1. 1-Feb-13

2. Проточная цитофлуориметрия
21-Feb-13
Определение :
автоматизированная световая и флуоресцентная
микроскопия единичных клеток в постоянном потоке.

3. 1-Feb-13 3
Клеточный анализ: статистика
1, 3 или 8 бластов ???
Таблица Rümke: статистические
отклонения

4. 1-Feb-13 4
Проблемы, связанные с
автоматическим подсчетом
Все клетки на одной картинке: слишком медленно
Каждая клетка отдельно: слишком медленно
Детальное рассмотрение: проблемы
дуплетов и «половин» клеток

5. 1-Feb-13 5
Решение: «выстраивание» клеток
«Бороздка» на предметном стекле
Стационарная секция изображения
© CONATEX Didactic
Непрерывная подача образца

6. Схема цитофлуориметра
61-Feb-13
Лазер
Образец
Обжимающая
жидкость
Отходы
Детектор

7. Предмет анализа
71-Feb-13
Клетки крови Хромосомы
Водоросли Простейшие
Частицы размера 0,5 – 50 мкм

8. Пример: иммунофенотипирование
81-Feb-13

9. Пример: научные исследования
91-Feb-13
X
Y
Сортировка спермы Культивирование дрожжей
Жизнеспособность бактерии
Трансдукция сигнала

10. Какие из этого возникают сложности?
101-Feb-13
• Различные составляющие образца
• Сложные технологии
• Множество пользователей
 Транспортировка, хранение, приготовление образца, обработка патогенов
 Адекватные условия окружающей среды, спецификация и обслуживание
прибора
 Обучение, подготовка к работе на инструменте, документирование

11. Нормативы для лабораторий
111-Feb-13
• Фундаментальные исследования: MIFlowCyt
• Анализ в фармацевтических исследованиях и тестированиях
на безопасность лекарственных средств: GLP Good
Laboratory Practice – свод международных требований к
лабораторным исследованиям (законодательно регулируемо)
• Анализ последующего использования в цикле разработки
лекарственных средств для мониторинга пациентов в
клинических испытаниях и т.д.: схожие с GLP условия
• Анализ в виде контроля качества фармацевтической
продукции: GMP Good Manufacturing Practice – свод
международных требований к производству
• Медицинские диагностические лаборатории: Директивы
Ассоциации Медицинских Работников, Аккредитация

12. Общие требования
121-Feb-13
 Персонал: экспертиза, авторизация
 Помещения: доступ, условия окружающей среды
 Оборудование: обслуживание, отчеты
 Реагенты, логистика
 Валидированные процедуры
 Внутренний и внешний контроль качества
 Референсные значения
 Соответствующая интерпретация
 Все должно быть задокументировано!

13. 1-Feb-13 13
MIFlowCyt

14. 1-Feb-13 14
MIFlowCyt

15. Good Laboratory Praxis (GLP)
151-Feb-13
ВНИМАНИЕ: GLP может иметь различное значение в
разных странах! США: общие положения; Европа:
юридический характер!
Если это не специфичные случаи, описанные
государственным законодательством, правила GLP
применяются ко всем неклиническим исследованиям
по охране здоровья и окружающей среды,
требующие соблюдения правил регистрации или
лицензирования фармацевтики, пестицидов,
пищевых и кормовых добавок, косметических
продуктов, ветеринарных лекарственных и схожих
продуктов и для установления норм дляпромышленных
химических продуктов.

16. Что такое GLP?
161-Feb-13
• Документация, Документация…
Если это не написано, значит, Вы этого не делали!
Лабораторные записи могут «привести» к патентам и
обеспечить финансовую основу для будущей работы!
• Стандартизация
Требует постоянных условий
Повышает качество результатов и, следовательно, качество публикаций,
диссертаций и т.д.

