1. XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN
NHIỄM INFLUENZA A/H1N1 (2009)
TS BS Nguyễn Văn Vĩnh Châu
Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới

2. 2
Nguyeân taéc laáy beänh phaåm
Thaønh coâng cuûa chaån ñoaùn virus Influenza phuï thuoäc raát nhieàu vaøo
Thôøi ñieåm laáy beänh phaåm (3 ngaøy ñaàu sau khôûi beänh)
Chaát löôïng cuûa beänh phaåm (kyõ thuaät laáy beänh phaåm)
Ñieàu kieän baûo quaûn vaø vaän chuyeån beänh phaåm
(Viruùt naèm trong teá baøo bieåu moâ ñöôøng hoâ haáp)
Chuù yù tuaân thuû caùc quy taéc veà an toaøn sinh hoïc (biosafety)
laáy beänh phaåm (ngöôøi thuïc hieän, trang phuïc)
vaän chuyeån beänh phaåm (thieát bò & phöông tieän vaän chuyeån)

3. 3
Loaïi beänh phaåm
Beänh phaåm ñöôøng hoâ haáp TREÂN
Pheát muõi.
Pheát haàu hoïng.
Dòch tî haàu.
Dòch röûa muõi.
Dòch suùc hoïng.
Beänh phaåm ñöôøng hoâ haáp DÖÔÙI
Dòch pheá quaûn.
Dòch pheá nang.
Huyeát thanh
Giai ñoaïn caáp
Giai ñoaïn hoài phuïc

4. 4
Trang bò caàn thieát ñeå laáy beänh phaåm
Beänh phaåm ñöôøng hoâ haáp
Que caùn nhöïa ñaàu coù boâng sôïi toång hôïp (khoâng duøng que caùn tre hoaëc goã)
Duïng cuï laáy dòch khí pheá quaûn
Moâi tröôøng vaän chuyeån virus (1-2mL) chöùa trong loï coù naép vaën, baûo quaûn
ôû nhiệt độ –20oC (chæ coù theå baûo quaûn ôû 4oC trong 1 – 2 ngaøy)
nöôùc muoái sinh lyù, moâi tröôøng nuoâi teá baøo (MEM), canh thang trytose -
phosphat, canh thang beâ, ñeäm sucrose - phosphat..
Moâi tröôøng chöùa BSA; khaùng sinh (Penicillin G (2x106 U/L), Streptomycin (200
mg/L), Polymixin B (2x106 U/L), Gentamycin (250 mg/L), nystatin (0.5x106
U/L), Ofloxacin HCl (60mg/L), sulfamethoxazole (0.2g/L).
Huyeát thanh
Duïng cuï laáy maùu tónh maïch
Tube nhöïa khoâng coù chaát choáng ñoâng coù naép vaën

5. 5

6. 6
Phöông phaùp laáy beänh phaåm
Pheát muõi
Luoàn que boâng vaøo 1 loã muõi, ñöa song song vôùi voøm
muõi vaøo saâu ñeán khi bò khaùng trôû, ñeå yeân vaøi giaây roài ruùt
ra töø töø ñoàng thôøi xoay troøn que chaø saùt cuoán muõi.
Caû 2 loã muõi coù theå ñöôïc laáy baèng cuøng 1 que boâng.
Caét phaàn ñaàu boâng ñaõ pheát muõi cho vaøo loï chöùa moâi
tröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép.
Pheát hoïng
Luoàn que boâng vaøo ngoaùy thaønh sau hoïng vaø 2 beân
vuøng amiñan, traùnh chaïm vaøo ñaùy löôõi.
Caét phaàn ñaàu boâng ñaõ pheát hoïng cho vaøo loï chöùa moâi
tröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép.

