молекулярная биомедицина. часть 2

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
МОЛЕКУЛЯРНАЯ
БИОМЕДИЦИНА
Часть 2
Учебное пособие для вузов
Воронеж
Издательский дом ВГУ
2014
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

2
Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета
15 мая 2014 г., протокол № 9
Составители: О.А. Сафонова, А.А. Агарков, М.В. Лущик, А.В. Семенихина,
Т.Н. Попова, Т.И. Рахманова
Рецензент профессор кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского
государственного университета, д-р биол. наук, профессор Т.А. Ковалева
Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и мик-
робиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государствен-
ного университета.
Рекомендуется для студентов биолого-почвенного факультета 4-го курса
очной и очно-заочной форм обучения, для магистрантов 1-го года обучения.
Для направлений 020400 – Биология (бакалавриат); и 020400м – Биология
(магистратура)

3
СОДЕРЖАНИЕ
Генетическая диагностика.................................................................................. 4
Введение............................................................................................................... 4
Выделение и анализ нуклеиновых кислот........................................................ 5
Качественный анализ нуклеиновых кислот......................................... 5
Количественный анализ нуклеиновых кислот..................................... 5
Некоторые ферменты, применяемые в молекулярной диагностике.............. 6
Нуклеазы и их применение.................................................................... 6
Ингибиторы РНКаз и их практическое применение........................... 7
Рестриктазы ............................................................................................. 7
Гибридизационные методы................................................................................ 8
Метод гибридизации в растворе.......................................................... 11
Метод гибридизации на твердом носителе........................................ 11
Гибридизация in situ ............................................................................. 11
Блот-гибридизация................................................................................ 13
Блот-гибридизация по Саузерну ......................................................... 14
Метод сэндвич-гибридизации ............................................................. 15
Метод разветвленной ДНК .................................................................. 16
Методы амплификации нуклеиновых кислот................................................ 16
Полимеразная цепная реакция............................................................. 17
ЛЛииггааззннааяя ццееппннааяя ррееааккцциияя .......................................................................................................................................... 3322
ММооллееккуулляяррннааяя ддииааггннооссттииккаа ггеенннныыхх ббооллееззннеейй ...................................................................... 3333
ММееттооддыы ппееррввииччнноойй ииддееннттииффииккааццииии ммууттаацциийй ........................................................................ 3333
ММооллееккуулляяррннооее ссккааннииррооввааннииее ииззввеессттнныыхх ммууттаацциийй.......................................................... 3388
ММееттоодд ППЦЦРР//ЛЛООЗЗ........................................................................................................................................................................ 4400
ИИссппооллььззооввааннииее ДДННКК--ббииооччииппоовв........................................................................................................................ 4422
ББииооииннффооррммааттииккаа................................................................................................................................................................................................ 4444
ЦЦееллии ии ззааддааччии ббииооииннффооррммааттииккии ............................................................................................................................................ 4455
ППррииккллааддннааяя ооббллаассттьь ббииооииннффооррммааттииккии........................................................................................................................ 4477
ААннааллиизз ггооммооллооггииччннооссттии ппооссллееддооввааттееллььннооссттеейй.................................................................... 4477
РРааззррааббооттккаа ллееккааррссттввеенннныыхх ппррееппааррааттоовв.............................................................................................. 4477
ППррооггннооззииррууюющщииее ффууннккццииии .................................................................................................................................... 4488
ППррииммееччаанниияя вв ммееддииццииннее.............................................................................................................................................. 4488
ББииооииннффооррммааттииккаа ппооссллееддооввааттееллььннооссттеейй............................................................................................ 4499
ССттррууккттууррннааяя ббииооииннффооррммааттииккаа.......................................................................................................................... 5511
ККооммппььююттееррннааяя ггееннооммииккаа ............................................................................................................................................ 5533
ППррииммееннееннииее ннееккооттооррыыхх ммееттооддоовв ааннааллииззаа ддлляя ппооллууччеенниияя
ннооввыыхх ббииооллооггииччеессккиихх ззннаанниийй ............................................................................................................................ 5555
РРааззррааббооттккаа ннооввыыхх ммееттооддоовв ааннааллииззаа ббииооллооггииччеессккиихх ддаанннныыхх ........................ 5599
РРааззррааббооттккаа ннооввыыхх ббаазз ддаанннныыхх .................................................................................................................................................... 6611
ООттккррыыттииее ллееккааррссттввеенннныыхх ппррееппааррааттоовв ии ффааррммааккооииннффооррммааттииккаа ...................................... 6644
ООттккррыыттииее ллееккааррссттввеенннныыхх ппррееппааррааттоовв.................................................................................................. 6644
ООппррееддееллееннииее ооппыыттннооггоо ссооееддииннеенниияя........................................................................................................ 6666
ППррооггррааммммыы ппооииссккаа ........................................................................................................................................................................................ 6699

