RIA - principle, requirements, dose response curve, reliability, accuracy, precision, sensitivity, specificity, radiolabeled antigen, antibody, radiation counterapplications, limitations ELISA - principle, types of ELISA, enzyme labeled detection antibody, primary antibody, secondary antibody, elisa plate reader, chemiluminescence elisa, direct, indirect, sandwich, competitive elisa, High sensitivity/Ultra sensitive ELISA PCR - principle, material required, steps, Taq DNA polymerase, thermal cycler, RT-PCR, RT-qPCR, CT- value, covid-19

1. 1
12.SOME BASIC CONCEPTS OF BIOCHEMISTRY FOR DMLT SECOND YEAR STUDENTS
(U. P. State Medical Faculty syllabus) in Hinglish
LESSON 12
[RIA, ELISA & PCR]
RADIOIMMUNOASSAY (RIA)
Radioimmunoassay technique (RIA, जो 1960 में Berson and Yalow द्वारा पेश की गई थी) एक बहुत
sensitive in vitro technique है जिसका इस्तेमाल antigens (e.g. hormone levels in the blood) क
े
concentration मापने हेतु किया जाता है और इसमें इन antigens की antibodies का इस्तेमाल करते हैं I
उपसर्ग (prefix) 'radio' का मतलब है कि परिमाणन (quantification) हेतु कोई radioactive isotope का
इस्तेमाल एक indicator क
े रूप में किया जाता है और चूंकि यह antigen - antibody reaction पर आधारित है
इसलिए term 'immunoassay' का इस्तेमाल किया जाता है I यह assay आमतौर पर बहुत sensitive और
specific होता है I इस तकनीक द्वारा analyte क
े क
ु छ picogram तक की मात्रा को माप सकते हैं I
Principle -
Radioimmunoassay का मूलभूत सिद्धांत competitive binding है, जिसमें एक radioactive antigen
(tracer) एक non-radioactive (unlabeled) antigen (analyte) से एक fixed number of antibody binding
sites क
े लिए प्रतिस्पर्धा (compete) करता है I जब unlabeled antigen (standards या samples) और एक
fixed amount of tracer (labeled antigen जिसे hot antigen भी कहते हैं) को antibody की एक constant
और limited amount क
े साथ react कराया जाता है तो unlabeled antigen (cold antigen) की बढ़ती मात्रा क
े
साथ tracer की antibody क
े साथ bound मात्रा घटती जाती है I
In a simplified way the reactions can be explained as follows :
Without competition
12 Ag* + 6 Ab ⇌ 6 Ag* - Ab + 6 Ag*
(Bound 50%) (Free 50%)
With competition
12 Ag* + 6 Ag + 6 Ab ⇌ 4 Ag* - Ab + 8 Ag* + 2 Ag - Ab + 4 Ag
(33.3%) (66.6%) (33.3%) (66.6%)
इसतरह, जैसे - जैसे unlabeled antigen (Ag/analyte) का concentration बढ़ता जाता है वैसे - वैसे इसका
antibody (Ab) क
े साथ binding का competition भी बढ़ता जाता है जिससे labelled antigen (Ag*) की
antibody क
े साथ % binding कम होती जाती है I इसक
े बाद bound और free forms को उचित method द्वारा
separate करक
े bound या free fraction में radioactivity को माप कर known concentrations of antigen
(standard) तथा % binding क
े बीच एक calibration curve plot करते हैं I फिर इसी calibration curve की
मदद से unknown sample में unknown antigen की मात्रा को calculate कर लेते हैं I

2. 2
Requirements of RIA
● Purified antigen (standard)
● Antigen labeled with some radioisotope
● Antiserum against antigen in question
● Method for separation of bound and free forms
● Measurement of radioactivity
● Calculation
● Reliability assessment
Purified antigen - का इस्तेमाल standard curve, labelled antigen और antibodies बनाने क
े लिए
immunization में होता है I यह antigen synthetic हो सकता है या natural sources से बनाया हुआ I बड़े size
क
े protein hormones natural sources से ही बनाए जाते हैं I हालांकि, natural sources से बनाए गए
standards inter laboratory variations की समस्या से प्रभावित होते हैं I इस समस्या को दूर करने क
े लिए इस
बात क
े काफी प्रयास किये गए हैं कि किसी analyte क
े सभी working standards को एक ही International
standard (Reference preparation) क
े against calibrate किया जाए जो National Institute for
Biological Standards and Control of the Medical Research Council in UK और National Institute
of Arthritis, Metabolism and Digestive Diseases in USA क
े माध्यम से WHO द्वारा बनाया और
वितरित किया जाए I
Antigen labeled with some radioisotope - RIA में किसी radioactive isotope से labelled antigen का
इस्तेमाल किया जाता है और radioisotope labelled antigen क
े फायदे हैं - इसक
े quantitation की ease,
reliability, rapidity, sensitivity और precision I सामान्य रूप से प्रयुक्त radioisotopes हैं - 3
H (half life
12.3 years),14
C (half life 5760 years) and 125
I (half life 60.2 days). There are two types of isotope
label:
1. Internal label - इसमें native molecule क
े non-radioactive isotope element को उसी element
क
े एक radioactive isotope द्वारा replace कर दिया जाता है I उदाहरण - छोटे molecules जैसे
drugs और steroids की 14
C और 3
H द्वारा labelling I इन labelled antigens की shelf life अधिक
होती है I
2. External label - इसमें एक foreign atom, जो native molecule का हिस्सा नहीं होता है, का इस्तेमाल
होता है I सबसे अधिक इस्तेमाल होने वाले elements हैं - 125
I और 131
I.125
I क
े इस्तेमाल का फायदा यह
है इसकी shelf life (half life 60 days) 131
I (half life 8 days) से अधिक होती है और इस isotope की
abundance और counting efficiency भी 131
Iक
े मुकाबले अधिक होती है I
Antiserum against the antigen in question -
● The antiserum (antibody) should be specific for the antigen (analyte).
● It should have high affinity for the antigen because the sensitivity of an assay is closely
related to this affinity.
● Amount of antibody (i.e. Titre - an estimate of the concentration of antibody in a
particular antiserum) को antiserum क
े उस dilution क
े पारस्परिक (reciprocal) क
े रूप में व्यक्त
किया जाता है जो 50% of tracer (labelled antigen) को bind करेगा I इस प्रकार antiserum क
े उस
dilution को, जो added antigen (labelled) क
े 50% को bind करता है, एक assay में titre क
े रूप में
इस्तेमाल करते हैं I
Separation of bound and free forms - इसक
े लिए कई methods हैं :
● Paper chromato electrophoresis - used originally by Yalow and Berson but it is not
suitable for routine use.
● Gel filtration - less commonly used.

