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Lo scopo di questo studio è stato una validazione di un
nuovo approccio molecolare nella valutazione del rischio
neoplastico polmonare, che potrebbe permettere una più
agevole identificazione di soggetti ad alto rischio, per poter meglio pianificare strategie di prevenzione.
Materiali e metodi
Reclutamento dei pazienti e dei controlli
In questa prima fase dello studio, Sono stati reclutati 61
pazienti con NSCLC e 42 controlli presso le seguenti Unità
Operative dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma:
1) Unità Operativa di Pneumologia ed Endoscopia Toracica;
2) Unità Operativa di Chirurgia Toracica; 3) Unità Operativa
di Scienze Radiologiche. I dati anamnestici sono stati raccolti e inseriti in un database, per ogni singolo paziente sono
stati registrati età, sesso, abitudine tabagica (ex=non fumavano da almeno un anno), patologie associate, stadio della
malattia. I casi/controlli sono stati selezionati tra i pazienti
che si sottoponevano a TC o broncoscopia per approfondimenti diagnostici di sospette neoplasie polmonari, oppure ad
indagini radiologiche. Venivano classificati come casi i pazienti con diagnosi finale di tumore polmonare non a piccole
cellule (NSCLC), controlli tutti i pazienti con diagnosi di patologie polmonari non neoplastiche. Le caratteristiche dei
pazienti sono riassunte in Tabella I.
La valutazione di diagnosi e stadio era basata sulle linee guida dell’International Union Against Cancer TNM
staging system (8), ossia tramite approfondimenti diagnostici che hanno permesso di valutare l’estensione della
neoplasia e l’eventuale invasione a distanza e comprendevano l’esecuzione di TC toraco-addominale ed ecografia
addominale e, se indicato, anche TC cerebrale e scintigrafia ossea, laddove si era sospettato un coinvolgimento dell’encefalo o del sistema scheletrico. Inoltre, si è giunti alla
definizione dell’istotipo del tumore attraverso l’esame
istologico. I soggetti reclutati sono stati adeguatamente
informati sulla finalità dello studio e hanno firmato un
consenso informato. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell’Università di Parma e condotto in
conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
Tabella I. Caratteristiche dei soggetti arruolati nello studio
Controlli (N=42)
NSCLC (N=61)
Sesso
12 F/30 M
18 F/43 M
Età
62.9 (SD: 9.2)
68.6 (SD: 8.4)
Fumo
12 no/18 ex/12
fumatori
8 no/24 ex/29
fumatori
Pacchi/Anno
29.1 (16.8-46.3)
43.0 (30.2-58.2)
Diagnosi
19 Noduli
23 Altro
37 ADK
18 SCC
6 Altro
Stadio
19 IA
14 IB
5 IIA-B
10 III-IV
5 ND
Condensato dell’aria esalata
Raccolta del condensato dell’aria esalata (CAE)
La raccolta del CAE è stata effettuata mediante un
condensatore portatile (TURBO DECCS, MEDIVAC,
Parma, Italia) alla temperatura di -5°C, chiedendo ai soggetti di respirare a volume corrente per circa 15 minuti attraverso un boccaglio monouso connesso al sistema di
condensazione. I campioni sono stati conservati a -80°C
fino all’esecuzione dell’analisi. I campioni di aria esalata
sono stati raccolti da ciascun soggetto mediante un’espirazione lenta a capacità vitale, utilizzando il Bio-VOC
(Markers International Ltd, Rhondda Cynon, UK). Tale
sistema di raccolta è costituito da uno speciale contenitore in Teflon fornito di una valvola ad una sola via sia in
entrata che in uscita, che permette di trattenere gli ultimi
150 ml dell’esalato. Dopo aver aggiunto 1 μl di 10-5 M di
soluzione di standard interno (IS) in ogni contenitore, i
Bio-VOC sono stati conservati a 4° C ed analizzati entro
2 ore (9, 10).
Biomarcatori nel CAE e nell’aria esalata
Il perossido d’idrogeno nel condensato è stato misurato utilizzando un kit commerciale (Amplex Red kit, Molecular Probes, Eugene, Usa) con un limite di rilevabilità
(LOD) di 0.02 µM (11). I 13 VOCs già precedentemente
utilizzati (9) e le Aldeidi (10) sono stati misurati mediante
SPME accoppiata a GC-MS.