4
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
Введение
Среди большого числа исследовательских методов и новых техноло-
гий, обогативших клиническую медицину за последние десятилетия, важ-
ное место принадлежит разработке и практическому внедрению современ-
ных молекулярно-генетических методов. Они основаны на непосредствен-
ном анализе молекул ДНК и РНК. На основании анализа данных молекул
возможно проведение ранней и более полной диагностики ряда инфекцион-
ных заболеваний, идентификация организмов (в частности, по следам кро-
ви, спермы и других тканей), а также выявление генных (хромосомных) му-
таций (в том числе и пренатальное), что необходимо для решения ряда кли-
нических и фундаментальных задач.
Исходным материалом для проведения ДНК-диагностики заболеваний,
обусловленных мутациями ядерных генов, могут служить любые клетки ор-
ганизма, содержащие ядро. Обычно для этих целей используют лейкоциты,
выделяемые из 5–20 мл периферической крови. В некоторых случаях (на-
пример, при митохондриальных болезнях, обусловленных мутациями мито-
хондриальной ДНК с преимущественной экспрессией мутации в мышечной
ткани) более адекватным источником ДНК являются биоптаты мышц. Гено-
диагностика может также проводиться на основе исследования ДНК, выде-
ляемой из клеток эпителия полости рта, кожных фибробластов и т.д. При
проведении пренатальной ДНК-диагностики у плода (обычно на 10–21-й не-
деле беременности) источником ДНК служат биоптаты хориона, плаценты,
клетки амниотической жидкости или лимфоциты пуповинной крови плода.
При выявлении инфекционных заболеваний исходным материалом
может служить сыворотка крови, моча, мокрота, соскобы мочеполовых пу-
тей и т.д.
Большинство методов анализа структуры фрагментов ДНК и РНК
осуществляется с помощью различных методик электрофореза (ЭФ) в ага-
розном или полиакриламидном (ПАА) гелях. В подобранных стандартных
условиях именно подвижность молекул нуклеиновых кислот (НК) при элек-
трофорезе является ключевым анализируемым параметром, зависящим от
конкретных характеристик изучаемого фрагмента (например, от его вели-
чины или конформации).
Для визуализации молекул ДНК по результатам проведенного ЭФ мо-
гут использоваться окраска их нитратом серебра, бромистым этидием
(дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходя-
щем УФ-свете) или мечение различными флюорохромами (дающими
флюоресценцию определенной длины волны при возбуждении лазерным
лучом). Для окраски РНК можно также применять толуидиновый синий,
метиленовый синий.

5
Более сложный метод визуализации ДНК – авторадиография – осно-
ван на введении радиоизотопной метки в состав анализируемых макромо-
лекул; по окончании ЭФ на гель с радиоактивно мечеными молекулами
ДНК накладывается рентгеновская пленка, и положение различных фраг-
ментов ДНК в геле определяется в виде соответствующих полос на прояв-
ленной пленке.
Выделение и анализ нуклеиновых кислот
Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно
лизировать (например, с помощью воздействия высокой температуры или
детергентами). Пробоподготовка проводится также с целью удаления кле-
точных белков, в частности, различных РНКаз. Для депротеинизации ис-
пользуют 2 метода: 1) обработка белков протеазами (например, протеина-
зой К) в присутствии ЭДТА и детергентов (например, саркозила); 2) дена-
турация и экстракция органическими растворителями (например, фенолом и
хлороформом). Из водных растворов геномную ДНК можно осадить добав-
лением этанола или изопропанола. К настоящему времени также разработа-
ны специальные сорбенты для осаждения ДНК (РНК) из раствора.
Для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных
белков (в том числе РНКаз) можно использовать гуанидинтиоцианат –
сильный денатурирующий агент.
Конечный размер получающихся фрагментов ДНК (РНК) зависит от
действия клеточных нуклеаз и механического разрушения НК в процессе
выделения.
После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших ис-
следований необходимо определить чистоту препаратов и размер молекул.
При наличии загрязнений повторно проводят обработку протеиназой К и
экстракцию фенолом/хлороформом. ДНК должна быть достаточно высоко-
молекулярной, чтобы можно было проводить планируемые эксперименты, а
РНК должна быть интактной.
Качественный анализ нуклеиновых кислот
ДНК (одно– и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со
скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молеку-
лярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем
двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК пропор-
циональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов),
можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое
перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого
фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеи-
новых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они переме-
щаются при электрофорезе.

6
Количественный анализ нуклеиновых кислот
Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе наиболее ши-
роко используется 2 метода. Более простым и точным является спектрофо-
тометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувстви-
тельностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то кон-
центрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуорес-
ценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.
1. Спектрофотометрический метод
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать,
измерив его оптическую плотность (D) при 260 нм. Одна единица D при-
мерно соответствует концентрации двухцепочечной ДНК 50 мкг/мл и кон-
центрации одноцепочечной ДНК и РНК 40 мкг/мл. Для оценки чистоты об-
разцов можно использовать отношение между D при 260 и 280 нм. Для чис-
тых препаратов ДНК и РНК оно должно быть равно соответственно 1,8 и 2.
Если это соотношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или
фенолом, и оценка концентрации будет неверна.
2. Окрашивание бромистым этидием
А) Электрофоретический метод
Для примерной оценки концентрации препаратов ДНК или РНК на
гель наносят разные количества маркерных нуклеиновых кислот. Концен-
трацию исследуемых ДНК или РНК в образце оценивают, сравнивая интен-
сивность флуоресценции образца и стандартных маркеров с известной кон-
центрацией. При этом важно, чтобы образцы ДНК и РНК сравнивались с
соответствующими маркерами, поскольку при одинаковом количестве ДНК
и РНК интенсивность их флуоресценции в УФ-свете различается.
Б) Метод пятен
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно определить, ок-
расив раствор бромистым этидием, измерив интенсивность флуоресценции в
УФ-свете и сравнив ее с флуоресценцией маркеров известной концентрации.
Как и при электрофоретическом методе, маркеры должны представлять со-
бой нуклеиновые кислоты соответствующего типа (т.е. ДНК или РНК).
Для количественного определения РНК можно использовать также
орциновый метод, ДНК – дифениламиновый.
Некоторые ферменты, применяемые в молекулярной диагностике
Нуклеазы и их применение
Нуклеазы – ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты до мо-
но- и олигонуклеотидов, по характеру своего действия относятся к фосфо-
диэстеразам. Концевые мононуклеотиды отщепляются экзонуклеазами;
расщепление внутри полинуклеотидной цепи осуществляют эндонуклеазы.
Нуклеазы могут расщеплять РНК или ДНК (в соответствии с чем разделяют
РНКазы и ДНКазы), а также и те, и другие (неспецифические нуклеазы).

