1. На правах рукописи
АБРОСИМОВА
Ольга Владимировна
ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНА PAENIBACILLUS POLYMYXA
НА ПРОЦЕСС ФАГОЦИТОЗА БАКТЕРИЙ
03.00.07 – микробиология
14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2006

2. Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Саратовский го-
сударственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»
Научные руководители: доктор биологических наук
Карпунина Лидия Владимировна
доктор биологических наук
Тихомирова Елена Ивановна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Васильев Дмитрий Аркадьевич
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Емельянова Наталья Вячеславовна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Ульяновский государственный уни-
верситет»
Защита диссертации состоится «__»__________2006 года в _____ часов на
заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном
государственном образовательном учреждении высшего профессионального об-
разования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вави-
лова» по адресу 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО
«Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по
адресу 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.
Автореферат разослан «__»__________2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук Л.В. Карпунина
2

3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одним из перспективных направлений в современ-
ной микробиологии является лектинология. Лектины представляют собой угле-
водсвязывающие белки неиммунного происхождения. Лектины, благодаря спе-
цифической связи с углеводными рецепторами, обеспечивают процесс взаимо-
действия в популяциях эукариотических и прокариотических клеток, участвуют
во многих внутриклеточных метаболических процессах (Линевич, 1979; Лах-
тин, 1992; Карпунина, 2002, 2005; Никитина, 2001, 2005; Шендеров, Лахтин,
2004). Лектины и лиганды-углеводы занимают важное место в обеспечении
функционирования системы иммунологического надзора в организме. Благода-
ря лектин-углеводным взаимодействиям макро- и микроорганизмов осуще-
ствляются многие реакции неспецифической защиты и адаптивного иммуните-
та (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др., 2003; Тихомирова, 2005).
Применение лектинов в биологических и медицинских исследованиях тре-
бует дальнейшего изучения их биологического воздействия на клетки иммун-
ной системы животных и человека.
К настоящему времени известно преимущественно о влиянии лектинов
растительного происхождения на активность фагоцитирующих клеток (Маян-
ский и др., 1986; Иммунология, 1987; Горудко, Тимошенко, 2000). В отношении
бактериальных лектинов имеются отдельные сведения о том, что патогенные
бактерии с их помощью могут взаимодействовать с перитонеальными макрофа-
гами человека, крысы и белых мышей и полиморфноядерными лейкоцитами че-
ловека, что приводит к активации фагоцитирующих клеток (Kelly et al., 1989;
Mork, Hancock, 1993; Ofek et al., 1995; Ruhl, Sandberg, Cisar, 1997; Engel, 1999).
О лектинах, полученных из непатогенных бактерий, такие сведения практиче-
ски отсутствуют. Поэтому исследование влияния лектинов из непатогенных
бактерий на процесс фагоцитоза является весьма интересной и актуальной зада-
чей.
3

4. Цель работы – изучить влияние лектина ЛII Paenibacillus polymyxa 1460
на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическую активность
макрофагов.
Задачи исследования:
1. Определить влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 in vivo на актив-
ность и завершенность процесса фагоцитоза бактерий: Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica.
2. Изучить влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 in vitro на активность и
завершенность фагоцитоза бактерий.
3. Исследовать взаимодействие лектина ЛII P. polymyxa 1460 с поверх-
ностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов.
4. Оценить влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 на кислородзависимый
и кислороднезависимый киллинг бактерий по активности щелочной и
кислой фосфатаз, катионных белков, миелопероксидазы и образова-
нию активных форм кислорода.
5. Изучить влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 на содержание гликоге-
на и липидов в макрофагах при фагоцитозе бактерий.
6. Провести сравнительный анализ изменения фагоцитарной и метаболи-
ческой активности перитонеальных и альвеолярных макрофагов на
фоне действия лектина ЛII P. polymyxa 1460.
Научная новизна. Впервые in vivo и in vitro изучено влияние лектина ЛII,
выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий P. polymyxa
1460, специфичного к галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе-1,6-ди-
фосфату, глюкозамину, на активность и завершенность процесса фагоцитоза
бактерий: S. aureus 100 б, E. coli Ca 53, Y. enterocolitica 295-82. Показано, что
лектин ЛII P. polymyxa 1460 усиливает адгезивную функцию фагоцитирующих
клеток, приводя к эффекту перенасыщения фагоцитов бактериями.
Впервые показана возможность специфического взаимодействия лектина
ЛII P. polymyxa 1460 с поверхностными рецепторами альвеолярных и перито-
неальных макрофагов.
4