DNA circolante
Il sangue periferico dei soggetti è stato prelevato in
provette contenenti EDTA ed entro 2 ore dal prelievo è
stato centrifugato a 3000 rpm per 20 minuti. Il plasma è
stato quindi prelevato ed ulteriormente centrifugato a
14000 rpm per 5 minuti per eliminare ogni eventuale contaminazione cellulare. Sono stati estratti 600 μl di tale plasma con kit commerciale Pure Link Genomic DNA Mini
kit (Invitrogen, UK) e congelati a -20°C. La quantificazione del DNA plasmatico è stata svolta con tecnica di
Real Time PCR (12).
Analisi statistica
A causa di deviazioni significative dalla normalità (test
di Kolmogorov-Smirnov), tutte le variabili diagnostiche
considerate sono presentate con la mediana (range interquartile), con conseguente applicazione di test esclusivamente non parametrici. Nel caso di confronti tra due
gruppi, è stato utilizzato il test di Mann-Whitney. Per
quanto riguarda le correlazioni, è stato utilizzato il test di
Spearman. Tutti i tests sono stati effettuati con PASW 18
(SPSS, USA) o con PRISM 4.0 (Graphpad, USA) ed è
stata scelta una soglia di significatività di 0.05.
Per valutare il potere diagnostico delle singole variabili, sono state costruite curve ROC considerando i seguenti parametri:
– Potere diagnostico: è stata calcolata l’area sotto la
curva (AUC) con l’intervallo di confidenza al 95%. Il
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potere diagnostico è stato considerato significativo
quando l’estremo inferiore di tale intervallo era >0.5.
– Il valore di cut-off con i conseguenti calcoli di sensibilità e specificità era il punto di flesso della curva ROC
(somma di sensibilità e specificità massima).
Nel caso di analisi multivariata, le probabilità di appartenenza ad un gruppo calcolate mediante regressione
logistica sono state utilizzate per costruire le curve ROC.
mentre si aveva un aumento della specificità (83.9%) al
punto di flesso della curva ROC (dati non mostrati).
H2O2-CAE correlava debolmente con P/Y (r=0.38.
p<0.05), così come C9, trans-2-eptanale e trans-2-nonenale (r compresi tra 0.3 e 0.36) solo nel gruppo di controllo. Nel gruppo di malati, trans-2-eptanale e trans-2-nonenale erano leggermente più alte nei soggetti con ADK
rispetto a SCC (p<0.05), mentre l’effetto dello stadio non
era mai significativo (I-II vs. III-IV).
Risultati
Discussione
Alcuni biomarcatori risultavano aumentati nel gruppo
di pazienti con NSCLC: H2O2 -CAE (p<0.01), pentano
Questo studio, collocabile all’interno di un Progetto
(p<0.05), esano (p<0.05), nonenale-C9 (p<0.01), trans-2Regionale nato per la diagnosi non-invasiva del tumore
eptanale (p<0.05) and trans-2-nonenale (p<0.01). Al conpolmonare, racchiude circa i 2/3 dei pazienti finora reclutrario, pentanale-C5 risultava diminuito (p<0.05) (Tatati, e per questa regione i risultati vanno considerati anbella II). Per gli altri VOCs e il DNA circolante le diffecora preliminari. Tuttavia, il principale vantaggio rispetto
renze tra i due gruppi risultavano significative (dati non
a tanti altri studi presenti in letteratura è che i bias presenti
mostrati). H2O2-CAE risultava il biomarcatore con magnel reclutamento dei soggetti di controllo sono assai rigiore potere diagnostico se considerato singolarmente.
dotti, in quanto i soggetti di controllo sono stati reclutati
Nella curva ROC, AUC=0.66 (95%CI: 0.55-0.76) con
direttamente nei reparti dove venivano effettuate le analisi
una sensibilità di 65.6% ed una specificità di 64.3% al punto di flesso (0.22
µm, dati non mostrati). Dopo aver verificato l’indipendenza reciproca dei
biomarcatori considerati per evitare
multi-collinearità, si è quindi proceduto all’analisi multivariata considerando un pattern di sostanze.
Le variabili significative, insieme a
quelle non significative ma con p<0.2
(2-metilpentano, etilbenzene, butanaleC4, octanale-C8), sono state incluse
nel modello della regressione logistica
utilizzata poi per costruire la curva
ROC, riportata in Figura 1.
Al punto di flesso, la sensibilità era
73.8% and la specificità 76.2%; AUC
era 0.799 (0.713-0.884), indicando un
buon potere diagnostico.
