbp) 36 кДа aattagtatgttgtaactaaagt
- 34. Завершение репликации Топоизомераза 2 (гираза) (gyrAи gyrВ) Топоизомераза 4 (parCи parE)
- 35. Две репликационные вилкидвижутся в противоположном направлении Окончательное разделение молекул ДНК происходит с участием топоизомераз; Образуются суперспирализованные молекулы Репликация с образованием θ- структуры PLAY
- 36. Репликация кольцевой ДНКу прокариот начинается в локусе OriC, заканчивается в области TerC. Инициатором репликации является белок DnaA. Репликацию ДНК осуществляет реплисома - динамичный мультисубъединичный белковый комплекс. Взаимодействие субъединиц ДНК-полимеразы III с другими белками реплисомы увеличивает скорость и процессивность фермента. Репликация происходит в направлении 5’ 3’, одной цепи (лидирующей) неперерывно, другой (отстающей) – прерывисто. Репликация отстающей цепи включает дополнительные этапы: узнавание сайтов связывания праймазы, синтез праймеров, синтез фрагментов Оказаки, диссоциацию полимеразы, удаление праймеров, лигирование. Обе цепи реплицируются синхронно, что достигается взаимодействием ДНК-геликазы, ДНК-праймазы и ДНК-полимеразы и торможением синтеза лидирующей цепи во время синтеза праймеров.
- 37. Эукариотические ДНК-полимеразы: 1. Polymeraseα (alpha): nuclear, DNA replication, no proofreading 2. Polymerase β (beta): nuclear, DNA repair, no proofreading 3. Polymerase γ (gamma): mitochondria, DNA repl., proofreading 4. Polymerase δ (delta): nuclear, DNA replication, proofreading 5. Polymerase ε (epsilon): nuclear, DNA repair (?), proofreading 6. Different polymerases for nucleus and mtDNA 7. Some proofread; others do not. 8. Some used for replication; others for repair.
- 38. Множественные ориджины эукариот Вядрах млекопитающих при репликации обнаруживается до 150 центров репликации - «репликативных единиц», «репликативных фокусов» или «репликативных фабрик» В центрах репликации аккумулируются все белки, участвующие в этом процессе.
- 39. Возможно, ориджины высшихэукариот не содержат консенсусных последовательностей. Функционирование ориджина может определяться контекстом, структурой хроматина, локализацией нуклеосом. Общая закономерность структуры инициаторных участков – обогащенность АТ-парами. Инициация репликации у эукариот
- 40. Элонгация репликации ДНКу эукариотических организмов Replisome Polα primase holoenzyme Pol1 Cdc17 Polymerase priming; replication of lagging strands Polδ holoenzyme Pol3 Cdc2 Bidirectional replication Polε holoenzyme Pol2 Cdc20 Bidirectional replication Rfc1-5 complex PCNA clamp loading PCNA Pol30 Polymerase clamp RPA1-3 complex SSB SSB coats ssDNA
- 41. Свойства ДНК-полимеразы альфа Относится к семейству В ДНК-полимераз. Высокая точность репликации (1 ошибка на 106 ) Обладает активностью праймазы и инициирует синтез ДНК de novo. Продуктом реакции является РНК-ДНК праймер (40 нуклеотидов, 10 из которых РНК) Низкая процессивность Активность зависит от фосфорилирования субъединиц. Фосфорилирование в начале S-фазы, дефосфорилирование при выходе клетки из митоза Нет 3’-5’ экзонуклеазной активности Взаимодействует с ORC-комплексом и, возможно, с RPA (replicative protein A)
- 42. Свойства ДНК-полимеразы дельта Относится к семейству В ДНК-полимераз Высокая точность репликации Дельта-полимераза нужна для репликации обеих цепей Низкая процессивность (10-20 нуклеотидов), которая увеличивается при взаимодействии N-конца каталитической субъединицы с белком PCNA (proliferating cell nuclear antigen) Обладает 3’-5’ экзонуклеазной активностью, которая повышается в присутствии белка RPA
- 43. Свойства ДНК-полимеразы эпсилон Относится к семейству В ДНК-полимераз Высокая точность репликации Эпсилон-полимераза присутствует в вилке репликации, может заменять полимеразу-дельта на отстающей цепи Высокая процессивность Обладает 3’-5’ экзонуклеазной активностью Фосфорилирование в S-фазе не влияет на активность
- 44. Свойства белков, участвующихв элонгации репликациии RPA – гетеротример, имеет 4 ДНК-связывающих домена, стимулирует активность геликазы (МСМ), необходим для сборки праймосомы, функциональный гомолог ssb E. сoli. RFC – комплекс 5 белков, катализирует присоединение PCNA к ДНК для начала синтеза фрагмента Оказаки, функциональный гомолог γ-комплекса E. сoli. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) – гомотример, третичная структура одинакова у всех эукариот, функциональный гомолог β-субъединицы ДНК-полимеразы III E. сoli.
