Methods for hemoglobin and glucose estimation, GOD-POD, Cyanmethemoglobin, urine routine biochemical tests, strip & test tube methods

1. 7. SOME BASIC CONCEPTS OF BIOCHEMISTRY FOR DMLT FIRST YEAR STUDENTS (U.
P. State Medical Faculty syllabus) in Hinglish
LESSON 7
[Hemoglobin, blood glucose estimation and urine routine examination]
HEMOGLOBIN (Hb or Hgb)
Hemoglobin (Mr 64,500) एक tetrameric protein (four polypeptide chains) है जो RBCs में होती है और
इसमें दो α (प्रत्येक chain में 141 amino acids) और दो β polypeptide chains (प्रत्येक chain में 146
amino acids) और प्रत्येक polypeptide chain(globin) से एक 'Heme' prosthetic group (जो ferrous iron
और porphyrin का एक complex होता है) जुड़ा होता है I
Forms of Hemoglobin - The normally occurring hemoglobins are:
● Hemoglobin A (adult hemoglobin) - α2β2 - 95% - found normally in adults.
● Hemoglobin A2 - α2δ2 - 1.5–3.5% in adults
● Hemoglobin F (fetal hemoglobin) α2γ2 - यह fetuses और newborn babies में लगभग 90%
समानुपात में पाया जाता है जो दो वर्ष क
े अंदर धीरे - धीरे कम होकर क
ु ल हीमोग्लोबिन का 1% हो जाता
है और व्यस्क क
े पूरे जीवन में 1% से भी कम रहता है I
Functions of Hemoglobin -
1. Hemoglobin lungs में oxygen को उत्क्रमणीय रूप (reversibly) से bind करता है क्योंकि वहाँ
oxygen concentration high होता है और इस तरह oxyhemoglobin बनता है जो body tissues
(जहाँ ऑक्सीजन का concentration कम होता है) को ऑक्सीजन deliver करता है जिससे
deoxyhemoglobin बनता है I
2. यह कार्बन डाइऑक्साइड का lungs और tissues क
े बीच विनिमय (exchange) को भी सुगम बनाता है
I
Methods of Hemoglobin estimation :
Hemoglobin estimation क
े कई methods हैं -
● Sahli’s or acid hematin method
● Cyanmethemoglobin method
● Sodium Lauryl Sulphate method(cyanide free method)
● Vanzetti Azide-methemoglobin method
● Oxyhemoglobin method
● Alkaline-hematin method
● Measurement of oxygen-combining capacity
● Measurement of iron content
1

2. Sahli’s or acid hematin Method -
जब Blood को N/10 HCl (0.1 N HCl) क
े साथ mix करते हैं हीमोग्लोबिन brown color क
े
acid hematin में परिवर्तित हो जाता है I अब इसे N/10 HCl से तब तक dilute करते हैं जब तक इसका color
hemoglobinometer क
े comparator box क
े brown color क
े समान नहीं हो जाता I हीमोग्लोबिन का
concentration g% में पढ़ा जाता है I यह एक बहुत सस्ता, तेज और आसान method है लेकिन इसमें क
ु छ
कमियाँ भी हैं, जैसे - कम accuracy, color matching करने में व्यक्तिगत विविधता, true standard का अभाव
और सभी प्रकार क
े हीमोग्लोबिन (जैसे - oxyhemoglobin, sulfhemoglobin) का HCl क
े साथ reaction करक
े
acid hematin में परिवर्तित नहीं होना आदि I
Cyanmethemoglobin method - यह हीमोग्लोबिन मापने का internationally recommended method है
I इस method का आधार (principle) इस प्रकार है : Blood को जब Drabkin's solution (जिसमें potassium
ferricyanide, potassium cyanide और potassium dihydrogen phosphate होते हैं) क
े साथ mix करते हैं
तो hemoglobin methemoglobin (मेथीमोग्लोबिन) में बदल जाता है जो potassium cyanide की उपस्थिति
में Cyanmethemoglobin (साइनमेथीमोग्लोबिन, HiCN) में बदल जाता है I यह साइनमेथीमोग्लोबिन 540 nm
पर maximum absorbance देता है और Beer-Lambert’s का कड़ाई से पालन करता है I Test sample क
े 540
nm पर absorbance को standard HiCN solution क
े absorbance से तुलना करक
े test sample क
े
hemoglobin concentration की गणना कर लेते हैं I
K3[Fe(CN6)]
Hemoglobin(Fe++) ------------------> Methemoglobin(Fe+++)
KCN
Methemoglobin(Fe+++)-----------> Cyanmethemoglobin(HiCN)
Reagent:
Drabkin's reagent -
In a 1 liter volumetric flask add :
Potassium ferricyanide K3[Fe(CN)6] - 200 mg
Potassium cyanide (KCN) - 50 mg
Dihydrogen potassium phosphate (KH2PO4) - 140 mg
Non-ionic detergent (e.g. Triton X-100) - 1 ml
Add distilled water to dissolve and dilute to 1 liter with distilled water. Check the pH which
should be 7.0 - 7.4. Store in a dark polythene bottle or brown coloured glass (actinic) bottle at 4
- 20 °C (do not freeze). Discard the solution if found to be turbid or the pH is outside range.