3. 3
● Adsorption methods using dextran coated charcoal (DCC), silicates and protein A
containing S. aureus.
● Fractional precipitation - using salts such as sulfite, ammonium sulfate and solvents such
as ethanol, dioxane and polyethylene glycol (PEG).
● Double or second antibody method
● Solid phase system - The antibodies can be attached to polystyrene tubes, glass beads,
nylon particles and magnetic particles which help in separation of bound and free
fractions.
Acceptability criteria of separation method -
● It should be efficient to separate the two fractions without contamination of each other.
● The separation does not cause any appreciable disturbance in the state of equilibrium
reached at that time.
● It should be practical in terms of speed, simplicity, acceptability and cost.
Measurement of radioactivity -
मुख्य रूप से दो प्रकार क
े radioactive counters इस्तेमाल होते हैं जो radioactive substance क
े प्रकार पर
निर्भर होता है :
(a) Gamma Counters - These are used invariably for the gamma-energy emitting isotopes, such
as : 125
I and 131
I.
(b) Scintillation Counters - These are mostly used for counting beta-energy-emitting isotopes,
such as : tritium 3
H and 14
C isotopes.
These counters give radioactivity in counts per minute (cpm) or counts per second (cps).
Calculations - Total radioactivity, radioactivity in bound /free fractions and nonspecific binding
(the bound radioactivity in the absence of the antiserum which is deducted from all other
radioactive measurements) मापने क
े बाद एक calibration curve plot करते हैं I Standard curve plot
करने क
े कई तरीक
े हैं और सबका उद्देश्य antigen (analyte) की वांछित concentration range क
े लिए एक
linear dose response curve प्राप्त करना होता है I इस standard curve की मदद से किसी sample में
antigen का concentration पता कर सकते हैं I
Abscissa (x axis) Ordinate (y axis)
[Ag] % B/T
log [Ag] % B/T
[Ag] or log [Ag] B/F*
[Ag] or log [Ag] log B/F*
[Ag] % B/Bo**
log [Ag] ***Logit B/Bo**
—--------------------------------------------------------------
*B/F = (B/T) / (1 - B/T)
**Bo is the bound activity in zero standard (no antigen)
***Logit B/Bo = log (B/Bo - B)

4. 4
Semi log paper
Reliability assessment of RIA - Every RIA is checked for its reliability. The criteria of reliability
are : sensitivity, specificity, precision and accuracy.
Sensitivity - का मतलब है किसी RIA की minimal detection limit अर्थात unlabelled antigen का कम से
कम वो amount जिसको उस sample से भेद (distinguish) किया जा सक
े जिसमें वो unlabelled antigen का
amount शून्य हो I High sensitivity को अक्सर एक अच्छे assay की प्रमाणिकता माना जाता है I
Specificity - का मतलब है कि assay method द्वारा हम sample में जिस विशेष substance
(analyte/antigen) का मापन करना चाह रहे हैं तो क्या क
े वल वो ही substance ही measure हो रहा है या
sample में present अन्य substances कोई interference कर रहे हैं, और यदि interference कर रहे हैं तो
किस हद तक I
Example : specificity of progesterone RIA
Cross reacting substance % cross reaction
Cortisol <0.01
Testosterone <0.3
17a-hydroxyprogesterone <3.0
20a-dihydroprogesterone <3.0
Precision - का मतलब है कि एक ही sample को बार -बार test करने पर जो results प्राप्त होते हैं उनक
े बीच
कितना variation होता है I It is determined as within (intra assay) as well as between batch (inter
assay) % coefficient of variation (CV). It should be as low as possible. यह जितना कम होगा उतना
ही assay अधिक precise होगा I इसक
े लिए IQC का इस्तेमाल किया जाता है I
%CV = (standard deviation ×100) ÷ mean
Accuracy - मतलब है कि analyte की estimated value analyte की true value क
े कितना करीब है I यानि
एक test result तब accurate माना जाता है जब measured value true concentration क
े बहुत करीब हो I
This is done by:
● comparison with a method of known accuracy
● by recovery estimation
● participation in EQAS
Limitations of the RIA
● The cost of equipment and reagents is high
● Short shelf-life of radiolabeled compounds
● The problems associated with the disposal of radioactive waste.
Some practice questions
Fill in the blanks:
(a) The full form of RIA is ________
(b) The commonly used radioisotopes in RIA which emit beta particles are _____ and
_____.
(c) The commonly used radioisotope in RIA which emits gamma radiation is _____
(d) 3
H and 14
C radioisotope emit _______ particles.
(e) 125
I radioisotope emits _____ radiation.
(f) _______ paper is used to plot the standard curve in RIA.
(g) ______ and ______ introduced the technique of RIA.