17. Что нужно документировать?
171-Feb-13
• Исходные данные
• Тестовые процедуры
• Реагенты и материалы
• Записи по подготовке
• Журналы по оборудованию и оснащению
• Записи по обслуживанию инструмента
• Записи проверки оборудования
Документы по каждодневной лабораторной
работе:
• Лабораторный журнал
• Записи в журнал инструмента
• Стандартные процедуры оператора (SOP)

18. Стандартные процедуры оператора
181-Feb-13
• Разъяснить как осуществляются рутинные каждодневные
действия
• Обеспечить взаимодействие между исследователями
• Обеспечить полезность для обучения новых пользователей
• Сформировать основу для внедрения системы управления
качества
• Обновлять каждые два года
В клинических исследованиях, SOP
определяются International Conference on
Harmonisation (ICH – Международной
Конференцией по Согласованию) как
«детальные написанные инструкции для
достижения единообразия в действии
специфических функций". (Wikipedia)

19. Основные требования: персонал
191-Feb-13
• Квалификация и обучение
• Предписанные установленные обязанности
• Документация о знаниях и компетенциях
• Адекватное число сотрудников (вакансия!)
• Авторизации
• Периодическое обучение и тренинги
• Документация по всем тренингам

20. Основные требования: помещения
201-Feb-13
• Использовать для необходимых подтверждений (ГМО,
биологические риски и т.д.)
• Оценка риска (лазер, патогены и т.д.)
• Соблюдение условий среды (температура, влажность,
шум, выбрасываемый воздух и т.д.)
• Исключение кросс-контаминации (молекулярная
биология)
• Очистка помещения
• Процедуры по дезинфекции
• Утилизация отходов в соответствии с правилами
• Хранение расходных материалов и реагентов

21. Основные требования: оборудование
211-Feb-13
• Регулярные инспектирование и калибровка
• Отчеты по техническому обслуживанию
• Руководства, заметки производителя и SOP
• Правила в случае неисправности системы
• Авторизация сотрудников лаборатории
• Документирование рабочего времени оборудования
(журнал учета)
• Правила для коллективного использования цитометров
различными группами
• Журнал пользователя

22. Факторы, влияющие на ЦФ анализы
221-Feb-13
Подготовка
• Фиколл или лизис
• С промывкой / без
промывки
• Антикоагулянты
Флуорохромы
• 2,3,4…32 цвета
• Коньюгаты
• Контроли
• Компенсация
Гейтирование
• Иммунологическое гейтирование
• Опознание живая/неживая
• Дискримнация дуплетов
Абсолютный подсчет
(клетки/мкл)
• Одноплатформенный или
двуплатформенный
Цитометр
• Спецификации (лазер,
фильтры…)
• Контроль лазеров и проточной
системы
Нормативные директивы
• GLP, аккредитация
• Планы исследования
• Правила компенсации

23. Пробоподготовка
231-Feb-13
Антикоагулянты
• Аммоний-гепарин: наиболее стабилен (48 ч)
• ЭДТА: удобен, но должен быть использован в
течение 12 ч
• Цитрат: воздействует на поверхностные
маркеры
Лизис
• Хлорид аммония pH- нестабилен
• Versalyse подходит также для безотмывочной пробоподготовки
(абсолютный подсчет!)
• Каждый материал для лизирования приводит к различиям в
характеристиках рассеяния клеток
• Лизис с фиксацией наиболее стабилен. ВНИМАНИЕ: оценка
жизнеспособности!
Агрегаты клеток
• Клеточные фильтры (40 мкм) предотвращают засорение
• Добавление ДНКзы или Коллагеназы / Диспазы

24. Пробоподготовка
241-Feb-13

25. Законы Шапиро по цитофлуориметрии
251-Feb-13
http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/practical-flow-cytometry/index.html

26. Жизнеспособность клеток
261-Feb-13
7-AAD в зависимости от SSC :
погибшие клетки 7-AAD+
исключены
Погибшие клетки неспецифично связывают антитела и,
следовательно, могут приводить к ложно-положительным
результатам.

27. Абсолютный подсчет (клетки/ мкл)
271-Feb-13
Единая платформа: Двойная платформа:
FlowCount-Beads
WBC
% Lymph
• Возможно только с неотмытыми образцами (потеря
клеток!)
• 2 метода: «единая платформа» и «двойная платформа»
«Золотой стандарт»; подсчет
частиц известной концентрации,
добавленных в ту же пробирку в
качестве референсных частиц.
Абсолютный подсчет проведен по
результатам цитометрических и
гематологических данных.
Недостаток: 2 источника ошибок!