7
В лабораториях нуклеазы применяют для очистки препаратов от нук-
леиновых кислот определенного вида, для установления структуры иссле-
дуемых нуклеиновых кислот, изучения механизма их распада и синтеза.
Нуклеазы в молекулярной клинической диагностике применяют:
1) для обеспечения отрицательного контроля в результате удаления
нуклеиновой кислоты-мишени;
2) при обработке РНКазой повышается специфичность гибридизации
ДНК-ДНК, а при обработке ДНКазой – специфичность анализа РНК;
3) для проверки специфичности зонда – обработка перед гибридиза-
цией РНКазой должна приводить к исчезновению сигнала, возникающего
при связывании РНК с зондом, а ДНКазой – не должна влиять на РНК-
специфичный сигнал.
Ингибиторы РНКаз и их практическое применение
РНК по сравнению с ДНК гораздо более лабильна и чувствительна к
действию нуклеаз. Кроме того, РНКазы менее чувствительны к действию
денатурирующих белки веществ, чем ДНКазы. Все это затрудняет получе-
ние полноразмерной РНК и заставляет проводить инактивацию РНКаз од-
новременно с лизисом клеток. Вся используемая вода должна быть обрабо-
тана 0,1%-м диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Ингибиторы РНКаз должны
использоваться везде, где это возможно: в буферах для выделения РНК, при
последующих экспериментах, при хранении РНК в водных растворах.
Можно выделить белковые и небелковые ингибиторы РНКаз. Белковые ин-
гибиторы РНКаз производятся несколькими фирмами (например, Sigma),
однако они могут денатурировать под действием определенных агентов или
деградировать под действием протеаз. Некоторые фирмы (например, Sigma)
производят ванадил-рибонуклеозидные комплексы. Это комплексы, образо-
ванные ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеозидов, которые
связываются со многими РНКазами и практически полностью их ингиби-
руют. Однако они ингибируют трансляцию РНК в бесклеточной системе
синтеза белка.
Рестриктазы
Рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) – это фермент бактери-
ального происхождения, распознающий специфическую нуклеотидную по-
следовательность длиной от 4 до 10 н.п. и разрезающий двунитевую моле-
кулу ДНК в этом месте (сайте рестрикции).
В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в моле-
куле ДНК различают 3 класса рестриктаз: часто-, средне– и редкощепящие.
Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических мар-
керов ДНК. Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут
быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиак-

8
риламидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная
масса, а, значит, и физическое расстояние между сайтами.
Рестриктазы широко используются при определении первичной
структуры ДНК, для картирования генов и в генетической инженерии для
создания и клонирования гибридных молекул ДНК.
Гибридизационные методы
Гибридизационный анализ, или генное зондирование, – это направле-
ние по определению специфических нуклеотидных последовательностей
ДНК и РНК.
В основе гибридизационных методов лежит способность нуклеино-
вых кислот к гибридизации – образованию двухцепочечных структур за
счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов.
Зонд – меченая молекула ДНК (РНК), гибридизующаяся с изучаемым
комплементарным участком геномной ДНК или РНК.
Выделяют 3 основных типа зондов:
а) фрагменты комплементарной ДНК (кДНК), входящие в состав
плазмидного вектора или изолированные;
б) комплементарная РНК (кРНК), встроенная в плазмидный вектор,
который содержит сайт инициации транскрипции, распознаваемый бакте-
риальной РНК-полимеразой (обычно SP6);
в) синтетические некодирующие олигонуклеотиды, полученные с
помощью автоматического ДНК-синтезатора.
Также в зависимости от используемой метки выделяют:
1) радиоизотопно меченые зонды.
Традиционно для получения РНК– или ДНК-зондов используют ра-
диоактивно меченые с помощью 32
Р, 35
S, 125
I, 3
H нуклеотиды, которые после
гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью выявляют методом
авторадиографии. Преимущества: обеспечивают высокую чувствительность,
специфичность и воспроизводимость результатов. Недостатки: имеют малый
период полураспада, требуют соблюдения строгих мер безопасности;
2) нерадиоактивно меченые зонды.
В основе большинства методов нерадиактивного мечения лежат фер-
ментативные реакции с участием нуклеозид-трифосфатов, ковалентно свя-
занных с молекулой-свидетелем, обычно биотином – витамином Н – или
дигоксигенином. Использование в качестве метки дигоксигенина обеспечи-
вает большую специфичность, т.к. биотин присутствует в большинстве тка-
ней. Для их детекции используют гистохимические методы.
После гибридизации такие нерадиоактивно меченые зонды можно
выявить: во-первых, с помощью неиммунологической системы детекции на
основе авидина и стрептавидина (белков, имеющих высокое сродство к
биотину) – аффинный метод – или, во-вторых, с помощью конъюгирован-

9
ных с флуоресцентным красителем или ферментом антител к зонду – имму-
ноцитохимический метод.
Зонды можно метить и химическими методами, используя биотин,
пришитый к высокоактивным молекулам (например, фотобиотин, биотин-
гидразид, эфир биотина).
В качестве неизотопной метки можно использовать и другие соедине-
ния, например, ртуть, ацетиламинофлуорен, динитрофенол и другие, но не
все из них являются безопасными.
Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции
основан на использовании зонда-«молекулярного маяка» (рис. 1). Такой
зонд состоит из 25 нуклеотидов. Средние 15 из них комплементарны ДНК-
мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаим-
но комплементарны и образуют шпильку. К 5'-концу присоединен флуорес-
центный хромофор (флуорофор), а к 3'-концу – нефлуоресцентный хромо-
фор (тушитель), на который передается энергия возбуждения флуорофора.
В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию,
при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуо-
ресценция флуорофора тушится. Когда же 15 средних нуклеотидов зонда
гибридизуются с комплементарной последовательностью ДНК– или РНК-
мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя,
и зонд испускает свет. Температура реакционной смеси должна быть близка
к комнатной, поскольку при ее повышении шпилька денатурирует, флуоро-
фор и тушитель расходятся и происходит флуоресценция. Необходимо так-
же, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарны соответствую-
щей последовательности ДНК– или РНК-мишени.
Рис. 1. Зонд-«молекулярный маяк»