Cyanmethemoglobin (HiCN) standard -
Commercial HiCN standard (normally 60 mg/dl) calibrated with international standard solution
(primary calibrant) as per specifications defined by the International Council for Standardization
in Hematology (ICSH) is available.
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3. Procedure -
● सर्वप्रथम Drabkin's solution और standard solution को कमरे क
े तापमान (RT) पर आने देते हैं I
● एक साफ़ test tube में 5 ml Drabkin's solution लेते हैं (mouth pipetting नहीं करनी है)
● Blood sample (EDTA tube) को धीरे - धीरे inversion द्वारा अच्छी तरह mix करते हैं I
● एक micropipette द्वारा 20 µl blood लेते है, tip की बाहरी सतह पर लगे blood को बेहद सावधानी से
tissue paper की मदद से साफ़ करते हैं I
● Pipette की tip को test tube क
े Drabkin's solution में dip करक
े tip को कई बार rinse करते हैं, जैसा
नीचे चित्र में दिखाया गया है, जिससे tip क
े अंदर का पूरा blood solution में आ जाए :
● Tube को अच्छी तरह mix करते हैं (vortex mixer की सहायता ले सकते हैं) और कम से कम 5
minutes क
े लिए छोड़ देते हैं I
● Colorimeter या spectrophotometer पर blank tube (क
े वल Drabkin’s solution) का absorbance
yellow green filter or 540 nm पर zero पर set करते हैं I
● इसक
े बाद standard solution का absorbance नोट करते हैं ; या फिर standard को कई
concentrations में Drabkin’s solution में dilute करक
े सभी dilutions का absorbance नोट करक
े
एक standard curve plot करते हैं I
● अब इसी प्रकार test solution का absorbance भी नोट करते हैं I
● Calculation -
Absorbance of unknown × concentration of standard(mg/dl) × 251
Blood Hemoglobin(g/dl) = -----------------------------------------------------------------------------------------
Absorbance of standard × 1000
(251 is the dilution factor because 20 µl (0.02 ml) blood sample was added to 5 ml Drabkin's
solution, so the final volume was 0.02 ml + 5.0 = 5.02 ml. Therefore, the blood was diluted with
a dilution factor 5.02 ÷ 0.02 = 251. Standard was not diluted)
Advantages of Cyanmethemoglobin method
● पूरे world में accurate International hemoglobin standard उपलब्ध है;
● यह method automated hematology analyzers क
े लिए आसानी से अनुक
ू लित किया जा सकता है;
● सुस्थापित और गहनता से अनुसन्धानित – ICSH (International Council for Standardization in
Haematology) द्वारा recommended method है;
● कम खर्चीला reagent
Disadvantages
● Manual method में accurate pipetting और spectrophotometer की आवश्यकता होती है;
3

4. ● Reagent (cyanide) ख़तरनाक होता है;
● उपरोक्त कारणों से इस method का उपयोग लबोरटरी क
े बाहर सीमित होता है ;
● Lipids, plasma proteins का बढ़ा हुआ स्तर और leukocyte की बढ़ी हुई संख्या क
े कारण हुई turbidity
test में हस्तक्षेप कर सकती है;
● Hemoglobin क
े वो derivatives जिनमें oxygen-carrying capacity नहीं होती (जैसे - MetHb,
COHb, SHb) उनमें यह method भेद नहीं कर पाता I इसलिए यदि ऐसे derivatives भी blood में
असामान्य मात्रा में उपस्थित होते हैं तो इस method द्वारा blood की oxygen-carrying capacity का
अधिमूल्यांकन (overestimation) हो सकता है l
Sodium Lauryl Sulphate method (cyanide free method) - Sodium Lauryl Sulphate (SLS) एक
surfactant है जो erythrocytes का विघटन (lysis) करता है और तब RBCs से निकला हीमोग्लोबिन
hemoglobin SLS क
े साथ जल्दी ही एक complex बनाता है l यह उत्पाद SLS-MetHb क
ु छ घंटों क
े लिए स्थिर
रहता है और इसका maximum absorbance 539 nm पर होता है I इस method द्वारा प्राप्त hemoglobin
concentration क
े परिणाम reference HiCN method से प्राप्त परिणाम से बहुत सहसम्बद्ध (correlate)
होते हैं I यह method automated hematology analyzers क