5. Проведена оценка механизмов кислородзависимого и кислороднезависимо-
го киллинга бактерий макрофагами. Показано, что лектин не нарушает метабо-
лический статус и энергетический обмен клеток.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят суще-
ственный вклад в понимание механизмов активации одного из основных факто-
ров естественной резистентности – фагоцитоза, исход которого во многом опре-
деляет развитие специфических иммунологических реакций организма.
По материалам диссертационной работы опубликованы методические реко-
мендации «Изучение влияния лектинов бацилл на активность процесса фагоци-
тоза патогенных бактерий» (в соавторстве с Е.И. Тихомировой, Е.С. Мухачевой
и Л.В. Карпуниной, 2004) для практических занятий студентов старших курсов,
а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в
области микробиологии и иммунологии, рекомендованные Учебно-методиче-
ской комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета Са-
ратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол
№ 2 от 4 ноября 2003 г.).
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в
Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова, Сара-
товском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского, Саратовском
государственном техническом университете при выполнении курсовых и ди-
пломных работ, а также при чтении лекций по курсу «Микробиология» для сту-
дентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университета
им. Н.И. Вавилова и при чтении лекций по курсу «Молекулярная иммунология»
для студентов биологического факультета Саратовского государственного уни-
верситета им. Н.Г. Чернышевского.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Лектин ЛII P. polymyxa 1460 in vivo и vitro усиливает адгезивную
способность фагоцитирующих клеток, приводит к эффекту перенасыще-
ния фагоцитов бактериями, но не влияет на завершенность фагоцитоза.
5

6. 2. Лектин ЛII P. polymyxa 1460 специфически взаимодействует с поверх-
ностными структурами альвеолярных и перитонеальных макрофагов,
изменяя их функционально-метаболическую активность.
3. Лектин ЛII P. polymyxa 1460 in vitro влияет на активность отдельных ми-
кробоцидных факторов в цитоплазме макрофагов до фагоцитоза, но не
изменяет активность кислородзависимого и кислороднезависимого кил-
линга бактерий макрофагами.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветеринарно-санитарной
экспертизы при Федеральном государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Саратовский государственный
аграрный университет им. Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской
темы: «Изучение биологически активных веществ (лектинов) в регуляции мета-
болизма растений и животных» и при частичной поддержке грантом по проекту
№45434 научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы»,
раздел «развитие научно-исследовательской работы молодых преподавателей,
научных сотрудников, аспирантов, студентов» (2005).
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представ-
лены на конференциях: Международной научно-практической конференции
«Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Россия, Санкт-Петербург, 2002); меж-
региональной научной конференции молодых ученых аграрных вузов, НИИ и
ИПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов,
СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2003); объединенном иммунологическом форуме
(Россия, Екатеринбург, 2004); второй региональной конференции молодых уче-
ных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Рос-
сия, Саратов, ИБФРМ РАН, 2004); конференции профессорско-преподаватель-
ского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-мето-
дической работы за 2004 год (Саратов, СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005); 7th
John
Humphrey advanced summer programme in immunology «The interface between im-
munology and medicine» (Россия, Москва, 2005); региональной конференции мо-
6

7. лодых ученых «Вавиловские чтения – 2005» (Саратов, СГАУ им. Н.И. Вавилова,
2005).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 14 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав,
включающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования,
изложения полученных материалов и их обсуждения, заключения, выводов и
списка использованных литературных источников. Работа изложена на 145
страницах, иллюстрирована 31 рисунком и содержит 16 таблиц. Список исполь-
зованных литературных источников включает 138 наименований, в том числе 52
зарубежных.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся лектин ЛII, выделенный с поверхности
почвенных азотфиксирующих бактерий штамма Paenibacillus polymyxa (Bacil-
lus polymyxa)1460 (Карпунина и др., 1993). Лектин ЛII выделяли по методу
Л.В. Карпуниной (2002). Количественное содержание белка определяли по ме-
тоду М. Bradford (1976).
В качестве объекта фагоцитоза использовали суточные культуры штаммов
Staphylococcus aureus 100 б и Escherichia coli Ca 53, полученные из музея
культур микроорганизмов кафедры микробиологии и физиологии растений Са-
ратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского и культуру
Yersinia enterocolitica 295-82, полученную из музея культур микроорганизмов
кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Саратовского
государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова.
В качестве доноров макрофагов использовали беспородных белых мышей-
самцов, весом 18 – 20 г, возрастом – 2 – 3 месяца.
Активность фагоцитоза оценивали через 1, 3, 5 и 7 суток после введения
белым мышам лектина в концентрации 0,4 мкг/мл внутрибрюшинно по 0,2 мл.
7