28. Референсные значения
281-Feb-13
• Могут зависеть от возраста
• Могут зависеть от пробоподготовки (напр. реагенты
для лизирования)
• Должны быть валидированы для каждого инструмента
Гематологические параметры при
исследовании мышей показывают
удовлетворительные
штаммоспецифические различия!
Ссылка:
http://jaxmice.jax.org/findmice/index.html

29. Зависимость референсных
значений от возраста
291-Feb-13
Comans-Bitter WM et al., J Pediatr 1997

30. Суточные ритмы
301-Feb-13
Работа иммунитета
меняется в течение суток
Суточные часы в макрофагах
контролируют воспалительный
иммунный ответ. Keller M,
Mazuch J, Abraham U, Eom GD,
Herzog ED, Volk HD, Kramer A,
Maier B.
Proc Natl Acad Sci U S A.
2009 Dec 15;106(50):21407-12.

31. Иммунологическое гейтирование
311-Feb-13
ForwardScatter
Side Scatter
SideScatter
CD3 PC7
CD3+
76.6%
CD8FITC
CD4 Pacific Blue
CD8+ LYM
26.2%
CD4+ LYM
49.4%
Debris
Monos
Lymph
Lymphocytes
Monocytes
Granulocytes
Gran
Debris
CD45-PC7
SSC
«Иммунологическое
гейтирование» (напр. CD45 от
SSC) часто позволяет лучше
дискриминировать популяции,
чем гейтирование по рассеянию.

32. Обработка сигнала
321-Feb-13
Time (Time Of Flight)
Voltage

33. Обработка сигнала
331-Feb-13
Time = Time of Flight (TOF) = Width (W)
Integral = Area (A)
Peak = Height (H)

34. Обработка сигнала
341-Feb-13

35. Дискриминация дуплетов
351-Feb-13
Представленные методы:
Цитометр анализирует частицы, но не может различать
единичные события от дуплетов или агрегатов.
Это приводит к ошибочным результатам, особенно
когда анализируется ДНК или редкие события!
Height vs. area Ratio vs. area Height vs. area

36. Контроль
361-Feb-13
Параметры, которые необходимо
контролировать:
• автофлуоресценция
• неспецифическое связывание
антител
• спектральное перекрывание

37. Автофлуоресценция
371-Feb-13
Лазеры возбуждают не только флуорохромы, но и молекулы в клетке,
такие как флавопротеины, NADPH, липиды и т.д.
Чем больше составляющих клетки, тем сильнее автофлуоресценция!
Автофлуоресценция зависит от длины волны возбуждения.

38. Контроль внутренних негативных
событий
381-Feb-13
Негативная популяция в той же
пробирке.
Преимущества: негативные и
исследуемые клетки
обработаны при равных
условиях.
Часто он может заменить
изотипический контроль.
Комбинирует
автофлуоресценцию с
неспецифическим связыванием.

39. Изотипический контроль
391-Feb-13
MF=1,84 MF=164
(89,13)(1,0)
• Анализ неспецифического связывания («контрольная проба»).
• Важно когда нет «внутренних» негативных популяций.
• Контрольные изотипы должны быть связаны с одними и теми же флуорохромами.
• Дополнительное преимущество: расчет относительного изменения в
интенсивности флуоресценции.

40. Изотипический контроль
401-Feb-13
• Изотип антител IgG1, IgG2a, IgM и т.д.
• Количество неспецифического связывания
зависит от изотипа, особенно если клетка
несет Fc рецепторы.
• Неспецифическое связывание может также
вызвать белок-белковые взаимодействия
флуорохромы могут также вногсить свой
вклад.
Julian Voss-Andreae: Angel of the West, 2008
The Scripps Research Institute Florida
© Wikipedia.
Изотипический контроль:
• Из той же группы, что и антитело-мишень
• Тот же изотип
• Конъюгирован с тем же флуорохромом
• НО: без специфических мест связывания на
клетке-мишени

41. Изотипический контроль
411-Feb-13
Предварительные условия для хорошего изотипического контроля:
идентичные условия для изотипического контроля и специфического
антитела!
• Одинаковый изотип!
• Одинаковый флуорохром!
• Концентрация антител при процессе «окрашивания».
• Температура и время инкубации.
• Одинаковый буфер для окрашивания.
• Тандемные коньюгаты от одного производителя.

42. Выбор антител
421-Feb-13
 Pacific Blue®**
 Biotin
 FITC
 Cyanine dyes
 Alexa Fluor Dyes®**
 Alexa Fluor 488
 Alexa Fluor 647
 Alexa Fluor 700
 PE
 APC
 Tandem Dyes
 PE-Texas Red
 PE-Cy5
 PE-Cy5.5
 PE-Cy7
 APC-Alexa Fluor 700
 APC-Cy7
 APC-Alexa Fluor 750
500nm 800nm700nm600nm
FITC
PE
ECD
PECy5
PECy5.5
PECy7/APCy7
APC
Emission Wavelength
RelativeFluorescence
**Registered Product from Invitrogen, Inc. (Molecular Probes, Inc)
Флуорохромы с минимальным или нулевым
спектральным перекрытием упрощают
компенсацию.
С участием тандемных красителей возможно
возбуждать и детектировать сигнал до 5
флуорохромов одним лазером.