5. 5
(h) ___________ counter is mostly used for counting beta-energy-emitting isotopes, such
as : tritium 3H and 14
C isotopes.
(i) _______ Counter is used invariably for the gamma-energy emitting isotopes, such as :
125
I and 131
I.
(j) Radiation counters give radioactivity in counts per _____ or counts per ______.
(k) The criteria of reliability of an RIA are ______, ______, _______ and _____.
(l) The three basic protective measures in radiation safety are ______, _______ and
_____.
Ans. (a) radioimmunoassay, (b) 3
H,14
C (c ) 125
I, (d) beta, (e) gamma, (f) semi log, (g) Berson,
yalow, (h) scintillation, (i) gamma (j) minute, second, (k) precision, accuracy, sensitivity,
specificity, (l) time, distance, shield
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
ELISA मूलरूप से एक enzyme immunoassay (EIA) है और RIA का ही एक modification है जिसमें
चिह्नित (tagged) antigen और antibody को radioactive material क
े स्थान पर enzymes से lebel किया
जाता है I यह एक बहुत sensitive method है जिसका इस्तेमाल antibodies, antigens, proteins,
glycoproteins, और hormones आदि क
े detection और quantification हेतु किया जाता है I
Principle - यह एक immunochemical method है जो antigen-antibody reaction पर आधारित है I ELISA
में antigen (target macromolecule) को एक solid surface (एक multi-well plate) पर immobilize किया
जाता है जो या तो directly करते हैं या फिर surface पर एक capture antibody क
े माध्यम से immobilize
करते हैं I इसक
े बाद एक reporter enzyme से linked एक detection antibody क
े साथ antigen को
सममिश्रित (complexed) किया जाता है I अब reporter enzyme की activity को detect करने हेतु इसे एक
उचित substrate क
े साथ incubate करते हैं जिससे जो product बनता है उसे measure करते हैं I फिर
standards क
े इस्तेमाल से एक dose response curve plot करते हैं जिसकी सहायता से biological
specimen में antigen (analyte) का concentration calculate करते हैं I
Elisa plate
Material required for ELISAs are :
● polystyrene/polyvinyl chloride plates, typically having 96-wells coated to bind protein very
strongly.
● a primary and/or secondary detection antibody. The primary detection antibody is a
specific antibody that only binds to the protein of interest, while a secondary detection
antibody is a second enzyme-conjugated antibody that binds a primary antibody that is
not enzyme-conjugated,
● analyte/antigen, coating antibody/antigen,
● buffer and
● substrate/chromogen.

6. 6
General steps of an ELISA immunoassay:
● Coating of microtiter plate wells with antigen
● Blocking (typically with the addition of bovine serum albumin [BSA]) of all unbound sites
to prevent false positive results
● addition of primary antibody (e.g. rabbit monoclonal antibody) to the wells
● addition of secondary antibody conjugated to an enzyme (e.g. anti-mouse IgG).
[Between each of these steps there are "wash" steps using a buffer such as
phosphate-buffered saline (PBS) and a non-ionic detergent, to remove unbound
material. The wells are washed two or more times during each wash step, depending on
the specific protocol being followed]
● Detection - is carried out by the addition of a substrate to the enzyme that can generate
a color [The most commonly used enzymes are horseradish peroxidase (HRP) and
alkaline phosphatase (ALP). [The substrate for HRP is hydrogen peroxide and
tetramethylbenzidine (TMB) is used as a chromogen which results in a blue color
change. ALP measures the yellow color of nitrophenol after room temperature incubation
periods of 15 to 30 minutes and usually uses P-Nitrophenyl-phosphate (pNPP) as its
substrate].
● Finally reading the color absorbance (OD) on an ELISA plate reader.
एक sample में antigen concentration मालूम करने क
े लिए antigen क
े different concentrations क
े साथ
एक standard curve plot करते हैं और फिर unknown sample की absorbance (OD) की मदद से इस
standard curve द्वारा sample में antigen concentration को calculate करते हैं I
Chemiluminescence ELISA - In this method a luminescent substrate is used and the chemical
reaction between the enzyme label and luminescent substrate emits light which is detected by
a luminometer.
Four major types of ELISA:
● Direct ELISA (antigen-coated plate) - used for analyzing the immune response to an
antigen and to detect antigens.
● Indirect ELISA (antigen-coated plate) - used to detect not only antigens, but also
endogenous antibodies and their concentration.
● Sandwich ELISA (antibody-coated plate) - used to detect the presence of antigen in a
sample and for analysis of complex samples.