Infine, N=31 soggetti per gruppo
venivano accoppiati per sesso, età ed
abitudini tabagiche, ed in questo caso Figura 1. Curva ROC costruita con le probabilità di appartenenza al gruppo
si manteneva la sensibilità (71%), ottenuta con la regressione logistica. In nero è riportato il punto di flesso
Tabella II. Andamento dei biomarcatori risultati significativamente diversi tra i due gruppi. I dati sono riportati
come mediana (intervallo interquartile)
Controlli
NSCLC
Sig. (p)
H2O2-CAE (µM)
0.17 (0.11-0.42)
0.33 (0.15-1.10)
0.008
Pentano (pM)
233.7 (128.2-770.1)
471.9 (239.1-1320.5)
0.011
Esano (pM)
25.4 (8.2-50.0)
40.3 (22.7-69.2)
0.011
C5 (pM)
36.9 (20.9-59.6)
24.6 (14.8-45.0)
0.015
C9 (pM)
26.4 (20.4-40.8)
36.3 (30.4-52.8)
0.007
Trans-2-eptanale (pM)
1.7 (1.0-6.7)
6.6 (1.0-10.1)
0.039
Trans-2-nonenale (pM)
2.6 (1.7-4.9)
4.6 (2.5-9.9)
0.005
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diagnostiche (TAC, broncoscopia), in seguito alla presenza di sintomi polmonari o in presenza di noduli polmonari da seguire in follow-up ma con diagnosi negativa
per il tumore polmonare. Questo ha permesso di avere un
campione di controllo ben bilanciato per quanto riguarda
sesso ed età rispetto ai pazienti con NSCLC, e con variazioni accettabili per quanto riguarda le abitudini tabagiche. H2O2-CAE è indicato in molti studi come indicatore
sensibile di infiammazione e stress ossidativo (13). Nel
CAE, abbiamo osservato dei livelli significativamente più
alti di H2O2 nei soggetti malati rispetto al gruppo di controllo. C’è inoltre da osservare che, costruendo con H2O2
una curva ROC, nonostante AUC sia significativamente
maggiore di 0.5, indicando quindi un significativo potere
diagnostico, al valore di cut-off (0.22 µM) sensibilità
(63.5%) e specificità (67.3%) non consigliano l’utilizzo di
H2O2-CAE come singolo test di diagnosi, questi risultati
erano peggiori per i VOCs risultati significativamente diversi tra i due gruppi. Questo rendeva quindi necessario
l’utilizzo di un test multivariato tenendo contemporaneamente conto di un pattern di sostanze.
Le aldeidi volatili (da C3 a C9 + le forme trans-2 esanale, eptenale e nonenale) costituiscono un valido pattern
che potrebbe essere utilizzato per valutare lo stress ossidativo, in quanto sono specie chimiche altamente reattive
che derivano dalla perossidazione lipidica. Anche pentano
ed esano sono comunemente considerati biomarcatori di
stress ossidativo (9, 10). Nel nostro studio, abbiamo visto
una diminuzione significativa di C5 ed un aumento significativo di C9, trans-2-nonenale e, alla soglia di significatività, di trans-2-eptenale. I risultati sono diversi da quelli
precedentemente pubblicati da noi, dove risultavano più
alti i livelli di tutte le aldeidi C3-C9, per il semplice fatto
che in tal caso era stato preso come gruppo di controllo un
gruppo di soggetti sani non fumatori per una comparazione preliminare (10). Se da un lato il fumo aveva un’influenza modesta su alcuni dei parametri solo considerando
il gruppo di controllo, merita ulteriori approfondimenti
l’effetto dell’istotipo sui livelli di trans-2eptanale e trans2-nonenale.
Considerando il discreto potere diagnostico del pattern
di sostanze sia per dati indipendenti che accoppiati, abbiamo provato a fare una simulazione di tipo diagnostico.
Se applicassimo tale test in prima battuta e quindi la PET
solo sui positivi al nostro test in un campione di 500 noduli
con prevalenza del tumore del 5% (25 malati e 475 sani),
con i primi valori di sensibilità e specificità (dati indipendenti) si otterrebbero 9 falsi negativi (individueremmo cioè
95
16/25=64% dei tumori) e 12 falsi positivi (12/475=2.5%),
mentre con la sola PET avremmo 50 falsi positivi. Applicando le sensibilità e specificità ottenute in seguito all’appaiamento, avremmo 9 falsi negativi e 8 falsi positivi. È
evidente in entrambi i casi l’aumento della specificità nell’esclusione della malattia dei due test applicati in serie.
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Richiesta estratti: Prof. Massimo Corradi, Dipartimento di Clinica Medica, Nefrologia e Scienze della Prevenzione, Università di
Parma, Via Gramsci 14, 43126, Parma, Italy, E-mail: massimo.corradi@unipr.it, tel: +390521033098