43. Спектральное перекрывание
431-Feb-13
525 BP 575 BP

44. Спектральное перекрывание
441-Feb-13
• Необходимо: одноцветное окрашивание для каждого флуорохрома на
панели
• Для анализа спектрального перекрытия должны расматриваться яркие
сигналы
Компенсация зависит от настройки напряжения!

45. Компенсация
451-Feb-13

46. Компенсация
461-Feb-13
Median fluorescence
intensity

47. Избегать компенсации если это
возможно
471-Feb-13
405nm
638nm
488nm
На 3-лазерном инструменте FITC, PC7,
APC и Pacific Blue могут быть
проанализированы без компенсации!

48. Спектральное перекрывание
481-Feb-13
Valid for Beckman Coulter Navios and Gallios

49. 4 флуорохрома без компенсации
491-Feb-13
488nm
638nm
APC
405 nm
Pac Blue

50. Практические методы
501-Feb-13
Основное:
• Слабоэкспрессирующиеся антигены лучше работают с ярким красителем.
• Сильноэкспрессирующеся антигены работают со всеми красителями.
• НО: НУЖНО учитывать спектральное перекрывание!!
• Слабоэкспрессируемые антигены лучше работают на каналах, которые
не подвержены воздействию спектрального перекрывания.
• Яркие антигены лучше работают на каналах, которые не воздействуют
спектральным перекрыванием на другие каналы.
500nm 800nm700nm600nm
FITCFITC
PEPE
ECDECD
PECy5PECy5
PECy5.5PECy5.5
PECy7/APCy7PECy7/APCy7
APCAPC
Emission Wavelength
RelativeFluorescence
500nm 800nm700nm600nm
FITCFITC
PEPE
ECDECD
PECy5PECy5
PECy5.5PECy5.5
PECy7/APCy7PECy7/APCy7
APCAPC
Emission Wavelength
RelativeFluorescence

51. 511-Feb-13
Допускается спектральное перекрывание…
• Между взаимоисключающими маркерами (например, CD3 и CD19, или
CD4 и CD8)
Практические методы

52. 521-Feb-13
Практические методы
Допускается спектральное перекрывание…
• от маркеров субпопуляции к родительским маркерам (напр. CD4 к CD3)

53. 531-Feb-13
Запрещается спектральное перекрытие…
• когда гейтирующий маркер перекрывает маркер субпопуляции
(напр. CD45 в CD3)
Практические методы

54. Переменные в цитофлуориметрии:
Резюме
541-Feb-13
Cells
Детектирование
Клетки
Флуорохромы
Передача сигнала

55. 1-Feb-13

56. 1-Feb-13 56
Концеция Контроля Качества
Fluidiktest
Системная проверка
(Ежедневно)
Проточная система +
лазер
Стандартизация
Настройка инструмента
Компенсация
Спектральное
перекрывание
Контрольный
материал
Проверка результатов
Документрование
Контроль качества
(QC)
Результаты
QC Модуль
Анализ образцов
пациентов
Получение
результатов
Подготовка
отчета
Обслуживание
пприбора
ОШИБКА
Call-центр
Решение
проблемы
ПРОЙДЕНО

57. 1-Feb-13 57
Построено на ISO стандартах в целях
соответствия наивысшим стандартам
качества конструкции и производства
Инвестирование в тестирование продукта
для достижения наивысших нормативных
стандартов сложного медицинского
оборудования
IVD
CE соответствие для всех конфигураций, включая 3-й лазер ?!
CE / IVD - одобрение

58. IQ/OQ (качество на входе/выходе),
GMP (Good Manufacturing Practice)
581-Feb-13

59. Контроль процесса: права и обязанности
591-Feb-13
Многопользовательский доступ
Управление паролем пользователя
Администрирование прав пользователя
Записи пользователя/ журнал регистрации
событий

60. Контроль процесса: штрих-коды
601-Feb-13
Считывание штрих-кода
карусели
положения в
карусели
пробирок
Максимально
возможная
идентификация
образца

61. Контроль процесса: удаленный доступ
611-Feb-13
Система PROService
автоматически
идентифицирует,
отслеживает и решает
проблемы дистанционно
PROService обеспечивает
удаленный доступ к
программному обеспечению,
осуществляющему мониторинг
всей электроники, насосов,
клапанов и т.д. внутри
прибора.

