Sinh học bài số 4 Đột biến genSinh học bài số 4 Đột biến genSinh học bài số 4 Đột biến genSinh học bài số 4 Đột biến gen

1. Phương
pháp
chuyển
nạp gen ở
vi sinh vật
Nhóm:
Phạm Thị Thúy Vi
Đinh Thị Xuân Diệu
Trần Thảo Nam Trân

2. Tóm tắt
I. Đặc điểm chung của VSV
II.Các VSV biểu hiện gen thường dùng
III.Vector
IV.Các phương pháp chuyển nạp gen
V.Ứng dụng kĩ thuật chuyển nạp gen

3. TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN
GEN Ở SINH VẬT
VI SINH VẬT THỰC VẬT ĐỘNG VẬT
BIẾN NẠP VIRUS VECTOR VIRUS
TẢI NẠP VI TIÊM TẾ BÀO PHÔI
TIẾP HỢP SÚNG BẮN GEN VI TIÊM
XUNG ĐIỆN TINH TRÙNG
CHUYỂN GEN VÀO
PROTOPLAST
…
…

4. I. Đặc điểm chung của
VSV:
 Kích thước nhỏ bé
 Có khả năng sinh sản
nhanh, phát triển mạnh
 Hấp thu nhiều, chuyển
hóa nhanh
 Khả năng thích ứng cao,
dễ phát sinh biến dị
 Môi trường sống rộng
rãi

5. II. Các VSV biểu hiện gen thường dùng:
1. Vi khuẩn:
E.coli:
Ưu:
» Tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện
gen tái tổ hợp mạnh.
» Giảm chi phí hóa chất
» Cấu trúc bộ gen đã biết
» E.coli BL21 được dùng phổ biến nhất.

6. Nhược:
» Khó biểu hiện một số gen( >50kD, giàu
cystein,cầu nối S-S)
» Một số chủng có thể gây bệnh, tạo độc tố
» Khả năng tạo và tiết protein ngoại bào tương
đối thấp.
 Bacillus:
Khả năng tạo và tiết protein ngoại bào mạnh
Chi phí công nghệ thấp
Sản phẩm tương đối cao
Chủ yếu là giống B.subtilis.

7. 2. Virus:
Baculovirus:
Ký sinh trên hơn 600 loài côn trùng
Biểu hiện nhiều loại protein người( α,β -
interferon; inteuleukin 2;…)
Biểu hiện protein có phản ứng glycosyl hóa, cắt
chuỗi peptid tín hiệu
Hiệu quả cao, giá thành sản phẩm giảm.
Tuy nhiên thời gian nuôi cấy lâu, điều kiện và
môi trường nuôi cấy phức tạp.

8. Baculovirus

9. 3. Tế bào nấm men:
S.cerevisiae, Pichia Patoris
Biểu hiện gen sinh vật bậc cao
Dùng được cả 2 loại vector dùng trong proka. và
euka.
Đã giải mã được cấu trúc bộ gen
Không gây bệnh
Biểu hiện được hầu hết các loại protein
Khả năng tạo sản phẩm nhanh

10. III. Vector:
1. Các ứng dụng chủ yếu của vector:
Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một
trình tự DNA xác định
Chuyển các gen vào tế bào hay cơ thể tạo sinh vật
chuyển gen
Sản xuất RNA với số lượng lớn từ DNA được tạo
dòng
Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được
tạo dòng.

11. 2. Nguyên tắc chọn:
Tùy vào kích thước và bản chất đoạn DNA
Dùng chung enzyme cắt và nối
Phải thích hợp với vật chủ (khả năng tái bản tạo
số lượng lớn,không gây ảnh hưởng đến TB chủ)
Gen chỉ thị trong vector dễ nhận biết
Hiệu quả tách dòng cao

12. 3. Các loại vector tách dòng thông dụng:
 Plasmid:
Ưu Điểm
• Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ
• Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp
• Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ
nhanh.
Nhược Điểm
• Kích thước DNA chèn ngắn (1-5 kb)
• Hiệu suất biến nạp vào kí chủ tương đối thấp.
• Không hiệu quả khi biến nạp ở Eukaryote

13. Phage:
Phần lớn sử dụng phage λ
 Ưu:
• Khả năng xâm nhập vào tế bào kí chủ nhanh
ở cả Prokaryote và Eukaryote
• Có thể mang các đoạn cài đến ~20 kb
• Dễ bảo quản do các hạt virus bền ở nhiệt độ
thấp( vd:40 C)
Nhược:
• Phân tích phức tạp
• Hiệu suất nhân lên trong vật chủ không cao

15. Cosmid
 Là vector lai của plasmid và trình tự cos của
phage λ, mang các ưu điểm của hai vector này:
• Khả năng tự tái bản số lượng lớn của
plasmid; hoạt động như một plasmid, không
phá vỡ tế bào
• Có khả năng đóng gói in-vitro như phage -
Có khả năng mang các đoạn ADN cài có
kích thước đến 35 – 45 kb.
 Ứng dụng chủ yếu để thiết lập thư viện bộ
gen

16. NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO
(YAC)
 Ứng dụng để tách dòng các phân đoạn gen
kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn (> 35-45
kb)
Có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 150 đến
1000 kb.
Vector này được tạo ra từ một số trình tự đặc
biệt của nấm men( ARS,CEN,TEL, gen chỉ thị
đặc hiệu trpI).

17. NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO
(BAC)
Về cơ bản giống với nhiễm sắc thể nấm men
nhân tạo nhưng được tạo ra từ nhân tố giới tính
F của VK.
BAC có thể mang các đoạn cài lớn ( 100-300
kb), nhưng ngoài ra có khả năng sao chép
trong E. coli giống như các véctơ plasmid,
cosmid.
Sử dụng được cho cả Proka và Euka.

19. IV. Các phương pháp chuyển nạp gen:
1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng
kỹ thuật sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến:
Tế bào E.coli được nuôi trên môi trường thạch LB (môi
trường nuôi VSV Lucia Bertani)
 Lấy 1 khuẩn lạc E.coli  5ml môi trường LB lỏng,
37oC, lắc 12-16 giờ.
 1 ml dịch vi khuẩn + 99ml môi trường LB, lắc 2-3
giờ  để lên đá trong 1-1,5 giờ

20.  Li tâm lạnh thu cặn tế bào
 Cặn tế bào + 100ml CaCl2 100mM lạnh  để lên đá
15 phút  li tâm lạnh thu cặn
 Cặn tế bào + 40ml CaCl2 100mM lạnh  để lên đá 1
giờ  li tâm thu cặn (tế bào khả biến)
 Tế bào khả biến + 50 µl CaCl2 (15% glycerol)  giữ
lạnh -75oC đến -80oC

21. Kỹ thuật biến nạp
 50µl tế bào khả biến để trên đá 15 phút + 0,5 ng
DNA (vector tái tổ hợp)  đảo nhẹ, để trên đá 15-
20 phút
 Đặt vào bể ổn nhiệt 2 phút, 42oC  đặt lên đá 2
phút
 Thêm 1000µl môi trường LB lạnh, nuôi 37oC ở
máy lắc
 100µl dịch tế bào trải lên hộp Petri, môi trường
thạch LB + ampicilin 50µg/ml + IPTG + X-gal.
 ủ 37oC, 12-16giờ  thu nhận khuẩn trắng

23. 2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nấm men
bằng kỹ thuật xung điện
Chuẩn bị tế bào
 Cấy 1 khuẩn lạc nấm men vào môi trường YPD
(1% cao nấm men + 2% pepton + 2% glucose).
Nuôi ở 28oC, 1 ngày đêm
 30µl dịch nuôi + 100ml YPD, lắc 16 – 18 giờ

24.  Để lên đá 5 – 10 phút  li tâm  lấy cặn hòa với nước
khử ion lạnh  li tâm thu cặn
 Tế bào + 20ml sorbitol 1M  li tâm thu cặn (tế bào
khả biến)
 Hòa cặn với 0,2 ml sorbitol giữ lạnh sâu -75oC đến -
80oC

25. Kỹ thuật xung điện
 50 µl dịch tế bào khả biến + 10 – 15 µg DNA plasmid
tái tổ hợp  trộn  chuyển vào cuvet xung điện
 Thực hiện xung điện 0,25 µF, 200 Ω, 1,5 kV trong 4 – 5
phần nghìn giây
 Bổ sung 1ml sorbitol lạnh  cấy lên môi trường đĩa
thạch

27. 3. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Chỉ thị kháng sinh
 Đơn giản, dễ sử dụng
 Trong môi trường có chất kháng sinh, tế bào chứa vector
tái tổ hợp có gen kháng chất kháng sinh phát triển được
 Tuy nhiên:
 Một số tế bào xuất hiện các đột biến kháng chất
kháng sinh vẫn có thể phát triển được
 Hoặc plasmid không mang gen tái tổ hợp
 Sử dụng đồng thời vời gen chỉ thị màu

28. Chỉ thị màu
 Gen LacZ mã hóa enzyme β–galactosidase.
 Khi có chất cảm ứng IPTG (isopropyl thiogalactoside –
chất đồng đẳng của lactose) enzyme β–galactosidase
được tổng hợp.
 Enzyme β – galactosidase có khả năng thủy phân X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) từ
hợp chất không màu thành màu xanh.