10
Кроме вышеописанных, в качестве нерадиоактивных меток могут вы-
ступать вещества, рассеивающие электроны; бактериофаги; эритроциты; ме-
таллы (коллоидное золото); флуоресцентные красители; хемилюминесцент-
ные и биолюминесцентные вещества; липосомы; простетические группы и
субстраты ферментов; модуляторы ферментов; а также сами ферменты.
Предложенная в начале 1970-х годов ферментная метка получила
наиболее широкое применение.
Преимущества ферментной метки:
1) многократно усиливает сигнал (в присутствии одной молекулы
фермента за короткое время образуются миллионы и миллиарды молекул
продукта реакции);
2) позволяет в некоторых случаях проводить анализ без разделения
вошедших в комплекс и не связавшихся компонентов;
3) позволяет регулировать свою каталитическую активность.
Перед проведением ферментативной реакции необходимо разделить
свободную и связанную фракции ферментной метки. Количество образо-
вавшихся комплексов, а тем самым и содержание определяемой последова-
тельности, оценивают по содержанию ферментной метки. Количество мет-
ки определяют по ее каталитической активности.
В зависимости от типа регистрируемого сигнала в продуктах фер-
мент-субстратной реакции все субстраты можно разделить на 4 группы.
1. Хромогенные субстраты, при использовании которых продукты ре-
акции – хромофоры – поглощают свет в видимой области, то есть их рас-
творы окрашены.
2. Пероксид водорода. При его каталитическом расщеплении образу-
ется атомарный кислород, который окисляет присутствующий в растворе
хромоген с образованием хромофора.
3. Флуоресцентные субстраты. В результате воздействия фермента из них
образуются продукты, которые имеют свойство поглощать свет одной длины
волны, а испускать – другой. Такое явление называется флуоресценцией.
4. Хемилюминесцентные субстраты, при использовании которых про-
дукты реакции поглощают кванты света, переходят в возбужденное состоя-
ние и затем испускают свет определенной длины волны, то есть их раство-
ры светятся.
Наибольшее применение в качестве ферментной метки нашли 3 фер-
мента: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-D-галактозидаза.
Различают 2 типа гибридизационного анализа:
1. Методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомо-
генные);
2. Методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носи-
теле (гетерогенные).

11
Метод гибридизации в растворе
При гибридизации в растворе искомая НК и зонд свободно взаимо-
действуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса
гибридизации. Детекцию результатов гибридизации в растворе осуществ-
ляют путем нуклеазного гидролиза одноцепочечных ДНК и выделения ос-
тавшихся двухцепочечных гибридов, содержащих меченый зонд.
Для успешного проведения реакции гибридизации в растворе необхо-
димо применять одноцепочечные зонды, неспособные к самогибридизации.
Метод хорош еще и тем, что требует минимальных объемов и количеств
биологического и клинического образцов, поэтому может быть использован
в диагностических целях. В то же время этот метод имеет один существен-
ный недостаток – на его основе можно создать диагностические тест-
системы для выявления специфических фрагментов небольших участков
ДНК при условии достаточно высокой концентрации искомых фрагментов
или участков в исследуемом образце. Это снижает порог чувствительности
до уровня ИФА и даже ниже.
Метод гибридизации на твердом носителе
Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверх-
ности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерный
мембранный фильтр, например, нейлоновую мембрану.
Процедура гибридизации нуклеиновых кислот в общих чертах состо-
ит в следующем:
1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре
(обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 °С в вакууме).
2. Нанесение меченого одноцепочечного ДНК-зонда, который при оп-
ределенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-
мишенью.
3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшегося мече-
ного ДНК-зонда.
4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень. Система детекции
должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.
Гибридизация in situ
Гибридизация in situ (ГИС; in situ hybridization, ISH) – это метод пря-
мого выявления нуклеиновых кислот в клеточных структурах в условиях,
позволяющих одновременно исследовать их морфологию.
Метод гибридизации in situ основан на способности хромосомной
ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК(РНК)-зондами
непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных
ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение
практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в
клетке, клеточном ядре или на хромосомах.

12
Задача осложняется тем, что при проведении ГИС приходится иметь
дело с самыми разными объектами – от индивидуальных хромосом в мета-
фазных пластинках до архивных залитых в парафин биоптатов. Чувстви-
тельность метода ГИС ограничена возможностью проникновения зондов
внутрь клеток для связывания с искомой мишенью.
Выбор конкретной методики гибридизации, оптимальной для данного
эксперимента, зависит от следующих факторов:
– природа НК-мишени (методики выявления ДНК и РНК с помощью
ГИС различаются);
– чувствительность;
– специфичность;
– вопросы практического характера (стоимость, безопасность, нали-
чие оборудования и реактивов).
С помощью ГИС можно исследовать срезы толщиной 3–10 мкм.
Процедура ГИС может быть представлена в виде следующей схемы:
1) предварительная обработка срезов;
2) получение и мечение зонда;
3) денатурация ДНК-мишени и зонда;
4) гибридизация одноцепочечной ДНК-мишени с зондом;
5) отмывание;
6) детекция.
Предварительная обработка срезов включает:
– депарафинирование срезов тканей, залитых в парафин;
– демаскирование НК-мишени (необходимо разрушить сшивки НК-
мишени с другими нуклеиновыми кислотами и белками, например, с помо-
щью ограниченного протеолиза протеиназой К и пепсином-HCl);
– обработку РНКазой или ДНКазой;
– предгибридизацию срезов (инкубирование в не содержащей зонда
гибридизационной смеси, проводится не всегда).
Для денатурации используют химические (щелочная денатурация) и
физические (термоденатурация) факторы. Денатурацию обычно проводят в
присутствии формамида (ослабляет внутримолекулярные водородные связи)
и солей, что позволяет снизить температуру денатурации и гибридизации.
Для проведения гибридизации иногда достаточно просто снизить
температуру смеси ниже температуры плавления гибрида зонд/мишень и в
этих условиях выдержать образец в течение 2–16 ч. В целом же подбор ус-
ловий для проведения гибридизации (температура, время) индивидуален
для каждого отдельного случая.
Оптимальная температура ренатурации (или отжига) примерно на
25 °С ниже температуры плавления (Tm) гибридной молекулы. Tm двухце-
почечной молекулы ДНК – это температура, при которой 50 % дуплексов
денатурировано. Один из вариантов условий гибридизации (общепринятые