े लिए भी अनुक
ू लित किया गया है I
Advantage - non-toxic reagent और lipemia और leukocytosis द्वारा कम हस्तक्षेप l
Disadvantage - SLS-MetHb Cyanmethemoglobin की अपेक्षा कम स्थिर होता है I
Vanzetti Azide-methemoglobin method - यह method HiCN reference method क
े समान ही है
किन्तु इसमें ज़्यादा विषैले potassium cyanide क
े स्थान पर कम विषैला sodium azide इस्तेमाल होता है I
HiCN method की तरह इस method में भी hemoglobin potassium ferricyanide द्वारा methemoglobin
में परिवर्तित होता है जो फिर sodium azide क
े साथ azide methemoglobin complex बनाता है I यह
हीमोग्लोबिन मापन का एक स्वीकृ त वैकल्पिक manual method है I क
ु छ Point-of-care (POC) hemoglobin
measurement devices इस method पर आधारित हैं I
Point-of-care (POC) hemoglobin measurement devices -
● Portable hemoglobinometers - का उपयोग bedside hemoglobin मापन में किया जाता है I इन
equipments में disposable microcuvettes होती हैं जो RBCs से Hb को release करने एवं Hb को
एक stable colored product में बदलने हेतु आवश्यक dried reagents से coated होती हैं I capillary,
venous या arterial blood का बहुत ही small amount (आमतौर पर 10 µl) को microcuvette में
डालते हैं और उसे instrument में फिट कर देते हैं I एक मिनट से भी कम समय में result display हो
जाता है I यह instrument factory में HiCN standard द्वारा पहले ही से calibrate (pre-calibrated)
किया हुआ होता है I
● CO-oximetry – द्वारा ctHb (total hemoglobin concentration - sum of oxygenated
hemoglobin, deoxygenated hemoglobin, carboxyhemoglobin and methemoglobin) क
े
measurement का आधार यह है कि hemoglobin और इसक
े सभी derivatives colored proteins
होते हैं और एक विशेष wavelength पर light absorb करते हैं जिसका एक characteristic
absorbance spectrum होता है I CO-oximeter में एक hemolyzed blood sample का
absorbance विभिन्न wavelengths (520-620 nm) पर अलग - अलग measurement करते हैं और
machine में लगे software की मदद से hemoglobin क
े प्रत्येक derivative का concentration
calculate करते हैं I ctHb इन सभी derivatives क
े concentration का क
ु ल योग होता है I यह method
POCT blood gas analyzers में इस्तेमाल होता है I CO-oximetry critical care setting में urgent
4

5. ctHb मापने का एक स्वीकृ त तरीका है I
● WHO Hemoglobin color scale (HCS)- The HCS test इस साधारण सिद्धांत पर आधारित है कि
blood का colour उसमें hemoglobin क
े concentration (ctHb) पर निर्भर करता है I blood की एक
बूँद test paper पर absorb की जाती है और इसका colour एक chart में दिए red colour क
े 6
shades (प्रत्येक shade ctHb क
े एक concentration को represent करता है) से तुलना करते हैं :
सबसे light colour 4 g/dl और सबसे dark 14 g/dl ctHb को represent करता है I यह method
आमतौर पर ग़रीब देशों में इस्तेमाल होता है, जहाँ खून की कमी (anemia) अधिक पायी जाती है I किसी
परिषकृ त (sophisticated) तकनीक की अनुपस्थिति में anemia की screening हेतु यह method एक
स्वीकृ त clinical tool है और clinical examination की तुलना में अधिक sensitive एवं specific है
Reference interval for hemoglobin -
Newborns - 17 to 22 g/dL
Children - 11 to 13 g/dL
Adult males - 14 to 18 g/dL
Adult women - 12 to 16 g/dL
BLOOD GLUCOSE Estimation
Choice of Blood Specimen -
Capillary Blood from finger
Whole Blood (venous)
Plasma /serum
Plasma या serum द्वारा extracellular glucose content अधिक accurately प्रतिबिम्बित होता है I हालांकि,
cells और plasma क
े water में glucose concentration समान होता है किन्तु plasma का water content
(93%) cells क
े water content (73%) से अधिक होता है, इसलिए plasma glucose whole blood glucose
से लगभग 12-13% अधिक होता है I इसीप्रकार, capillary (whole) blood में glucose स्तर venous (whole)