- 45. Проблема репликации теломерных участковхромосомы PLAY
- 46. Транскрипция • ДНК-зависимый синтезРНК – транскрипция • Ферментативный аппарат транскрипции – ДНК-зависимая РНК-полимераза • Этапы транскрипции: • инициация, • элонгация, • терминация
- 47.
- 48. ДНК РНК A T GC U A C G ││ ││ │││ │││ Матричный процесс Образуются Уотсон-Криковские пары РНК-продукт не остается комплементарно связанным с матрицей; по окончании синтеза двойная спираль восстанавливается; одноцепочечная РНК высвобождается; синтезированные РНК – копии ограниченных Участков ДНК
- 49.
- 50. ПРОДУКТЫ ТРАНСКРИПЦИИ ПРОКАРИОТ •Матричные РНК (мРНК) – короткоживущие посредники в процессе переноса информации от ДНК к белку • Рибосомные РНК (рРНК) – компонент рибосом и рибонуклеопротеиновых частиц • Транспортные РНК (тРНК) – доставка аминокислот к рибосомам
- 51. ПРОДУКТЫ ТРАНСКРИПЦИИ ЭУКАРИОТ •ГетероядерныеРНК– предшественники мРНК (mRNA) •Рибосомные РНК (rRNA) • Транспортные (tRNA) • Малые ядерные (snRNA) – компоненты сплайсосомы и др.функции • Малые ядрышковые РНК (snoRNA) – процессинг рРНК и тРНК • МикроРНК (miRNA) – напр., индукция и супрессия опухолей •Малые интерферирующие РНК (siRNA), ассоциированные с повторами
- 52.
- 53. Инициация транскрипции у прокариот Ненужна затравка Синтез начинается с определенного нуклеотида (+1) Начало синтеза определяется промотором За узнавание промотора ответственна σ-субъединица Направление синтеза 5’→3’
- 54.
- 56. Рибонуклеотид трифосфаты Полимераза слабо связывается спромотором, формируя закрытый комплекс Полимераза связывается более плотно, ДНК расплетается в области -10, формируется открытый комплекс. После начала синтеза РНК, как только полимераза минует промотор, σ- субъединица диссоциирует Промотор РНК-полимераза Инициация транскрипции
- 57.
- 58. Элонгация транскрипции Двуцепочечная ДНК Кор РНК-полимеразы Рибонуклеозид трифосфатыЦепь ДНК-матрицы Новаяцепь РНК НАПРАВЛЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ
- 60.
- 61.
- 62.
- 63.
- 64. 2006 г. Нобелевскаяпремия по химии присуждена Роджеру Корнбергу (Roger Kornberg) за фундаментальное исследование механизма копирования клетками генетической информации (транскрипции) эукариот на на молекулярном уровне.
- 65.
- 66.
- 68.
- 69. Процессинг РНК: 1. ПроцессингрРНК и тРНК: выщепление под действием эндонуклеаз из высокомолекулярного предшественника (прокариоты, эукариоты) 2. Процессинг иРНК (только эукариоты): кэпирование полиаденилирование сплайсинг редактирование
- 70. СХЕМА ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ ПРЕ-МРНК Кэп(модифицированный гуанилат) ЭКЗОНЫ ИНТРОНЫ
- 71.
- 72.
- 73.
- 74. Трансляция (биосинтез белка) •Особенности генетического кода • Основные этапы трансляции: • Активация аминокислот (особенности структуры тРНК, синтез аминоацил-тРНК); • Инициация (структура рибосом, белковые факторы, синтез первой пептидной связи); • Элонгация; • Терминация; • Процессинг белка. Пост-трансляционная модификация – добавление липидов, сахаров, фосфатов, сульфатов и.т.д.
- 76. Robert W. HolleyHar Gobind Khorana Marshall W. Nirenberg The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1968 "for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis"
- 77.
- 78. Расшифровка генетического кода Мутационныйанализ: точечные мутации приводили к замене одной АК Бесклеточные системы трансляции PolyA - пролин PolyС - лизин Cинтетический полинуклеотид (AAG)n может быть прочитан с трех рамок считывания Трансляция на рибосомах в бесклеточной системе полилизин полиаргинин полиглутамат
- 79.
- 80. 5’ – AT G C C T A G G T A C C T A T G A – 3’ 3’ – T A C G G A T C C A T G G A T A C T – 5’ 5’ – A U G C C U A G G U A C C U A U G A – 3’ 5’ – A U G C C U A G G U A C C U A U G A – 3’ N-Met - Pro - Arg - Tyr - Leu-C DNA Транскрипция Трансляция mRNA Белок
- 81.
- 82.
- 83.
- 84. The genetic code •consists of 64 triplet codons (A, G, C, U) 43 = 64 • all codons are used in protein synthesis • 20 amino acids • 3 termination (stop) codons: UAA, UAG, UGA • AUG (methionine) is the start codon (also used internally) • multiple codons for a single amino acid = degeneracy
- 85.
- 86.