13
«жесткие» условия: 50 % формамид, 2 × ССР (стандартный солевой рас-
твор), 42 °С) соответствует температуре гибридизации Tm – 12 °С. Жест-
кость условий можно повысить, увеличив концентрацию формамида, сни-
зив концентрацию солей и повысив температуру.
В зависимости от нуклеотидного состава и числа копий исследуемой
последовательности ДНК, а также поставленных задач, может изменяться
содержание формамида (от 0 до 60 %), концентрация солевых буферов
(от 2 × до 0,1 × ССР), температурный режим (от 37 °С до 42 °С), время (2–
16 ч.) проведения гибридизации.
Необходимым условием проведения гибридизации является то, что
меченый зонд должен иметь подходящий размер и присутствовать в нуж-
ной концентрации.
После гибридизации проводят отмывание образцов и детекцию гиб-
ридизовавшегося зонда (метод детекции зависит от типа используемого
зонда).
Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого сигнала, во всех
случаях необходимо ставить адекватные контрольные опыты, как положи-
тельные, так и отрицательные.
Частный случай ГИС – флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). В
качестве зондов в данном случае используют последовательности, меченые
флуорохромами, что сокращает проведение процедуры до 7–9 часов. Дан-
ный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с изотопными вариантами
гибридизации: большую разрешающую способность, быстроту и безопас-
ность для здоровья исследователя.
Гибридные молекулы можно выявлять с помощью различных систем
иммунохимической детекции, используя флуорохромы – детекторы разных
цветов. Это делает возможным выявление одновременно нескольких после-
довательностей ДНК в одной клетке. Существует множество вариантов
флуоресцентной детекции, например, возможно «раскрасить» таким спосо-
бом все хромосомы человека, каждую своим цветом.
Анализ препаратов после FISH проводят с помощью флуоресцентного
микроскопа, оснащенного набором соответствующих светофильтров.
Блот-гибридизация
Блот-гибридизация (блоттинг) – метод идентификации макромолекул,
разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на твердом матриксе,
путем гибридизации содержимого образцов с мечеными комплементарны-
ми зондами.
Виды блоттинга:
1) вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг) – идентификация искомого
белка путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом белковых мо-
лекул с меченым антителом;

14
2) нозерн-блоттинг – идентификация искомой последовательности
РНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом молекул мРНК
с меченым комплементарным ДНК-зондом;
3) саузерн-блоттинг – идентификация участка ДНК, содержащего
искомую нуклеотидную последовательность, путем гибридизации разде-
ленных гель-электрофорезом фрагментов ДНК с меченым комплементар-
ным ДНК-зондом.
Блот-гибридизация по Саузерну
Блот-гибридизация по Саузерну – это классический метод блот-
гибридизации; назван по фамилии автора, предложившего его в 1975 г.
Первым этапом саузерн-блоттинга (рис. 2) является выделение сум-
марной геномной ДНК. Затем геномная ДНК обрабатывается одной или не-
сколькими рестрикционными эндонуклеазами, после чего образующиеся
фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном
геле. Далее, после денатурации ДНК, проводится процедура блоттинга –
переноса фрагментов ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый
фильтр (это осуществляется за счет действия осмотических сил, вакуума
или электрического поля), в результате чего на фильтре фиксируется точная
реплика ДНК-рестрикта.
Денатурированные фрагменты ДНК гибридизуют с радиоактивно-
меченым зондом – молекулой ДНК длиной несколько сотен нуклеотидов.
После отмывки фильтра и авторадиографии на рентгеновской пленке
можно оценить точное положение и длину фрагментов ДНК, комплемен-
тарных использованному зонду.
Рис. 2. Схема саузерн-блоттинга

15
Таким образом, блот-гибридизация позволяет идентифицировать спе-
цифические последовательности нуклеотидов в общем наборе рестрикци-
онных фрагментов геномной ДНК. При наличии макроперестроек ДНК, за-
трагивающих исследуемый участок, набор или размер фрагментов, с кото-
рыми гибридизуется меченая проба, будет отличаться от нормы.
Нозерн– и вестерн-блоттинг проводятся аналогичным образом.
Метод блот-гибридизации обладает высокой чувствительностью, одна-
ко он является весьма трудоемким, предполагает использование радиоактив-
ных зондов (хотя в последнее время нередко используют различные варианты
нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра), предъявляет
высокие требования к качеству анализируемой ДНК и требует для проведения
больших количеств геномной ДНК (5–10 мкг). Тем не менее, во многих случа-
ях он играет ведущую роль в прямой ДНК-диагностике, в том числе в сочета-
нии с другими методами.
Метод сэндвич-гибридизации
Метод является одной из разновидностей зондовой технологии. При
его использовании применяются два зонда, гомологичные различным уча-
сткам искомой нуклеиновой кислоты. Один зонд фиксируют на мембране
для того, чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в
исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмы-
вают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй
зонд, который имеет определенную метку. Процесс гибридизации проводят
повторно, и при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком
ДНК (РНК). Дальнейший процесс детекции проводится стандартным мето-
дом (ферментно-гибридизационным, авторадиографическим, флуоресцент-
ным, хемилюминесцентным).
Например, если второй зонд был связан с биотином, то его выявление
может быть проведено ферментно-гибридизационным методом. Для этого в
систему добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бакте-
риальный аналог авидина). После отмывания добавляют биотинилирован-
ный фермент щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. В зависимости
от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминес-
центный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесцен-
цию, сопровождающую превращение субстрата в продукт.
В качестве альтернативы после гибридизации ДНК со вторым, биоти-
нилированным зондом можно добавлять уже готовый комплекс стрептави-
дин-фермент, имеющий сайт связывания с биотином.
Как авидин, так и стрептавидин связываются с биотином очень проч-
но (константа диссоциации (Кd = 10–15
); кроме того, каждый из белков име-
ет четыре независимых биотинсвязывающих сайта, благодаря чему одна
молекула авидина или стрептавидина может одновременно присоединять
фермент и зонд, меченные биотином. Биотинилирование и связывание со