blood क
े स्तर से थोड़ा अधिक होता है I
Plasma glucose (mg/dl) = (whole blood glucose × 1.15) + 6.0
Plasma glucose (mmol/l) = (whole blood glucose × 1.15) + 0.33
[यह correction यथोचित रूप से (reasonably) accurate होता है यदि hematocrit normal हो और
hematocrit में प्रत्येक 10 units क
े परिवर्तन पर whole blood glucose स्तर में विपरीत दिशा में 0.20 mmol/l
(3.6 mg/dl) का परिवर्तन होता है I हालांकि, यह ध्यान रखना चाहिए कि whole blood glucose
concentration क
े विपरीत plasma glucose concentration पर hematocrit का कोई प्रभाव नहीं पड़ता है I]
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6. Different methods of glucose estimation -
● Alkaline copper reduction method - Folin and Wu method
● Ferricyanide methods
● o-Toluidine method
● Hexokinase method (reference method)
● Glucose Oxidase - Peroxidase method
Hexokinase method -
इस method को ग्लूकोस मापन क
े "reference method" क
े रूप में प्रस्तावित किया गया है I
Hexokinase
Glucose + ATP -------------------> Glucose-6-phosphate + ADP
G-6-P dehydrogenase
Glucose-6-phosphate + NAD -----------------------------> 6-phosphogluconate + NADH + H+
NADH is quantitated spectrophotometrically at 340 nm which is directly related to glucose
concentration.
Why it is a reference method - because:
● it is unaffected by hemolysis, lipaemia, urate, ascorbic acid, bilirubin or drugs affecting
the oxidase method.
Glucose oxidase-peroxidase method (GOD-POD) -
इस method में Glucose oxidase की उपस्थिति में glucose oxidize होकर gluconic acid और hydrogen
peroxide बनाता है I यह hydrogen peroxide, peroxidase (POD) enzyme की उपस्थिति में oxidize होकर
4-aminophenazone (4-aminoantipyrine) और phenol क
े साथ मिलकर red coloured quinoneimine
dye बनाता है जिसका absorbance 505-510 nm पर glucose concentration क
े सीधा समानुपाती होता है I
GOD
Glucose + H2O + O2 --------> gluconic acid + H2O2
POD
H2O2 + 4-aminophenazone + phenol ---------> quinoneimine complex(red colored) + H2O
Reagents -
● Glucose colour reagent - इसमें GOD, POD, 4- aminoantipyrine, phenol & phosphate
buffer (pH 7.5) होता है I
● Glucose standard - 100 mg/dl glucose standard solution या calibrator traceable to the
Standard Reference Material (SRM) of the National Institute of Standards and
Technology (NIST) का इस्तेमाल होता है I
Procedure -
● सर्वप्रथम reagent और standard solution room temperature (RT) पर आने देते हैं I
● तीन test tubes B (Blank), S (Standard) और T (Test) label करते हैं I
● प्रत्येक tube में 1ml (1000μl) glucose reagent लेते हैं I
● B tube में 10 μl distilled water डालते हैं I
● S tube में 10 μl glucose standard डालते हैं I
● T tube में 10 μl plasma/serum डालते हैं I
● सभी tubes क
े contents को अच्छी तरह mix करते हैं I
● तीनों tubes को एक water bath में 37 °C पर 15 minutes या RT पर 30 minutes क
े लिए रखते हैं I
● फिर एक colorimeter पर green filter पर या एक spectrophotometer पर 505-510 nm पर S और
T tubes की B tube क
े विरुद्ध reading (absorbance/OD) नोट करते हैं I
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7. Calculation -
OD of T
Glucose concentration(mg/dl) = ------------ × concentration of standard in mg/dl
OD of S
To convert results from mg/dl to mmol/l -
result in mg/dl × 0.0555 = result in mmol/l
Some important points -
● Reagent, standard solution और plasma/serum sample को test लगाने क
े पूर्व RT पर लाना
चाहिए I
● Reagent, standard और sample की pipetting बहुत accurate होनी चाहिए I
● The temperature of the water bath should be 37 °C.