62. Ежедневная проверка системы:
Flow-Check™
621-Feb-13
Частицы Flow-Check™ (6605359)
– проверка проточной системы и оптики
– для Cytomics FC 500 дополнительно
• Flow Check 770 от PC7 Set up Kit (737664) = конфигурация с 1 лазером
• Flow Check 675 от APC Set up Kit (737663) = конфигурация с 2 лазерами

63. Ежедневная проверка системы
631-Feb-13
Отображение
параметров QC в
хронологическом
порядке

64. Ежедневная проверка системы:
FCS-данные
641-Feb-13
8.4.8 • Инструменты с лазерами:
мощность лазера должна
документироваться
ежедневно.
ZLG
Checklist 9, Immunology

65. Проверка функционирования:
8-пиковые частицы(8-Peak Beads™)
651-Feb-13

66. База данных реагентов
661-Feb-13
– Управление
каталожными номерами
и номерами партии
– документирование
сроков годности и
получения
– связана с графиками
Леви-Дженнингса
– простое добавление
новых реагентов

67. Журнал технического обслуживания
671-Feb-13

68. Журнал сервисного обслуживания
681-Feb-13

69. 1-Feb-13 69
Стандартизация
Шаг1: Стандартизация настроек детектора
Шаг2: Анализ спектрального перекрывания

70. 1-Feb-13 70
Полностью автоматизированные
процедуры
FITC PE ECD PC5
CD45 CD4 CD8 CD3
CD45 CD56+16 CD19 CD3
FITC PE ECD PC5 PC7 APC-A750
CD45 CD56+16 CD19 CD3 IgG IgG
CD45 CD4 CD8 CD3 HLA-DR CD38
4 флуоресцентных сигнала: TBNK
Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C
6 флуоресцентных сигналов: TBNK плюс маркеры активации (дополнительно*)
Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C, FC500, Epics XL
* Возможны и другие дополнительные маркеры, напр. CD25-PC7
Только для исследовательских целей

71. 1-Feb-13 71
Контрольные материалы
Использование контрольных материалов позволяет валидировать
применяемые настройки инструмента и, следовательно, является
контролем достоверности работы.
ImmunoTrolTM:
иммунофенотипирование
ImmunoTrol LowTM:
ВИЧ
StemTrolTM:
CD34+ клетки-предшественники

72. 1-Feb-13 72
Контрольные материалы

73. 1-Feb-13 73
Программы внешнего QC
Программы внешнего контроля качества External Quality
Assessment (EQA) приняты во всем мире как бесценные средства
для оценки лабораториями работы своих тестирующих систем.
Результаты объективно сравниваются с результатами других
лабораторий, использующих ту же методологию для каждого
параметра.

74. 1-Feb-13 74
Проточная цитофлуориметрия в
центральной лаборатории

75. 1-Feb-13 75
Полная взаимосвязь

76. 1-Feb-13 76
Концепция полезного QC модуля
Все приложения могут быть
•стандартизированы
• задокументированы (SOP)
• установлены без субъективного ручного
ввода
Все параметры (QC реагенты, работы по обслуживанию,
настройки цитометра и результаты анализа) автоматически
документируются QC модулем.

77. Контроль качества: цели
771-Feb-13
• Стандартизированные процессы
• Стандартизированное приготовление образца
• Контролируемые образцы
• Стандартизированная настройка протоколов
сбора данных
• Контроль действий и QC документация
Относительность результатов
• Меньше ручных манипуляций во время работы и
бОльшая высокопроизводительность
• Гибкая работа с образцами
• Упрощенная работа с образцами
Повышение эффективности

78. Для чего этот продукт?
781-Feb-13

79. Для чего этот продукт?
791-Feb-13
Он влияет на качество Ваших результатов!

80. Вопросы? Комментарии?
801-Feb-13
Спасибо за внимание!
Dr. Andreas Böhmler
Product Manager Flow Cytometry
Reagents and Applications
Europe, Middle East, Africa & India
aboehmler@beckmancoulter.com