16
стрептавидином не приводят к снижению ферментативной активности. В
хромогенных системах детекции в том месте, где находится гибридная
ДНК, под действием фермента образуется нерастворимый краситель, а в
хемилюминесцентных системах – продукт, который испускает свет.
Метод разветвленной ДНК
Искомая НК связывается с улавливающим зондом, один конец которо-
го комплементарен мишени, а другой – определенному концу усиливающего
зонда. При этом усиливающий зонд может быть комплементарен следующе-
му зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с
несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофорами, которые по
мере увеличения количества связанных зондов усиливают (хеми-, флуоро-)
люминесценцию. Преимуществом данного метода является возможность ис-
пользования в одной реакции нескольких улавливающих и связывающихся с
мишенью зондов, что обеспечивает выявление агентов, характеризующихся
значительной геномной гетерогенностью, например, ВИЧ.
Методы амплификации нуклеиновых кислот
До изобретения методов амплификации нуклеиновых кислот для до-
казательства наличия инфекционного возбудителя или идентификации ге-
нетической мутации использовали гибридизационные методы. Однако
ДНК-зондовая диагностика имеет существенные ограничения как по своей
чувствительности, так и по трудоемкости и длительности: для ее осуществ-
ления необходимо выделить ДНК из не менее чем 10 000 клеток, а сам про-
цесс гибридизации не может быть полностью автоматизирован. Предвари-
тельная быстрая амплификация in vitro позволяет детектировать единичные
микробные или мутантные клетки и в большинстве случаев делает необяза-
тельным применение для детекции ДНК-гибридизации.
Открытие Карри Мюллисом в 1983 году (США) метода полимеразной
цепной реакции послужило толчком к активному развитию разнообразных
технологий амплификации нуклеиновых кислот.
По сути, все методы амплификации имитируют природную возмож-
ность репликации ДНК. При этом in vitro происходит изолированное умно-
жение гена или его фрагментов (амплификация) в миллионы раз.
Все методы амплификации могут быть разделены в зависимости от
изменения температурных режимов на:
1) методы амплификации с циклической сменой температурных па-
раметров: методы ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР) и их модификации;
2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот: метод
изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдержи-
вающая репликация последовательностей (3SR, NASBA), амплификация с
вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB-репликазы.
Все методы амплификации состоят из трех основных этапов:

17
1) Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК)
из клеток;
2) Непосредственная амплификация выделенных участков (копий)
ДНК (РНК).
3) Детекция продуктов, полученных на втором этапе.
Полимеразная цепная реакция
В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое ме-
сто. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на прин-
ципиально иную высоту – уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК
и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента
или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде.
При этом способом ПЦР, теоретически, может быть обнаружена всего одна
искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК.
Чрезвычайно важную роль играет этот метод в диагностике инфекци-
онных заболеваний. Внедрение в практику этого метода наряду с серологи-
ческой диагностикой существенно расширило возможности современной
клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют мето-
ды выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных пита-
тельных средах или в культуре клеток.
В тех случаях, когда использование культуральных методов является
проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффектив-
ностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста
на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых ки-
слот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной.
Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики
возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific
PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специ-
фической последовательности ДНК, характерной для строго определенного
вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического уча-
стка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР)
Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для
детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные ко-
пии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значитель-
но превосходит по диагностической эффективности культивирование и ме-
тоды прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюо-
ресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для
выявления C. trachomatis.
Принцип метода ПЦР
Полимеразная цепная реакция – искусственный процесс многократно-
го копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК,

18
осуществляемый in vitro (рис. 3). Копирование ДНК при ПЦР осуществля-
ется специальным ферментом – ДНК-полимеразой, как и в клетках живых
организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице),
синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Для начала
синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе необходима РНК-затравка (праймер), к
которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип
ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи
ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфически-
ми праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из
множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется спо-
собностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и свя-
зываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.
В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «огра-
ничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противо-
положными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количе-
ства копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каж-
дый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:
1) денатурации, или «плавления» ДНК, когда двухцепочечная ДНК
под действием высокой температуры (92–95 °С) переходит в одноцепочеч-
ное состояние;
2) связывания (отжига) праймеров с одноцепочечной матричной
ДНК (температура 45–60 °С);
3) элонгации, или полимеризации, или удлинения цепи. При темпера-
туре 65–72 °С происходит синтез комплементарной цепи на ДНК-матрице,
начинающийся от места гибридизации праймера и происходящий в направ-
лении 5’→3’.
Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения темпе-
ратуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с оп-
ределенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих цик-
лах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированны-
ми в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР
(копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически
удваивается в каждом цикле, то есть растет с числом циклов экспоненци-
ально. Число указанных циклов в ПЦР составляет обычно от 25 до 40 (через
n циклов будет 2n
копий исходной молекулы ДНК-мишени).
В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, вы-
держивающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение
нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термо-
стабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойства-
ми, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-ДНК-полимераза,
первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus
aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений

19
ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз
обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что
позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной
практике.
Таким образом, ПЦР позволяет осуществлять амплификацию в про-
бирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-ДНК-
полимеразы) из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), являющих-
ся структурными элементами ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20–30-
членных затравок (праймеров), комплементарных 3’-концевым последова-
тельностям антипараллельных цепей ДНК гена.
Рис. 3. Механизм полимеразной цепной реакции
Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на началь-
ном этапе (20–25 циклов), после чего начинается выход на плато (после 40–
45 циклов) в силу: 1) истощения dNTP и праймеров, 2) нарастающего тем-
пературного повреждения Taq-ДНК-полимеразы, 3) конкуренции за фер-
мент амплификонов, когда их число начнет превышать число молекул Taq-
ДНК-полимеразы. При содержании в ПЦР-пробирке около 10 молекул
ДНК-матриц, как правило, достаточно 35 циклов.