● Glucose reagent जो लगभग colorless होता है, bottle क
े बार - बार खुलने - बंद होने से धीरे - धीरे
थोड़ा colored हो जाता है I यदि इस colored glucose reagent की distilled water क
े विरुद्ध 0.300
से अधिक हो जाए तो इसे उपयोग नहीं करना चाहिए I
● Serum/plasma को blood collection क
े बाद 30 minutes क
े अंदर ही पृथक कर लेना चाहिए क्योंकि
serum/plasma में glucose का स्तर RT पर 7 mg/dl की रफ़्तार से कम होने लगता है I इसीलिए
fluoride tube blood से पृथक किया गया plasma अधिक उचित रहता है क्योंकि fluoride क
े कारण
glucose स्तर जल्दी नहीं घटता I
● Glucose test क
े प्रत्येक batch में एक Internal quality control (IQC) sample(s) को एक
unknown sample की तरह ही अवश्य लगाना चाहिए ताकि लगाए गये test की quality check हो सक
े
I
● सामान्य तौर पर GOD-POD test की linearity लगभग 500 mg/dl glucose concentration की
होती है, इसलिए यदि किसी sample में glucose concentration 500 mg/dl से अधिक आता है तो
plasma sample को normal saline से ½ या ⅓ dilute करक
े इस diluted plasma sample में पुनः
glucose test करते हैं और प्राप्त result को 2 या 3 (as per dilution) से multiply करक
े actual
glucose concentration निकालते हैं I
Glucose meter (Glucometer) - Glucose meters are based on electrochemical technology and
have two essential parts: an enzymatic reaction and a detector. The enzyme portion of the
glucose meter is generally packaged in a dehydrated state in a disposable strip or reaction
cuvette. The enzymes used for enzymatic reaction are glucose oxidase, glucose
dehydrogenase or hexokinase. Glucose in the patient's blood sample rehydrates and reacts with
the enzymes to produce a product that can be detected. Some meters generate hydrogen
peroxide or an intermediary that can react with a dye, resulting in a color change proportional to
the concentration of glucose in solution. Other meters incorporate the enzymes into a biosensor
that generates an electron that is detected by the meter. The values of glucose by glucose
meters may be ±15-20% different from the laboratory values.
Blood glucose level - यह fasting condition (at least 8 hrs fasting) में सामान्यतः 100 mg/dl से कम
होता है और खाना खाने (postprandial, PP) क
े 2 घंटे बाद 140 mg/dl से कम I
Oral glucose tolerance test (OGTT) -
यह test diabetes, gestational diabetes या carbohydrate metabolism सम्बंधित बीमारिओं की
diagnosis हेतु किया जाता है I इस test से यह पता चलता है कि अधिक मात्रा में sugar लेने पर शरीर उसे उचित
रूप से metabolise कर पाता है या नहीं I
Glucose tolerance test procedure - इसक
े लिए व्यक्ति का खाली पेट (10-12 घंटे की fasting) होना
आवश्यक होता है (पानी पी सकते हैं)I इसीलिए यह test सुबह ही किया जाता है I सबसे पहले व्यक्ति का fasting
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8. blood sample लेते हैं, फिर उसे 75 g glucose 250-300 ml पानी में घोल कर पिलाते हैं (धीरे - घीरे 5 मिनट
में, वरना उल्टी हो सकती है) और फिर इसक
े 2 घंटे बाद blood sample लेकर उसमें glucose level मापते हैं I
कभी - कभी 1 घंटे और 2 घंटे पर दो blood samples लेते हैं I यह ध्यान रखते हैं इन 2 घंटों क
े बीच क
ु छ भी
खाना, पीना, पान मसाला या धूम्रपान मना होता है और सभी blood samples एक ही posture (बैठे या लेटे हुए)
में ही लिए जाएं I
World Health Organization ने diabetes, impaired glucose tolerance और gestational diabetes की
diagnosis क
े लिए निम्न मानदंड (criteria) तय किये हैं :
Normal levels : Fasting plasma glucose - < 100 mg/dl, 2 hrs post glucose (75 g) - <140 mg/dl
Diabetes: Fasting plasma glucose (FPG) ≥126 mg/dL or Oral glucose tolerance test (OGTT)
2-hour post glucose (PG) plasma glucose ≥200 mg/dL
Impaired fasting glucose (IFG): FPG 110 mg/dL to 125 mg/dL and OGTT 2-hour PG < 140
mg/dL
Impaired glucose tolerance (IGT): FPG < 126 mg/dL and OGTT 2-hour PG 140 mg/dl to 200
mg/dl
Gestational diabetes : Fasting - ≥ 92 mg/dl, 1 hour post glucose - ≥180, 2 hour post glucose - ≥
155 mg/dl
इसक
े अतिरिक्त diabetes की diagnosis HbA1C और random blood glucose स्तर क
े आधार पर भी करते
हैं - HbA1C ≥ 6.5 % या random blood glucose ≥ 200 md/ dl in presence of sign and symptoms of
diabetes.