- 87. Третичная структура тРНК Псевдоуридиноваяпетля Дигидроуридиноваяпетля Антикодоновая петля 3’-CCA-конец
- 88. Wobble-гипотеза Ф.Крика 1-й нуклеотид антикодона 3-йнуклеотид кодона
- 90. 1. Активация аминокислот.Синтез аминоациладенилата Аминоацил- тРНК- синтетаза Аминокислота 5’-аминоацил аденилат
- 91. аатРНК-синтетазы 1 класса Аминоацил- тРНК-синтетаза 1класса 5’-аминоацил аденилат 3’ конец тРНК 2.Аминоацилирование тРНК
- 93. There is adifferent Aminoacyl-tRNA Synthetase (aaRS) for each amino acid. Each aaRS recognizes its particular amino acid and the tRNAs coding for that amino acid. Accurate translation of the genetic code depends on attachment of each amino acid to an appropriate tRNA. Domains of tRNA recognized by an aaRS are called identity elements. Aminoacyl-tRNA Synthetases arose early in evolution. The earliest aaRSs probably recognized tRNAs only by their acceptor stems.
- 94.
- 96. СТРУКТУРА РИБОСОМ Субъединицы состоятиз рРНК и белков, соединяются только для трансляции
- 97. Компоненты рибосомы – Малая субъединица –16 S рРНК у прокариот и 18S рРНК у эукариот – Ее последовательность используется для установления эволюционного родства между организмами – + белки
- 98. Компоненты рибосомы II • Большаясубъединица (на примере прокариот) – 23 S rRNA – 5 S rRNA – 26 белков
- 99. Бороздка между субъединицами –Место связи анти-кодон-кодон – Пептидная цепь выходит оттуда тоже
- 100. Эукариотические рибосомы • 40S+ 60S – 18S, 28S + 5.8S rRNA +5S
- 101. Участки связывания тРНКна рибосоме • А-сайт: узнавание аминоацил-тРНК; позиционирование аминоацила. • Р-сайт: связывание инициаторной fMet-тРНК; связывание пептидил-тРНК при транслокации. • Е-сайт: выход деацилированной тРНК с 50S субчастицы.
- 102. Пептидная связь – Костякбелка – Функция белка определяется боковыми цепями аминокислот его составляющих
- 103. Инициация • Сборка рибосомы –70 S из 30S и 50S субъединиц у прокариот – 40S + 60S = 80S у эукариот • Требует факторов инициации • Требует (ф)метионил-тРНК
- 104. Комплекс инициации у прокариот •Требуются факторы инициации • Последовательность Шайна- Дальгарно (Shine-Dalgarno sequence,) — была описана австралийскими учеными Джоном Шайном и Линн Дальгарно и является сайтом связывания рибосом на молекуле мРНК прокариот, обычно на расстоянии около 10 нуклеотидов до стартового кодона AUG
- 105. Эукариотическая инициация • Эукариотичеккая мРНКимеет специальные белки на 5 ’ и 3 ’ конце (связываются с 5’ CAP и 3’ poly A) • Первый AUG после CAP – начало трансляции
- 107. Элонгация и терминация •Элонгация • Аминоацилированная тРНК устанавливается на рибосоме в месте кодона • Пептид переносится на эту тРНК • Цикл повторяется • Терминация – Стоп кодон соединяется со специальным белком вместо тРНК
- 108.
- 109. Процессинг • Начинается смомента синтеза белка • Требует специальных ферментов • Может происходить разрезание пептидной цепи с образованием конечного продукта (например, инсулин)
- 110. Посттрансляционные модификации белков •Формирование третичной структуры – фолдинг белка • Удаление сигнальной последовательности • Модификации N- и С- концов (удаление fMet, N-ацетилирование) • Ковалентные модификации аминокислотных остатков
- 111.
- 112.
- 113.
- 114. Основные этапы трансляции АКТИВАЦИЯАМИНОКИСЛОТ → ИНИЦИАЦИЯ → ЭЛОНГАЦИЯ → ТЕРМИНАЦИЯ тРНК Аминокислоты АТР, Mg2+ Амиоацил-тРНК- синтетазы мРНК; инициирую- щий кодон 30S субъединица; 50S субъединица Белковые факторы инициации (IF-1, 2, 3) fMet-тРНК GTP, Mg2+ мРНК Рибосома 70S Белковые факторы элонгации (Tu,Ts, G) Аминоацил-тРНК GTP Терминальный кодон в мРНК Белковые факторы терминации (RF) АТР ПРОЦЕССИНГ БЕЛКА (фолдинг, ограниченный протеолиз, ковалентные модификации)
- 116.
Editor's Notes
- #53 DNA/RNA distinction – vicinal hydroxyls, RNA should be unstable in order to exercise control
- #68 http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072507470/student_view0/chapter3/animation__how_translation_works.html
- #85 This table lists the important characteristics of the genetic code. There are 64 triplet codons - all used in protein synthesis (this includes the three stop codons). The AUG methionine codon is used for both initiation of protein synthesis and for internal methionines. Methionine and tryptophan are the only amino acids specified by single codons - all the rest have two or more codons, which is called "degeneracy." As seen in the next figure, there are five amino acids that are specified by only the first two nucleotides in the triplet codon because of this degeneracy, and three additional amino acids that are specified by a total of six different codons.