20
Подготовка проб для ПЦР-амплификации ДНК-матрицы
Благодаря пробоподготовке происходит концентрирование исследуе-
мой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-ДНК-
полимеразы (например, гемоглобина). При отсутствии такой необходимо-
сти подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус
гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менин-
гитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без
всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В боль-
шинстве же случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов,
биоптатов тканей, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного
результата следует выделить ДНК тем или иным способом. При этом необ-
ходимо учитывать, что содержание ДНК в геномах клеток человека, гриб-
ков, бактерий и вирусов различается в десятки раз (например, содержание
ДНК в геноме диплоидной клетки человека составляет примерно 7 × 10–12
г,
а в геноме СМV (цитомегаловируса) – 0,25 × 10–15
г).
В последние годы ряд фирм производит наборы для быстрой экстрак-
ции ДНК или РНК из различных материалов, подвергаемых анализу мето-
дом ПЦР, обычно включающие специфические сорбенты НК. Общее коли-
чество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать 1 мкг,
поскольку большой избыток неспецифической ДНК снижает специфич-
ность и чувствительность ПЦР-амплификации ДНК-матрицы.
Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна про-
водиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых
проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.
Постановка ПЦР
Пятью основными компонентами (реактивами) ПЦР являются сле-
дующие:
а) фермент Taq-ДНК-полимераза;
б) пара олигонуклеотидных праймеров (смысловой и антисмысловой);
в) 4 типа dNTP;
г) копируемая ДНК;
д) ионы Mg2+
.
Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и ми-
неральное масло.
Фермент Taq-ДНК-полимераза, полученная из термостабильных ор-
ганизмов Thermus aquaticus, при оптимальных условиях ПЦР содержится в
50–100 мкл реакционной смеси в количестве 0,5–2 единицы. Она и синтези-
рует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту до заданной длины в не-
сколько сотен или тысяч пар нуклеотидов.
Праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты
ДНК-матрицы (амплификоны), поэтому они в реакционной смеси ПЦР при-

21
сутствуют в избытке: концентрация их составляет 0,5–1,0 мкМ. Специфич-
ность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так
называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодей-
ствуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепо-
чечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и
содержанием ГЦ-пар. Как правило, праймеры для ПЦР-детекции инфекци-
онных возбудителей создают на консервативные участки их ДНК, которые
редко подвергаются генетическим перестройкам.
Дезоксинуклеозидтрифосфаты: dATP, dTTP, dGTP, dCTP – в реакци-
онной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях от 200 до 500
мкМ, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нук-
леотидов в ПЦР.
Магний необходим для функционирования фермента Taq-ДНК-
полимеразы, но оптимальная его концентрация устанавливается путем тит-
рования, поскольку концентрация свободных ионов магния зависит не
только от добавленного его количества, но и от концентраций нуклеиновых
кислот, праймеров и dNTP, которые связывают эти ионы. Средние величи-
ны концентрации магния в ПЦР составляют около 2–3 мМ.
Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермен-
та. Наиболее распространен трис-НСl-буфер, который удерживает рН во вре-
мя ПЦР между 6,8 и 7,8, содержит желатин или бычий сывороточный альбу-
мин и неионные детергенты для стабилизации фермента, а также 50 мМ KCl.
Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси
в количестве 30–40 мкл для предотвращения испарения в процессе ПЦР.
Кроме этих компонентов, необходим образец ДНК исследуемой био-
логической системы – положительный контроль.
Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое
определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимо-
сти от концентрации и количества пяти основных компонентов реакцион-
ной смеси и температурного режима ПЦР, в частности, от температуры от-
жига праймеров (2-я стадия ПЦР).
Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации явля-
ется приборное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР яв-
ляется амплификатор (термоциклер), представляющий собой аппарат, в
гнезда которого устанавливаются специальные амплификационные пробир-
ки, изготовленные из особого термопроводимого пластика, с реакционной
смесью или предметные стекла с образцами тканей.
Амплификаторы изменяют температуру автоматически на основе за-
данной программы. В термоциклерах температура металлического блока, в
который помещаются пробирки, изменяется с помощью элемента Пельтье.
Элемент Пельтье позволяет изменять температуру блока с большой скоро-
стью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР. Современные