7. 7
Phöông phaùp laáy beänh phaåm
Dòch hoïng muõi (pharyngeal nasal fluid)
Söû duïng bình huùt dòch hoïng muõi.
cho vaøo loï chöùa moâi tröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép
Ñaây laø loaïi beänh phaåm cho keát quaû nhaïy hôn hôn pheát hoïng / pheát muõi
Dòch khí pheá quaûn (beänh nhaân coù ñaët noäi khí quaûn)
Söû duïng bình huùt dòch röõa ñöôøng hoâ haáp
cho vaøo loï chöùa moâi tröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép.
Laø beänh phaåm cho ñoä nhaïy cao nhaát
Maãu huyeát thanh
Laáy 3-5mL maùu tónh maïch cho vaøo loï khoâng coù choáng ñoâng.
Phaûi laáy maùu keùp: maùu 1 laáy caøng sôùm caøng toát, maùu 2 laáy caùch 14 – 21 ngaøy.

8. 8
Baûo quaûn & vaän chuyeån beänh phaåm
Beänh phaåm hoâ haáp:
Duøng khaên giaáy hoaëc giaáy veä sinh quaán quanh töøng
oáng hoaëc loï BP,
Ñaët loï Bp trong 1 tuùi nylon (2 lôùp), buoäc (coät) chaët
baèng 2 sôïi daây thun khoanh,
Cho vaøo 1 hoäp cöùng ñeå traùnh beå vôõ.
Caùc que boâng phaûi ñaët trong moâi tröôøng chuyeân chôû
vi ruùt, caùc oáng BP luoân luoân phaûi ñaët ñöùng thaúng.
Vaän chuyeån BP ngay laäp töùc ñeán phoøng thí nghieäm
trong 4oC (phích laïnh).
Coù theå baûo quaûn taïm trong tuû laïnh 4oC trong voøng 48
giôø tröôùc khi chuyeån beänh phaåm ñeán phoøng XN.
Neáu caàn baûo quaûn laâu hôn phaûi ñeå ôû –70oC. Chuù yù
traùnh quaù trình ñoâng laïnh/raû ñoâng nhieàu laàn.
Khi vaän chuyeån beänh phaåm chuù yù caùc nguyeân taéc an
toaøn khi vaän chuyeån beänh phaåm coù khaû naêng laây
nhieãm.

9. 9
Baûo quaûn & vaän chuyeån beänh phaåm
Huyeát thanh
Sau khi quay ly taâm taùch huyeát thanh coù theå baûo quaûn taïm trong tuû
laïnh 4oC trong voøng 1 tuaàn tröôùc khi chuyeån beänh phaåm ñeán phoøng
XN.
Neáu khoâng coù ñieàu kieän ly taâm coù theå ñeå trong tuû laïnh 4oC trong
voøng 24 giôø tröôùc khi chuyeån beänh phaåm ñeán phoøng XN baèng tuùi
nöôùc ñaù.
Neáu caàn baûo quaûn huyeát thanh laâu hôn phaûi ñeå ôû -20oC.
Khi vaän chuyeån beänh phaåm chuù yù caùc nguyeân taéc an toaøn toång quaùt
khi vaän chuyeån beänh phaåm maùu.

10. 10
Nguyeân taéc söû lyù beänh phaåm
Tuaân thuû tuyeät ñoái quy taéc veà an toaøn sinh hoïc (biosafety)
Söû lyù moïi beänh phaåm nghi coù lieân quan ñeán vieâm phoåi do
virus Influenza A/H5, H1_2009 trong:
Class I / II biological safety cabinets
Khi caàn nuoâi caáy virus Influenza A/H5, H1_2009 :
Phoøng BSL3 (Biosafety Level 3 Lab)

11. 11
Kyõ thuaät xeùt nghieäm chaån ñoaùn
Influenza A/H1N1/2009

12. 12
Coù gì khaùc bieät giöõa virus Influenza A/H1N1 2009 vôùi
virus A/H1N1 coå ñieån ?
virus A/H5N1 (cuùm gia caàm) ?