7. 7
● Competitive ELISA - used to detect antigen (small molecules and hormones)
concentration in a sample and most commonly used when only one antibody is available
for the antigen of interest. Direct, indirect and sandwich ELISAs can all be adapted to
this format.
Direct ELISA - इस ELISA में antigen को एक multi-well plate की सतह पर स्थिर (immobilized) कर दिया
जाता है और इस antigen क
े लिए specific antibody द्वारा antigen को detect किया जाता है क्योंकि यह
antibody HRP या अन्य detection molecules से directly conjugated होती है I
Indirect ELISA - इस ELISA में antigen (analyte) क
े detection हेतु एक two-step process का उपयोग
किया जाता है, जिसमें पहले antigen क
े लिए specific एक primary antibody multi-well plate की सतह पर
immobilized antigen से bind करती है I फिर primary antibody की host species क
े विरुद्ध एक labeled
secondary antibody को primary antibody से bind कराते हैं I यह secondary antibody एक detection
molecule से conjugated होती है जिसे उचित substrate क
े माध्यम से detect कर सकते हैं I इस method का
उपयोग serum में specific antibodies क
े detection में भी किया जा सकता है जिसक
े लिए primary
antibody क
े स्थान पर serum लेते हैं I Indirect ELISA की sensitivity direct ELISA से अधिक होती है और
यह कम खर्चीला होता है I
Sandwich ELISA -
Sandwich ELISA (or sandwich immunoassay) सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला प्रारूप (format) है I
इसको “sandwich” इसलिए कहते हैं क्योंकि इसमें antigen antibodies की दो layers (capture और
detection antibodies) क
े बीच sandwich की तरह रहता है I ये दो antibodies antigen क
े अलग - अलग
epitopes क
े लिए specific होती हैं इसीलिए इन दो antibodies को सामान्यतः matched antibody pairs
कहते हैं I इनमें से एक antibody को multi-well plate की सतह पर coat करते हैं और इसे capture antibody
कहते हैं क्योंकि यह antigen को capture करक
े immobilize कर देती है I दूसरी antibody (detection
antibody) detection molecule से conjugated होती है जिससे antigen को detect किया जाता है I

8. 8
Competitive ELISA (inhibition ELISA or competitive immunoassay) - competitive ELISA assays
measure the concentration of an antigen by detection of signal interference. पहले primary
antibody को sample antigen क
े साथ incubate करते हैं और इससे बने antibody–antigen complexes को
उसी antigen से coated दूसरे well में डालते हैं I फिर incubation क
े बाद unbound antibody को washing
step द्वारा remove किया जाता है I अब इसमें primary antibody क
े विरुद्ध enzyme-linked secondary
antibody डालते हैं I फिर washing द्वारा unbound enzyme-linked antibodies को remove करने क
े बाद
enzyme substrate डालकर रीडिंग लेते हैं I जितना अधिक sample में antigen होगा उतनी अधिक primary
antibodies sample antigen से bind होंगी और इसलिए उतनी ही कम primary antibody दूसरे well में
coated antigen से bind करने क
े लिए उपलब्ध होंगी I इस प्रकार, enzyme-coated secondary antibody
को भी bind करने क
े लिए कम primary antibodies मिलेंगी जिससे enzyme substrate डालने पर कम signal
(absorbance) मिलेगा I अर्थात जितना अधिक sample में antigen होगा उतना ही कम absorbance होगा I
High sensitivity/Ultra sensitive ELISA - हाल क
े वर्षों में ELISA की sensitivity improve करने क
े लिए कई
modifications किये गए हैं I उदाहरण क
े लिए - परंपरागत (traditional) ELISA द्वारा CRP को within 10 से
1,000 mg/L की range में measure कर सकते हैं जबकि high sensitivity CRP (hs-CRP) ELISA द्वारा
0.5 से 10 mg/L की range में CRP measure कर सकते हैं I
Applications of ELISA -
Enzyme-linked immunosorbent assays are applied in many diagnostic tests such as :
● Detect and measure the presence of Antibodies in the Blood -
autoantibodies (ANA), antibodies against Hepatitis A, B, C, HIV etc.
● Detect and estimate the Levels of Tumor Markers - Prostate-specific antigen (PSA),
Carcinoembryonic Antigen (CEA)
● Detect and estimate hormone Levels - Luteinizing hormone (LH), Follicular stimulating
hormone (FSH), Prolactin, Testosterone,Human chorionic gonadotropin (hCG) etc.
● Tracking Disease Outbreaks - Cholera, HIV, Influenza
● Detecting Drug Abuse - Amphetamine, Methamphetamine, cocaine etc.
Some practice questions
Fill in the blanks -
(i) ELISA का full form है ________________
(ii) ELISA एक immunochemical method है जो ____________ reaction पर आधारित है I