29. Kết quả
 Tế bào chứa LacZ nguyên vẹn (không tạo vector tái tổ
hợp)  tổng hợp enzyme β–galactosidase  thủy phân
X-gal
 khuẩn lạc màu xanh
 Đoạn DNA chèn vào giữa gen LacZ (tạo vector tái tổ
hợp)  LacZ mất hoạt tính  không tổng hợp enzyme
β–galactosidase  không thủy phân X-gal
 khuẩn lạc có màu trắng

32. 4. Phương pháp lai phân tử:
 Chính xác cao
 Thực hiện phức tạp, tốn kém, cần thiết bị chuyên
dụng
 Các bước thực hiện chủ yếu
 Đặt 1 màng lai (nitrocellulose), để các khuẩn lạc
in dấu ở vị trí tương ứng
 Lấy màng lai đem lai với mẫu dò đánh dấu
phóng xạ (hoặc huỳnh quang), mẫu dò phải
tương ứng với đoạn đặc hiệu của gen tái tổ hợp
 Xử lý màng lai bằng NaOH để làm vỡ tế bào và
biến tính DNA

33.  Cố định DNA trên màng lai
 ủ để tạo phản ứng lai  rửa màng loại mẫu dò
không lai
 Thực hiện kỹ thuật phóng xạ tự ghi
Kết quả
 Những vị trí có lai sẽ có chấm đen trên phim nhạy
phóng xạ, hoặc vết màu khi hiện huỳnh quang
 Lựa chọn khuẩn lạc tương ứng trong hộp Petri

35. VI. Ứng dụng của kỹ thuật chuyển nạp gen
1. Sản xuất insulin tái tổ hợp:
 Do các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất,
đóng vai trò chuyển hóa đường
 Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt
insulin.

37. Cấu trúc gen mã hoá insulin ở người
 Gen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST số 11, trên
cánh ngắn (11p)
 Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen ký hiệu I, II
và III
 Vùng mã hóa có kích thước 1430 bp. Trong vùng mã
có 2 intron.
 Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân tử insulin:
Chuỗi peptid tín hiệu (SP), chuỗi B, chuỗi C và chuỗi
A

39. Insulin is made up of 2 chains
= 51 amino acids total
 A chain = 21 amino acids
 B chain = 30 amino acids

40. Sản xuất
insulin tái tổ
hợp

41. 2. Sản xuất hormon sinh trưởng tái tổ hợp
 Hormone sinh trưởng người
(hGH – Growth Hormone) là loại
hormone được sản xuất ở các tế
bào tuyến yên trong não.
 Có vai trò điều hòa quá trình sinh
trưởng và phát triển của xương,
cơ bắp
 thiếu hụt hGH làm cho cơ thể
chậm phát triển, hoặc có thể gây
hội chứng lùn bẩm sinh ở trẻ em
di truyền qua các thế hệ trong gia
đình.

43. Cấu trúc phân tử hormone sinh trưởng
người(hGH)

44. Công nghệ sản xuất hormon sinh trưởng
người TTH
Bao gồm các bước:
 Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước
tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược
 Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-
24 a.a của chuỗi peptid tín hiệu
 Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích
hợp
 Biến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh
khối, tách chiết và tinh sạch hGH
 VSV biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men…

45. 3. Sản xuất vaccin tái tổ hợp và vaccin DNA
 Chia vaccin làm 2 nhóm: truyền thống và tái tổ hợp
 Vaccin truyền thống: vi khuẩn hoặc virus sống đã làm
giảm độc lực.
 Nhược: thời gian bảo quản ngắn, khó bảo đảm an toàn
→ tính độc hồi lại
 Vaccin TTH: protein kháng nguyên sản xuất nhờ kỹ
thuật gen và các vaccin DNA tái tổ hợp.
 Ưu: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi chống các bệnh do
vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan do virus
 Vaccin DNA có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh
hiểm nghèo (ung thư, AIDS,…)

46. Vaccin tái tổ hợp
Vaccin TTH phòng chống viêm gan:
 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B
(HBV) được sản xuất trong nấm men
S.cerevisae từ năm 1981. Bắt đầu sử dụng
từ năm 1986
 Một số sản phẩm vaccin phòng chống
HBV: Recombivax HB, Engeris B,
Genhevac B,… được sản xuất trong tế bào
nấm men và vi khuẩn

47. • Recombinant DNA
•Single gene (subunit)
S-antigen mRNA
cDNA
Express plasmid
S-antigen mRNA
protein
Hepatitis B
vaccine
raised in yeast

48. Vaccin DNA
 Vaccin DNA là tập hợp các gen mã hóa kháng thể
đặc hiệu thường được cài gắn vào các vector biểu
hiện mạnh, khi đưa vào tế bào các gen được dịch mã
tạo các kháng thể đặc hiệu, giúp các tế bào chống lại
sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh.
 Gồm 2 loại: vaccin tập hợp gen kháng nguyên và
vaccin tập hợp gen sinh kháng thể
 Ưu: dễ dàng thiết kế, sản xuất, bảo quản

50. Tài liệu tham khảo:
Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng-
PGS.TS Khuất Hữu Thanh
Sinh học phân tử- Hồ Huỳnh Thùy Dương
Vi sinh vật học – GS. Nguyễn Lân Dũng
http://vi.wikipedia.org
http://baigiang.violet.vn
http://www.slideshare.net