22
термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостен-
ных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить
теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном
итоге дополнительно сократить время проведения реакции.
К настоящему времени выпущено много разнообразных моделей ам-
плификаторов. Наиболее удобными являются приборы с несколькими
платформами, каждая из которых может работать по отдельной программе,
что дает возможность одновременно анализировать пробы на наличие не-
скольких типов возбудителей или нескольких мутаций. Многие приборы
позволяют программировать специальные усложненные температурные
профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.
Также для проведения исследования методом ПЦР необходимы:
1) микроцентрифуга типа Эппендорф (10–12 тыс. об./мин); 2) камера для
ЭФ в гелях; 3) УФ-трансиллюминатор; 4) встряхиватель пробирок типа Эп-
пендорф; 5) микротермостат; 6) фотоаппарат; 7) ламинарный шкаф и т.д.
После подготовки реакционной смеси для ПЦР пробирки плотно за-
крывают крышками и ставят в амплификатор, задают программу смены
температурных режимов, соответствующую амплификации исследуемого
участка ДНК. Каждый цикл амплификации включает 3 температурных ре-
жима: денатурацию ДНК (92–95 °С) – примерно 1 мин., отжиг праймеров
(45–60 °С) – 0,5–2 мин, синтез комплементарной цепи (65–72 °С) – 1–3 мин
После прохождения необходимого количества циклов процесс останавли-
вают. Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1–3 ч.
При необходимости оставить пробы на ночь их помещают в холодильник
при +4 °С или вводят дополнительный цикл на амплификаторе: +4 °С –
12 часов или более.
Детекция продуктов амплификации
Детекция методом гель-электрофореза
Выявление, или детекцию, наработанного продукта ПЦР (амплифика-
та) чаще всего проводят при помощи его электрофореза в 2–3%-м геле агаро-
зы или полиакриламидном геле, содержащем бромид этидия (специфический
флуоресцентный ДНК и РНК-краситель). Поглощая УФ-свет с максимальной
длиной волны 256 нм, бромид этидия, связанный с участком ДНК, способен
флуоресцировать, что регистрируется в видимом спектре (610–620 нм) в виде
оранжевой полоски. Получаемые результаты элекрофореза амплификонов
оценивают в проходящем УФ-свете на специальных приборах – трансиллю-
минаторах – и сравнивают с положительным контролем (ДНК выявляемого
микроорганизма или известная ДНК). При положительном результате светя-
щаяся полоска ДНК находится на том же уровне, что и положительный кон-
троль вследствие одинаковой молекулярной массы наработанных амплифи-
конов в контроле и изучаемом положительном образце. В отрицательном

23
контроле должны отсутствовать компактные светящиеся полоски ДНК. Для
такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.
Детекция гибридизационно-ферментативным методом
с измерением интенсивности окраски образовавшегося продукта
колориметрическим, флуоресцентным или хемилюминесцентным методами
Другим способом качественной и количественной оценки ПЦР явля-
ется ферментно-гибридизационный метод. Для его проведения на твердом
носителе иммобилизуют ДНК-зонд, с которым в результате гибридизации
взаимодействует продукт амплификации. В дальнейшем в результате аф-
финного взаимодействия происходит связывание биотина и авидина с обра-
зованием биотин-авидинового комплекса. При этом меченый пероксидазой
авидин выявляется ферментной реакцией с субстратом и дальнейшей реги-
страцией оптической плотности. В случаях, если вместо пероксидазы в ави-
дин встроено флуоресцентное вещество, детекция должна осуществляться с
использованием флуоресцентной техники. Возможны варианты, когда в
авидиновый комплекс встраивается рутений или другие вещества, способ-
ные к хемилюминесценции, и тогда оценка результатов проводится с ис-
пользованием метода хемилюминесценции.
Использование одного или нескольких внутренних стандартов с из-
вестным количеством копий позволяет рассчитать содержание возбудителя
в исследуемой пробе.
Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет
в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность
детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в
подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности
автоматизации для анализа большого количества образцов и использования
нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все бо-
лее распространенным. В некоторых случаях применение специальных
флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение ам-
плификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредствен-
но в реакционной пробирке.
Перспективной в настоящее время видится разработка для детекции
продуктов амплификации методов лантаноидного иммунофлуоресцентного
анализа. Данный метод основан на использовании в качестве метки положи-
тельно заряженных ионов редкоземельных элементов – европия, самария,
тербия и прозеодима, являющихся флуорохромами, причем их атомы спо-
собны существовать в возбужденном состоянии продолжительное время.
Весьма перспективной является также детекция продуктов амплифика-
ции с использованием флуоресцирующих моноклональных антител к специ-
фическим амплификонам (цепочкам ДНК), характеризующим тот или иной
геном возбудителя или участок гена с определенными искомыми свойствами
(генные мутации, наследственные и онкологические заболевания и т.д.).

24
Модификации ПЦР
ПЦР в реальном времени
Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реаль-
ном времени является возможность детекции накопления продуктов ампли-
фикации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кине-
тика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой
матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК. В
отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в
пробе, ПЦР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций,
связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе
ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить
к появлению ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет
отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероят-
ности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также
позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории.
Один из методов количественной ПЦР в режиме реального времени
базируется на использовании ДНК-зонда, комплементарного амплифици-
руемой последовательности и меченного двумя флуоресцентными метками,
одна из которых в исходном состоянии «поглощает» спектр флуоресценции
другой. Далее в каждом цикле ПЦР (а именно, в фазе синтеза) за счет 5’-
нуклеазной активности ДНК-полимеразы используемый зонд расщепляется
и высвобождает 5’-метку, нарастание флуоресценции которой после возбу-
ждения лазерным лучом регистрируется в реальном режиме времени и от-
ражает нарастание числа молекул ПЦР-продукта (рис. 4).
Рис. 4. Количественная ПЦР в реальном режиме времени при детекции
с помощью выщепления 5' концевой метки (TaqMan Assay)

25
Рис. 5. Количественная ПЦР в реальном режиме времени при детекции
с использованием интеркалирующих агентов
Другой вариант ПЦР в реальном времени основан на использовании
интеркалирующих агентов: флуоресценция бромистого этидия и SYBR
Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные моле-
кулы ДНК (рис. 5). Таким образом, можно наблюдать за накоплением про-
дуктов амплификации.
Рис. 6. Кривые плавления продуктов амплификации
Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть
связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифиче-

молекулярная биомедицина. часть 2

молекулярная биомедицина. часть 2

Recommended

Recommended

More Related Content

Viewers also liked

Viewers also liked (13)

Similar to молекулярная биомедицина. часть 2

Similar to молекулярная биомедицина. часть 2 (20)

More from Иван Иванов

More from Иван Иванов (20)

молекулярная биомедицина. часть 2