9. 9
(iii) ELISA और RIA में अंतर यह है कि ELISA में चिह्नित (tagged) antigen और antibody को radioactive
material क
े स्थान पर _____ से lebel किया जाता है I
(iv) एक सामान्य ELISA plate में _____ wells होते हैं और यह _________ की बनी होती है I
(v) ELISA में BSA का उपयोग unbound sites को _______ करने हेतु किया जाता है जिससे false _______
results को रोका जा सक
े I
(vi) ELISA में primary detection antibody वो specific antibody होती है जो क
े वल protein of interest को
ही ______ करती है I
(vii) ELISA में secondary detection antibody वो second enzyme-conjugated antibody होती है जो
उस _______ antibody को bind करती है जो enzyme-conjugated नहीं होती है I
(viii) ELISA में सबसे अधिक उपयोग होने वाले enzymes हैं ______________ and ______________.
(ix) Alkaline phosphatase क
े लिए substrate ___________ होता है जबकि HRP क
े लिए substrate
__________ होता है I
(x) ELISA में final color की absorbance (OD) एक __________ reader पर लेते हैं I
(xi) complex samples की analysis क
े लिए ______ ELISA का उपयोग करते हैं I
(xii) Indirect ELISA का उपयोग _______ और endogenous _______ क
े detection और उनक
े
concentration दोनों क
े लिए कर सकते हैं I
(xiii) High sensitivity CRP (hs-CRP) का मापन __________ ELISA द्वारा 0.5 से 10 mg/L की range
में कर सकते हैं I
(xiv) hs-CRP का full form है ______________.
Ans. (i) enzyme linked immunosorbent assay, (ii) antigen antibody, (iii) enzyme, (iv) 96,
polystyrene, (v) block, positive, (vi) bind, (vii) primary, (viii) HRP, ALP, (ix) p-nitrophenyl
phosphate, hydrogen peroxide, (x) ELISA, (xi) sandwich, (xii) antigen, antibodies, (xiii) high
sensitivity , (xiv) high sensitivity C-reactive protein
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
PCR एक बहुत ही sensitive तकनीक है जिसका इस्तेमाल clinicians और researchers द्वारा diseases की
diagnosis, gene cloning/sequencing/genome studies और forensic medicine में criminals की
पहचान आदि में एक rapid और sensitive तकनीक क
े रूप में इस्तेमाल होता है I इस तकनीक को सबसे पहले
एक American biochemist और Nobel laureate Dr. Kary Mullis द्वारा develop किया गया था I मूलरूप
से PCR का उपयोग molecular biology में DNA की हज़ारों - लाखों copies बनाने (amplify) क
े लिए होता है
और इसक
े लिए DNA की क
े वल अल्प मात्रा (trace amount) की आवश्यकता होती है, जो blood, skin, hair,
saliva, और microbes से प्राप्त हो सकती है I PCR द्वारा प्राप्त इन DNA copies को फिर conventional
laboratory methods द्वारा analyse करा जा सकता है I PCR तकनीक को समझने से पहले यह जानना ज़रूरी
है कि DNA और RNA क्या होते हैं I
Deoxyribonucleic acid (DNA) -
DNA एक universal genetic material और आनुवंशिकता (heredity) की मौलिक इकाई (fundamental unit)
है I DNA molecule में दो स्वतंत्र (independent) polydeoxyribonucleotide strands होते हैं जो कोशिका क
े
अंदर एक right handed double helix क
े रूप में होते हैं I DNA molecule की backbone phosphodiester
bonds द्वारा जुड़े हुए deoxyribose sugar units की एक श्रृंखला से बनी होती है और इसक
े अतिरिक्त इसमें
nitrogenous bases (two purines - adenine & guanine and two pyrimidines - cytosine & thymine)
भी जुड़े होते हैं जो इस backbone से अंदर की ओर projected होते हैं I एक strand क
े bases दूसरे strand क
े
bases से hydrogen bonds द्वारा जुड़े होते हैं और यह base pairing हमेशा adenine (A) एवं thymine (T)
क
े बीच दो hydrogen bonds द्वारा और cytosine(C) एवं guanine (G) क
े बीच तीन hydrogen bonds द्वारा

10. 10
होती है I इसक
े अतिरिक्त क
ु छ अन्य interactions जैसे hydrophobic और stacking interactions भी होते हैं
जो double helix को स्थिरता प्रदान करते हैं I nitrogenous bases का क्रम और molecular backbone की
लम्बाई प्रत्येक DNA को अपनी विशिष्टता प्रदान करती है I DNA में आनुवांशिक जानकारी (genetic
information) सन्निहित (contiguous) bases क
े triplets क
े रूप में होती है और इन triplets को codon कहते
हैं I प्रत्येक codon एक single amino acid का प्रतिनिधित्व (represent) करता है, जैसे - GGG for glycine,
AGA for arginine I इसक
े अतिरिक्त, AUG, protein synthesis में एक START codon, और UAG , UAA
और UGA STOP codons की भूमिका निभाते हैं I जिस प्रकार एक जीव में कोशिकाओं का विभाजन जीवन भर
चलता है उसी प्रकार DNA बनने की प्रक्रिया भी निरंतर चलती रहती है I इस प्रकार अनुजात कोशिकाएओं
(daughter cells) द्वारा प्राप्त पूरक (complementary) DNA, जनक (parent) कोशिका क
े DNA की मात्रा और
संरचना क
े सदृश (identical) होता है I parent DNA क
े complementary DNA बनने की इस प्रक्रिया को DNA
replication कहते हैं I
Ribonucleic acids (RNA) - ये nucleotides क
े single stranded polymer होते हैं और इनमें शुगर units
ribose होती हैं (DNA में deoxyribose sugar units होती हैं) I DNA molecule की तरह ही RNA की
backbone phosphodiester bonds द्वारा जुड़े हुए ribose sugar units की एक श्रृंखला से बनी होती है और
इसक
े अतिरिक्त इसमें nitrogenous bases [दो purines - adenine (A) एवं guanine (G) and दो
pyrimidines - cytosine (C) एवं uracil (U)] भी जुड़े होते हैं I RNAs सामान्य तौर पर single stranded होते
हैं किन्तु क
ु छ virus में ये double stranded होते हैं I RNAs information transfer में बिचौलिए (middle
man) की भूमिका निभाते हैं I proteins और polypeptides की biosynthesis में अपनी -अपनी भूमिका क
े
आधार पर RNA तीन प्रकार क
े होते हैं - ribosomal RNA (rRNA), messenger RNA (mRNA) and transfer
RNA (tRNA)
DNA RNA
Principle of PCR
PCR में DNA क
े एक short segment को एक primer की मध्यस्थता क
े साथ enzyme DNA polymerase
की मदद से amplify (many copies of DNA are made) किया जाता है I यह primer, DNA का एक short
fragment होता है जिसमें एक defined sequence होता है जो target DNA (जिसे detect और amplify किया
जाना है) क
े sequence का complementary होता है I यह primer laboratory में synthesize किया जाता है
और यह DNA polymerase द्वारा synthesis क
े लिए starting point का काम करता है I इस synthetic
primer को DNA (जिसे amplify करना है) क
े single-stranded template, जिसमें primer का
complementary sequence region होता है, क
े साथ anneal (एनील) कर दिया जाता है I इसक
े बाद DNA
polymerase द्वारा 3' primer end को nucleotides add करक
े बढ़ाया (elongate) जाता है जिससे एक
double stranded DNA का एक extended region बन जाता है I
Process of PCR
Things required -
Sample - A DNA (sample which may be from saliva, blood, hair, skin scraping, etc.)