HbA1C क
े आधार पर eAG (estimated average glucose) को calculate करने क
े लिए इस फॉर्मूले का
उपयोग करते हैं :
eAG (mg/dl) = 28.7 X A1C – 46.7
URINE ROUTINE EXAMINATION (Urine routine analysis)
Urine analysis सामान्यतः बीमारी की diagnosis, बीमारी की monitoring और दवा क
े प्रभाव को देखने हेतु की
जाती है I
Urine sample collection क
े बारे में क
ु छ महत्वपूर्ण बातें -
● Early morning की पहली urine उत्तम रहती है क्योंकि यह concentrated और acidic होती है I
● मरीज़ को बताना होता है कि urine collect करने से पहले external urethral orifice को towelettes
(sanitizing wipes) से साफ़ करक
े पोछ लेना चाहिए I
● urine flow का middle portion ही collect करना चाहिए क्योंकि urine flow क
े initial fraction में
external urethral orifice क
े आस - पास क
े cells और bacterial cells का contamination हो सकता
है I
● urine sample एक साफ़ और सूखे ढक्कनदार container में लेना चाहिए (sterile container बेहतर
होता है) I
● urinalysis sample collect करने क
े बाद उसमें जाँच जितनी जल्दी कर ली जाए उतना अच्छा होता है
क्योंकि अधिक देर होने से urine क
े chemical composition में बदलाव हो सकते हैं और bacterial
growth भी हो सकती है I यदि जाँच में अधिक देर हो तो sample को फ्रिज में रखना चाहिए I
Physical examination - इसमें हम urine का appearance देखते हैं -
● Urine clear है या turbid (normal urine clear (transparent) होती है I
● Urine का colour (normal urine straw colour की होती है) I
Chemical examination - Urine में कई biochemical tests किये जाते हैं I इन tests क
े लिए paper strips
या test tube tests का उपयोग करते हैं I
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9. By plastic or paper strips : ये strips monofunctional (having one indication zone for one urine
component) या polyfunctional (having several indication zones for different urine components)
होती हैं I इन plastic या paper strips में pads होते हैं जो ऐसे chemical से संसेचित होते हैं जो urine में
उपस्थित compounds से react करक
े विशेष colour देते हैं I urine में present compounds की जाँच क
े लिए
Polyfunctional strips द्वारा निम्लिखित biochemical tests किये जाते हैं - pH, glucose, proteins,
bilirubin, urobilinogen, ketone, hemoglobin (blood), nitrite, ascorbic acid, leucocytes. इन tests की
semi-quantitative values को trace, 1+, 2+, 3+ and 4+ या mg/dl, g/dl में report करते हैं I
Procedure -
Urine को अच्छी तरह mix करक
े उसमें Test strip को क
ु छ seconds क
े लिए इतना डुबोते हैं कि strip क
े सभी
zone pads urine से भीग जाएं I फिर strip पर लगी excess urine को हटाने क
े लिए strip को container की
wall को touch करते हुए निकाल लेते हैं I अब इस strip को 1-2 मिनट क
े लिए horizontally एक tissue paper
पर रखते हैं ताकि reactions पूरे हो जाएं और विभिन्न reaction zones क
े reagents आपस में न मिलें I फिर
सभी zone pads पर आये colours को strip manufacturer द्वारा दिए गए colour scale से मैच करक
े urine
क
े विभिन्न अव्यवों की उपस्थिति/अनुपस्थिति एवं मात्रा note कर लेते हैं I
By Test tube tests: इसमें विभिन्न analytes की जाँच अलग - अलग methods द्वारा की जाती है -
Urine Analyte Test method Method principle
Sugar Benedict's test reduction of Cu++ to Cu+ in alkaline
medium by reducing sugar
Proteins Heat test denaturation of proteins by heat
Sulphosalicylic acid test precipitation of proteins by sulfosalicylic
acid resulting in turbidity
Ketone bodies Rothera's test Acetoacetic acid and acetone react with
alkaline solution of sodium nitroprusside to
form a purple colored complex.