13. 13
ÑIEÅM CHUNG:
virus Influenza A/H1N1 2009
virus A/H1N1 coå ñieån
virus A/H5N1 (cuùm gia caàm)
Nhoùm cuùm A (type A)

14. 14
Ñaëc ñieåm virus
Influenza virus
Type: A và B
80-120 nm
Các proteins:
PB1, PB2, PA (polymerase)
HA: haemagglutinin
NA: neuraminidase
NP (nucleoprotein), M1, M2 (matrix)
NS1, NS2: (nonstructural)
Phân nhóm theo 2 kháng nguyên
H (hemagglutination): có 16 nhóm phụ (H1,2,3 gây bệnh ở người)
N (neuraminidase) : có 9 nhóm phụ (N1 N2 gây bệnh ở người)

15. 15
Influenza A viruses
Neuraminidase (N1-N9)
Hemagglutinin (H1-H16)
RNA
M2 protein

16. 16
ÑIEÅM KHAÙC BIEÄT:
virus Influenza A/H1N1 2009
virus Influenza A/H1N1 coå ñieån
Cuøng phaân nhoùm H1 nhöng
coù caáu truùc di truyeàn khaùc bieät
H
u
m
a
n
H
1
S
w
Forward primer – Probe – Reverse primer i
n
e

17. 17
Phaân laäp
Phaân laäp viruses baèng caùch caáy beänh phaåm vaøo phoâi gaø 10 ngaøy tuoåi
hoaëc moâi tröôøng teá baøo Madin-Darby Canine Kydney cells (MDCK)
Öu ñieåm: khaûo saùt ñöôïc ñaëc ñieåm virus, phaùt hieän taùc nhaân gaây beänh môùi
Khoù khaên: ñoøi hoûi phöông tieän kyõ thuaät, thieát bò (BSL 3 ñoái vôùi H5N1,
A/H1N1 2009)

18. 18
Test nhanh tìm khaùng nguyeân
Test nhanh chæ cho bieát nhieãm cuùm A
Khoâng cho bieát phaân tyùp (subtype H?)

19. 19
Giaù trò aùp duïng cuûa test nhanh
Ñaùnh giaù test nhanh QuickVue Influenza A+B (Quidel)
Tieâu chuaån vaøng: CDC RT-PCR
Thöïc hieän töø 20/4 – 30/5/2009, the Naval Health Research Center
(Faix DJ, Sherman SS, Waterman SH. N Engl J Med. 2009 Jun 29)
Sensitivity (95%CI) Specificity
Swine A/H1N1/09 51% (35% – 67%) 99%
Seasonal A/H1N1 63% (39% - 82%) 99%
Seasonal A/H3N2 31% (14% - 57%) 99%

20. 20
Kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû - PCR
Trình töï ñích
Sôïi keùp DNA
Chuoãi xoaén keùp DNA
Virus

21. 21

22. 22
Quy trình chẩn đoaùn RT-PCR Influenza tại BVBNĐ
Phết họng / mũi, dịch khí phế quản
trong môi trường vận chuyển virus + paired sera
Real time Multiplex rTPCR TaqMan (8 targets/specimen)
Influenza A Influenza B H1 H3 H5 H1_2009 Swine A 2009
(target: M gene) (target: M gene) (target: NP gene)
Pos control = Human RNAs
Reference labs
serology
Additional subtype-specific nuôi cấy & chẩn đóan PCR các
RT-PCRs tác nhân gây bệnh hô hấp khác

23. 23
Khi naøo yeâu caàu laøm PCR
1. Phaùt hieän nhöõng tröôøng hôïp ñaàu tieân / giai ñoaïn dòch
chöa lan trong coäng ñoàng.
2. Chaån ñoaùn beänh:
Dòch teå hoïc
Laâm saøng
(phaûi ñöôïc caùch ly chôø keát quaû)

24. 24
Vaán ñeà khaùc
Khoâng neân queân caùc xeùt nghieäm vi sinh loaïi tröø caùc nguyeân
nhaân gaây nhieãm truøng hoâ haáp khaùc (caáy maùu, caáy ñaøm ñònh
löôïng, caáy dòch röõa khí pheá quaûn, phaùt hieän khaùng nguyeân cuûa
vieâm phoåi do pheá caàu, tìm vi truøng lao, v.v…)
Khi bieän luaän keát quaû luoân luoân phaûi phoái hôïp vôùi yeáu toá dòch teå
hoïc vaø beänh caûnh laâm saøng tröôùc khi ñi ñeán keát luaän sau cuøng.
Moät keát quaû PCR aâm tính khoâng loaïi tröø ñöôïc beänh.

25. 25
TRÂN TRỌNG CẢM ƠN