11. 11
DNA primers - a defined sequence of nucleotides complementary to the target DNA. First the
region of DNA to be amplified is determined and then a pair of primers is synthesized, one on
the forward strand and one on the reverse, that specifically flanks the target region.
DNA polymerase - यह enzyme DNA क
े एक complementary strand की synthesis क
े लिए आवश्यक
होता है I इसमें इस्तेमाल होने वाला heat resistant Taq DNA polymerase thermophilic bacterium,
Thermos aquaticus (Taq) से प्राप्त होता है I
Nucleotide (dNTPs) solution - containing dATP, dCTP, dGTP, and dTTP that is used to build
duplicate DNA strands.
PCR buffer - The major components of PCR buffers include magnesium chloride (MgCl2),
tris-HCl and potassium chloride (KCl). MgCl2 serves as a cofactor for the DNA polymerase,
while tris-HCl and KCl maintain a stable pH during the reaction. The PCR buffer ensures that
optimal conditions are maintained throughout the PCR reaction.
PCR Steps -
PCR process की शुरुआत होती है DNA क
े एक segment को एक उचित tube में ऊपर दिए reagents और
chemicals क
े साथ रखने से I यह tube फिर एक PCR machine या thermal cycler में रखी जाती है I इस
thermal cycler में 3-step प्रक्रिया होती है जो हैं - denaturation, annealing और extension I
Step 1 - Denaturation
इस step में thermal cycler में DNA वाले solution को 94-96 °C पर गर्म करते हैं जिससे heating क
े कारण
hydrogen bonds क
े टूटने से DNA क
े दोनों strands अलग - अलग हो जाते हैं और इस तरह एक जोड़ी
single-stranded polynucleotide molecules प्राप्त होते हैं I
Step 2 - Annealing (primer binding)
इस step में sample mixture को 50 to 60°C (122 to 140°F) तक ठंडा किया जाता है ताकि DNA primers
और DNA polymerase enzyme DNA क
े individual strands (जो heat द्वारा अलग - अलग हो गए थे) से
bind हो जाएं (इसे primers की annealing कहते हैं) I इस समय, mixture solution क
े nucleotides (A, T, C,
G) DNA क
े individual separated strands से pair बनाते हैं I
Step 3 - Extension
अब temperature को 70-75 °C तक बढ़ा देते हैं जो कि Taq polymerase क
े लिए ideal temperature होता है
I इस temperature पर Taq polymerase प्रत्येक primer क
े एक सिरे पर attach हो जाता है और template
DNA क
े complementary target DNA की synthesis और उसका elongation करता है I इस प्रकार, original
sample DNA molecule क
े प्रत्येक single strand से एक नया duplicate double-stranded DNA
molecule बन जाता है I यह cycle thermal cycler द्वारा फिर 35 - 40 बार repeat की जाती है और इस तरह
resulting DNA sequence प्रत्येक heating/cooling cycle में दोगुना हो जाता है I इस प्रकार, एक sample
DNA क
े single short segment को इन doublig cycles द्वारा amplify करक
े उसकी millions of copies
बनाई जा सकती हैं I

12. 12
Analysis of PCR amplified DNA segments
By Electrophoresis -
PCR process complete होने क
े बाद प्राप्त हुए amplified (replicated) segments को known source से
प्राप्त अन्य nucleotide segments से compare करते हैं I PCR-generated nucleotide sequences को
एक separating gel में humans, pathogens, या अन्य sources से प्राप्त known nucleotide sequences
क
े समीप रखते हैं I अब gel क
े through electrical current pass करते हैं जिससे gel में place किये गए
विभिन्न nucleotide sequences electrical charge और molecular size क
े आधार पर सीढ़ीनुमा (ladder)
bands बनाते हैं I एक ही level तक migrate हुए bands या ladder-like steps nucleotide sequences की
identity को दर्शाते हैं I यह PCR tests को पूरा करने क
े तरीकों में से एक अत्यधिक popular तरीका है I
Diagnostic settings में PCR की उपयोगिता को बढ़ाने क
े लिए इसमें बहुत से modifications किये गये हैं
जिसक
े परिणामस्वरुप विभिन्न प्रकार क
े PCR methods प्राप्त हुए हैं, जिनमें सबसे अधिक इस्तेमाल होने वाले
प्रकार हैं - real-time PCR (quantitative PCR or qPCR) और reverse transcriptase PCR (RT-PCR).
Quantitative PCR (qPCR) -
qPCR conventional PCR का ही एक रूपांतर (variant) है और इसक
े द्वारा amplified/replicated DNA की
analysis fluorescent dye (SYBR Green) या एक probe (Taqman) की मदद से PCR की सामान्य 40
cycles क
े वास्तविक समय (real time) में ही कर सकते हैं I यह fluorescent dye क
ु छ nucleotide strands से
attach हो जाती है जिससे amplification/replication cycles क
े दौरान बने specific products क
े amount को
measure कर सकते हैं I Probe में एक quencher और एक repoter fluorescent dye होती है I Taq DNA
polymerase की 5'-3' exonuclease activity द्वारा reporter dye release होकर एक fluorescent signal
generate करती है जो प्रत्येक cycle क
े साथ बढ़ता है I qPCR क
े लिए special thermal cyclers (real-time
thermal cyclers) का इस्तेमाल करते हैं जो PCR reagent tubes की heating और cooling करने क
े साथ -
साथ प्रत्येक cycle में tubes की fluorescence भी measure कर सकते हैं I इस तरह PCR products की
analysis PCR procedure क
े दौरान ही हो जाती है और gel electrophoresis या कोई अन्य method का
इस्तेमाल नहीं करना पड़ता जिससे results कम समय में प्राप्त हो जाते हैं I इस प्रकार, qPCR में amplification
और detection को combine कर दिया जाता है, जबकि conventional PCR में amplification और detection
को अलग - अलग करना पड़ता है I
Reverse transcription PCR (RT PCR) and reverse transcription quantitative real-time PCR
(RT-qPCR)
RT–PCR भी PCR का एक variation है I दोनों तकनीक में समान प्रक्रिया का इस्तेमाल होता है, अंतर क
े वल यह
है कि RT–PCR में एक अतिरिक्त step होता है जिसमें RNA का DNA में reverse transcription (RT) होता है