Bile pigments Fouchet's test bile pigment is converted to the green
color of biliverdin and blue cholecyanin by
the oxidative action of the ferric chloride in
the presence of trichloroacetic acid
Urobilinogen Ehrlich's test diethylaminobenzaldehyde reacts with
urobilinogen in acid medium to produce a
pink color
Hemoglobin Benzidine test The peroxidase activity of hemoglobin
decomposes hydrogen peroxide releasing
nascent oxygen which oxidizes
benzidine to give blue color
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10. Some individual biochemical test tube tests in urine
Urine sugar
Benedict's test
Principle - Reducing sugar in the presence of alkaline medium reduces cupric ions (Cu++) to
cuprous ions (Cu+) and these cuprous ions form cuprous oxide (Cu2O) in the form of a brick red
precipitate.
2 ml reagent + 0.2 ml urine (4 drops) —---Boil for 2 min
Interpretation -
Clear blue : nil (sugar absent)
Green with no ppt : trace (<0.5%)
Green with ppt : + (0.5%-1%)
Yellow ppt : ++ (1%-1.5%)
Orange red ppt : +++ (1.5%-2%)
Brick red ppt : ++++ (> 2%)
Urine proteins
Sulfosalicylic acid test
2 ml clear urine + 0.2 ml (4 drops) 20% sulfosalicylic acid → mix well
Interpretation -
Clear Urine : nil (protein absent)
Slight turbidity : +
Mild turbidity : ++
Moderate turbidity : +++
(With flocculation)
Visible white precipitate : ++++
Heat Test
● Take 5 ml clear urine in a test tube.
● Boil the upper portion over a flame.
10

11. ● Compare the heated part with the lower part. Cloudiness or turbidity indicates the
presence of either proteins or phosphates/carbonates.
● Add 2-4 drops of 10% glacial acetic acid and boil the upper portion again or add just 1
drop of 33% acetic acid and mix.
● यदि turbidity बनी रहती है तो इसका अर्थ है कि urine में protein उपस्थित है I
● यदि turbidity गायब हो जाती है तो इसका मतलब यह हुआ कि turbidity urine में उपस्थित
phosphates या carbonates क
े कारण थी I
Interpretation -
No cloudiness : negative (no protein)
Barely visible cloudiness : Trace
definite cloud without granular flocculation: +
heavy and granular cloud without granular flocculation: ++
densed cloud with marked flocculation: +++
thick curdy precipitation and coagulation: ++++
Urine ketone bodies
Ketone bodies are produced by the liver and used peripherally as an energy source
when glucose is not readily available. These are acetoacetic acid, acetone and
β-hydroxybutyric acid.
Modified Rothera's test
1 g sodium nitroprusside + 20 g ammonium sulfate + 20 g anhydrous sodium carbonate - mix
well
Place a small amount of the above powder on a white filter paper (about 5 mm in diameter). Add
one drop of urine on it. A violet color appears immediately if the urine sample contains acetone
and acetoacetic acid (ketone bodies)
Or
Saturate about 5 ml urine with solid ammonium sulfate (till no more ammonium sulfate
dissolves) and add a little amount of sodium nitroprusside, either about 0.5 ml 2% solution or a
small quantity of the powdered solid. Mix and add about 0.5 ml conc. ammonia → purple color
ring
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12. Urine bile pigments
Fouchet's (फ
ू शेट्स) Test for bilirubin
10 ml urine + about 5 ml barium chloride solution (10%) →mix well → filter or centrifuge it →
add 1-2 drop of Fouchet's reagent on to the precipitate → bluish green color shows the
presence of bilirubin in the urine sample.
Fouchet's reagent - dissolve 25 g trichloroacetic acid (TCA) in 50 ml distilled water in a 100 ml
volumetric flask, add 10 ml ferric chloride solution (10%) and make to 100 ml with distilled water.
Appearance of bluish green color is positive for the presence of bile pigment (bilirubin).
Some practice questions
Q. 1. Fill in the blanks:
A. Hemoglobin derivatives which have no oxygen-carrying capacity are ______, ____,
______
B. Carboxyhemoglobin (COHb) is a stable complex of _____________ with hemoglobin.
C. Hemoglobin concentration decreases in __________ and increases in _______.
D. When sulfur binds to hemoglobin molecule the resulting complex is called ________.
E. The method recommended by International Committee for Standardization in
Hematology (ICSH) is ____________ method.
F. Readings are taken at ______ nm in Cyanmethemoglobin method.
G. Hemoglobin molecule has two _____ polypeptide chains and two ______ polypeptide
chains.
H. The iron in the hemoglobin molecule is in ______ form.
I. The iron in the methemoglobin molecule is in ______ form.
J. The highly poisonous chemical in Drabkin's reagent is ____________.
K. Full form of POCT is ____________.
L. The pH of Drabkin's reagent should be ________ and it should be stored in a
_________ bottle at _______ °C.
M. The Drabkin's reagent should be brought to _______ temperature before using it for
hemoglobin estimation.
K3[Fe(CN6)]
N. Hemoglobin (Fe++) ------------------> ___________________
KCN
O. Methemoglobin (Fe+++)-----------> ___________________
Ans. A- MetHb, COHb, SHb, B- carbon monoxide, C- anemia, polycythemia, D- sulfhemoglobin,
E- Cyanmethemoglobin, F- 540, G- alpha, beta, H- ferrous, I- ferric, J- potassium cyanide, K-
point of care testing, L- 7.0-7.4, dark coloured, 4-20, M- room, N- methemoglobin, O-
Cyanmethemoglobin.
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13. Q. 2. Fill in the blanks:
GOD
A. Glucose + H2O + O2 --------> ___________ + H2O2
POD
B. _____ + 4-aminophenazone + _____ ------> quinoneimine complex(red colored) + H2O2
C. plasma's water content is higher than the water content of ______.
D. Plasma glucose is about 12-13% ________ than that of whole blood.
E. The reference method for glucose estimation is ________ method.
F. The full form of GOD is ___________.
G. The full form of POD is __________
H. The reading in GOD/POD is taken at __________nm or ________ filter.
I. The reagent, standard solution and plasma/serum sample should be at ________
temperature before running the test.
J. Every batch of glucose test should include at least one _______ _______ ________
sample for quality check purposes.
OD of Test
K. Glucose concentration(mg/dl) = ------------------------ × _____________
OD of Standard
L. The blood sample for glucose estimation is taken in _________ tube.
M. Fluoride inhibits enzyme ________ to prevent glucose degradation with time.
N. Glucose in blood can be estimated in serum, _______ and _______ blood.
O. According to WHO diagnostic criteria for diabetes the fasting plasma glucose should be
≥ ______mg/dL.
P. According to WHO diagnostic criteria for diabetes the 2-hour post glucose (75 g) plasma
glucose (PG) should be ≥ ______mg/dL.
Ans.
A- gluconic acid, B- H2O2, phenol, C- cells, D- higher, E- hexokinase, F- glucose oxidase, G-
peroxidase, H- 505-510, green, I- room, J- internal quality control, K- concentration of standard,
L- fluoride, M- enolase, N- plasma, whole, O- 126, P- 200.
Q.3. Match the following :
A. Benedict's test द्वारा urine test में प्राप्त color (ppt) sugar result
(i) green without ppt (a) 0.5 % - 1%(+)
(ii) green with ppt (b) trace amount (<0.5%)
(iii) yellow ppt (c ) > 2%(++++)
(iv) orange red ppt (d) 1.0 - 1.5%(++)
(v) brick red ppt (e) 1.5 - 2%(+++)
Ans. (i) - (b), (ii) - (a), (iii) - (d), (iv) - (e), (v) - (c )
B. Sulfosalicylic acid test द्वारा urine test में प्राप्त परिणाम Protein result
(i) Clear Urine (a) +
(ii) Slight turbidity (b) nil (protein absent)
(iii) Mild turbidity (c ) +++
(iv) Moderate turbidity (With flocculation) (d) ++++
(v) Visible white precipitate (e) ++
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14. Ans. (i) - (b), (ii) - (a), (iii) - (e), (iv) - (c ), (v) - (d)
Q.4. Identify the true and false statements :
(a) Heat test में urine को गर्म करने पर यदि turbidity आती है किन्तु glacial acetic acid डालने पर
turbidity गायब हो जाती है तो urine में protein present है -
(b) Urine में ketone bodies की जाँच क
े लिए Fouchet's test करते हैं -
(c) Urine में bile pigments की जाँच क
े लिए Rothera’s test करते हैं -
(d) Rothera's test acetone और acetoacetic की उपस्थिति में positive आता है -
Ans. (a) false, (b) false, (c ) false, (d) true
REFERENCES
1. Practical Clinical Biochemistry. Varley H, Gowenlock A H, Bell M. Fifth edition, 1991.
2. Higgins C, Hemoglobin and its measurement. www.acutecaretesting. org (2005)
Disclaimer : The pictures given in the text have been downloaded from Google images and I
am thankful to the persons who have uploaded these pictures.
Dr. P. K. Nigam
Ph. D. (Retired Biochemist)
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