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और फिर इस DNA का amplification होता है I इसका अर्थ है कि PCR का इस्तेमाल उन pathogens, जैसे -
viruses और bacteria जिनमें पहले से ही amplification हेतु DNA होता है, जबकि RT–PCR का इस्तेमाल उन
pathogens क
े लिए होता जिनमें DNA की बजाए RNA genetic material होता है (जैसे - COVID-19 virus)
और जिसे amplification हेतु पहले DNA में transcribe करना पड़ता है I RT-PCR में RNA को एक template
की तरह इस्तेमाल करते हुए enzyme reverse transcriptase की मदद से single-stranded complementary
DNA (cDNA) की एक single copy generate करते हैं (इस प्रक्रिया को reverse transcription कहते हैं) I इस
cDNA को फिर DNA polymerase की मदद से amplify किया जाता है जिसे standard PCR-based
amplification process द्वारा और अधिक amplify किया जा सकता है I ऐसा इसलिए होता है क्योंकि क
े वल
DNA की ही copies (amplify) बना सकते हैं I
जब इस RT-PCR को quantitative PCR क
े साथ combine कर देते हैं तो इसे RT-qPCR or real time
RT-PCR कहते हैं I उदाहरण :
Real time RT–PCR (RT-qPCR) of COVID-19 virus
मरीज़ क
े नाक या गले, जहाँ COVID-19 virus इकठ्ठा होते हैं, से sample लेते हैं I इस sample से RNA
extract करने हेतु इसे कई chemical solutions से treat किया जाता है I इस extracted RNA में मरीज़ क
े
genetic material और virus क
े RNA (अगर viral infection है) दोनों ही होते हैं I अब इस RNA को एक
specific enzyme reverse transcriptase की मदद से DNA में reverse transcribe करते हैं I फिर
transcribed viral DNA में इसक
े क
ु छ specific parts क
े complementary DNA क
े short fragments add
करते हैं I अगर sample में virus present होगा तो ये small DNA fragments viral DNA क
े target sections
से attach हो जायेंगे I इनमें से क
ु छ added genetic fragments का इस्तेमाल marker labels को add करने में
होता है जो virus detection में काम आता है I इस mixture को RT–PCR machine में डालते हैं जिससे virus
क
े target section की नई और identical copies बनती हैं I इस cycle को कई बार repeat करते हैं और प्रत्येक
cycle में viral DNA क
े target sections की copies दोगुनी हो जाती हैं, जैसे - दो क
े चार, चार क
े आठ आदि I
एक standard real time RT–PCR set-up में आमतौर पर 35 cycles होती हैं I इस तरह इस प्रक्रिया क
े अन्त
में viral DNA क
े target sections की लगभग 35 billion new copies बन जाती हैं I इन viral DNA की new
copies क
े strands से marker label attach हो जाते हैं जो एक fluorescent dye release करते हैं जिसे
computerized machine द्वारा measure किया जाता है और जिसे screen पर देखा जा सकता है I प्रत्येक
cycle क
े बाद sample में fluorescence की मात्रा को computer द्वारा देख सकते हैं और जब एक निश्चित
level से अधिक fluorescence हो जाता है तो यह confirm हो जाता है कि sample में virus present है I
Scientists यह भी देखते हैं कि कितनी cycles क
े बाद यह level प्राप्त होता है जिससे infection की तीव्रता का
अनुमान लगता है I जितनी कम cycles में यह level cross होता है उतना ही तीव्र infection होता है I इसी को
cycle threshold value (CT-value) कहते हैं I The CT (cycle threshold) is defined as the number of
cycles required for the fluorescent signal to cross the threshold (i.e. exceeds background level).
CT levels are inversely proportional to the amount of target nucleic acid in the sample (i.e. the
lower the CT level the greater the amount of target nucleic acid in the sample). ICMR की
guidelines क
े अनुसार अगर किसी मरीज़ क
े sample की CT-value 35 से कम है तो उसे covid positive
मानते हैं और यदि 35 से अधिक है तो covid negative मानते हैं I

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Applications of PCR
● Identification and characterization of infectious agents
● Direct detection of microorganisms in patient specimens
● Identification of microorganisms grown in culture
● Detection of antimicrobial resistance
● Investigation of strain relatedness of a pathogen of interest
● Genetic fingerprinting (forensic application/paternity testing)
● Detection of mutation (investigation of genetic diseases)
● Cloning genes
Some practice questions
Fill in the blanks -
(i) PCR का full form है ______ ______ _____
(ii) RT-PCR में RT का full form है _____ ____
(iii) DNA molecule में दो स्वतंत्र (independent) _________ strands होते हैं I
(iv) DNA molecule की backbone phosphodiester bonds द्वारा जुड़े हुए _______ sugar units की एक
श्रृंखला से बनी होती है I
(v) DNA में पाये जाने वाले purines हैं ______ और ______
(vi) DNA में पाये जाने वाले pyrimidines हैं ______ और ______
(vii) DNA क
े एक strand क
े bases दूसरे strand क
े bases से ______ bonds द्वारा जुड़े होते हैं I
(viii) DNA में base pairing हमेशा adenine (A) एवं thymine (T) क
े बीच ___ hydrogen bonds द्वारा और
cytosine(C) एवं guanine (G) क
े बीच ____ hydrogen bonds द्वारा होती है I

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(ix) DNA में आनुवांशिक जानकारी (genetic information) सन्निहित (contiguous) bases क
े triplets क
े रूप
में होती है और इन triplets को ____ कहते हैं I
(x) parent DNA क
े complementary DNA बनने की इस प्रक्रिया को DNA ______ कहते हैं I
(xi) RNA molecule में उपस्थित pentose sugar का नाम है ________.
(xii) RNA में उपस्थित चार nitrogenous bases है _____, _______, ______ और _____
(xiii) RNA में DNA में उपस्थित Thymine क
े स्थान पर ________ होता है I
(xiv) RNA _________ क
े single stranded polymers होते हैं I
(xv) तीन प्रकार क
े RNA हैं - _______ RNA , _____ RNA और ______RNA
(xvi) PCR तकनीक में Taq DNA polymerase का उपयोग इसलिए करते हैं क्योंकि यह _____ resistant
होता है I
(xvii) Taq DNA polymerase एक thermophilic bacterium से प्राप्त किया जाता है जिसका नाम है _______
(xviii) dATP, dCTP, dGTP, और dTTP में 'd' का मतलब है ________
(xix) PCR machine या thermal cycler में होने वाली प्रक्रिया क
े 3 steps हैं - _______, ______ और
______
(xx) PCR क
े Denaturation step में thermal cycler में DNA वाले solution को ______ °C पर गर्म करते हैं
I
(xxi) PCR क
े Annealing step में sample mixture को ______°C तक ठंडा किया जाता है I
(xxii) PCR क
े Extension step में temperature को ______ °C तक बढ़ा देते हैं I
(xxiii) PCR प्रक्रिया द्वारा DNA sequence प्रत्येक heating/cooling cycle में ____ हो जाता है I
(xxiv) qPCR में 'q' का मतलब __________ है I
(xxv) qPCR द्वारा amplified/replicated DNA की analysis क
े लिए _______ dye का इस्तेमाल करते हैं I
(xxvi) Conventional PCR में amplification और detection की प्रक्रिया ____ _____ होती है I
(xxvii) Real time PCR प्रक्रिया में PCR products की analysis PCR procedure क
े _____ ही हो जाती है I
(xxviii) RT-PCR में RNA को एक template की तरह इस्तेमाल करते हुए enzyme __________ की मदद से
single-stranded complementary DNA (cDNA) की एक single copy generate करते हैं और इस प्रक्रिया
को _______ transcription कहते हैं) I
(xxix) RT–PCR का इस्तेमाल उन pathogens क
े लिए होता जिनमें DNA की बजाए _____ genetic
material होता है I
(xxx) जब RT-PCR को quantitative PCR क
े साथ combine कर देते हैं तो इसे RT-qPCR या ______
_____ RT-PCR कहते हैं I
(xxxi) PCR cycles की वो संख्या जिसक
े बाद एक निश्चित level (background level) से अधिक
fluorescence प्राप्त हो जाता है, उसे ____ value कहते हैं I
(xxxii) ICMR की guidelines क
े अनुसार अगर किसी मरीज़ क
े sample की CT-value 35 से कम है तो उसे
covid ____ मानते हैं और यदि 35 से अधिक है तो covid ______ मानते हैं I
(xxxiii) CT - value में CT का full form _______ है I
Ans. (i) polymerase chain reaction, (ii) reverse transcription, (iii) polydeoxyribonucleotide, (iv)
deoxyribose, (v) adenine, guanine, (vi) thymine, cytosine, (vii) hydrogen, (viii) दो, तीन, (ix) codon,
(x) replication, (xi) ribose, (xii) adenine, guanine, cytosine, uracil, (xiii) uracil, (xiv)
ribonucleotides, (xv) messenger, ribosomal, transfer, (xvi) heat, (xvii) Thermos aquaticus, (xviii)
deoxy, (xix) denaturation, annealing और extension, (xx) 94-96, (xxi) 50-60, (xxii) 70-75, (xxiii)
दोगुना, (xxiv) quantitative, (xxv) fluorescent, (xxvi) अलग अलग, (xxvii) दौरान, (xviii) reverse
transcriptase, reverse, (xxix) RNA, (xxx) real time, (xxxi) CT, (xxxii) positive, negative, (xxxiii)
cycle threshold

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REFERENCES
1. Praither JD.Basic principles of radioimmunoassay testing : a simple approach. J Nucl
Med Tech 23(1):34-43,1985.
2. Radioimmunoassay and related techniques - methodology and clinical applications.
Thorell JI and Larson SM, 1978.
3. A handbook of practical immunology, Edited by G. P. Talwar. 1983
4. Sakamoto S. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative
analysis of plant secondary metabolites. J Nat Med 72(1):32-42, 2018.
5. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR) Lilit Garibyan
and Nidhi Avashia J Invest Dermatol 2013 Mar;133(3):1-4.
Disclaimer : The pictures given in the text have been downloaded from Google images and I
am thankful to the persons who have uploaded these pictures.
Dr. P. K. Nigam
Ph. D.
Retired Biochemist