8. Перитонеальные макрофаги (ПМФ) забирали из брюшной полости мышей,
альвеолярные макрофаги (АМФ) получали из легких мышей по общепринятой
методике (Практикум…, 2001, Лимфоциты:…, 1990). Число жизнеспособных
клеток определяли методом эксклюзии трипанового синего (Практикум…,
2001, Лимфоциты:…, 1990).
При изучении in vitro на АМФ и ПМФ лектин ЛII добавляли в инкубацион-
ные пробирки по 100 мкл в концентрации 0,04 и 0,004 мкг/мл непосредственно
перед внесением бактериальных клеток.
Для подтверждения специфичности взаимодействия лектина ЛII с рецеп-
торными структурами макрофагов проводили эксперименты с белком, не обла-
дающим лектиновыми свойствами – бычьим сывороточным альбумином (БСА)
и с ЛII, блокированным специфическими к нему углеводами. Лектин ингибиро-
вали смесью углеводов, содержащей равные объемы, галактозамина – 15мМ,
глюкуроновой кислоты – 19 мМ, фруктозо-1,6-дифосфата – 30 мМ, глюкозами-
на – 80 мМ (Карпунина, Никитина, Трихачева, 1989).
Определяли фагоцитарный индекс и индексы завершенности фагоцитоза
(ИЗФ) по общепринятым методикам (Васильева и др., 1987).
Кислородзависимый киллинг бактерий оценивали по определению актив-
ности миелопероксидазы и при постановке теста восстановления нитросинего
тетразолия (НСТ-теста). Определение миелопероксидазы проводили с помощью
набора реагентов «ДиахимЦитоСтейн-МПО» («Абрис+», Санкт-Петербург) по
методу Грехема – Кнолля (Долгушин, Бухарин, 2001). НСТ-тест ставили в двух
вариантах: спонтанном и индуцированном бактериальными клетками (Долгу-
шин, Бухарин, 2001).
Кислороднезависимый киллинг оценивали, определяя активность щелоч-
ной и кислой фосфатаз и содержание катионных белков. Определение щелоч-
ной фосфатазы проводили с помощью набора реагентов «ДиахимЦитоСтейн-
ЩФ» («Абрис+», Санкт-Петербург) по методу азосочетания по Кеплоу (1955).
Определение кислой фосфатазы проводили с помощью набора реагентов «Диа-
химЦитоСтейн-КФ» («Абрис+», Санкт-Петербург) по методу азосочетания
8

9. (Шубич, Нестерова, 1980). Определение катионного белка проводили по методу
с бромфеноловым синим (Шубич, 1974).
Метаболическую активность макрофагов оценивали по содержанию в
клетках гликогена и липидов цитохимическими методами. Определение глико-
гена проводили с помощью набора реагентов «ДиахимЦитоСтейн-ПАС»
(«Абрис+», Санкт-Петербург) по методу Л.А. Шабадаша (1949). Для определе-
ния липидов использовали метод Гольдмана – окраска суданом III (Роскин, Ле-
винсон, 1967).
Результаты исследований выражали в виде среднего цитохимического ко-
эффициента (СЦК) по L. Kaplow (1955).
Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым мето-
дикам с использованием t-критерия Стъюдента (Ашмарин, Васильев, Амбросов,
1974; Ойвин, 1960). Также использовали приложение Excel из пакета Microsoft
Office 2003.
Влияние лектина ЛII Paenibacillus polymyxa 1460 in vivo
на активность и завершенность процесса фагоцитоза бактерий
Первым этапом наших исследований было изучение влияния лектина ЛII P.
polymyxa 1460 на активность макрофагов, выделенных из организма белых мы-
шей на 1, 3, 5 и 7 сутки после введения лектина, в процессе фагоцитоза бакте-
рий. Обнаружено, что активность ПМФ, выделенных из организма мышей, ко-
торым вводили лектин, во все сроки исследования мало отличалась от контроль-
ных значений на начальных стадиях процесса фагоцитоза S. aureus 100 б. На за-
вершающих стадиях фагоцитоза активность этих макрофагов была достоверно
выше активности макрофагов из организма интактных животных. Можно пред-
положить, что лектин, взаимодействуя с поверхностными структурами перито-
неальных макрофагов, способствует более длительному процессу адгезии ими
бактериальных клеток при фагоцитозе. АМФ во все сроки исследования харак-
теризовались динамикой фагоцитарной активности сходной с контрольной.
9

10. Нами не было отмечено влияния лектина ЛII in vivo на фагоцитарную актив-
ность АМФ в отношении фагоцитоза S. aureus 100 б (табл. 1).
Таблица 1
Фагоцитарные индексы активности макрофагов, полученных в разные сроки
после введения мышам лектина, в процессе фагоцитоза S. aureus 100 б
Срок иммуно-
генеза
Макро-
фаги
Фагоцитарный индекс, (М±m) в %
0,5ч 1ч 2ч 6ч 12ч 24ч
Контроль (без
лектина)
ПМФ 27,0±0,8 33,0±1,0 53,0±5,0 55,0±0,8 45,0±0,5 39,0±1,0
АМФ 16,0±0,5 22,0±5,0 30,0±4,0 41,0±1,5 36,0±2,5 30,0±5,0
1сутки ПМФ 32,0±3,5* 37,0±5,0 44,0±5,0 65,0±1,0* 68,0±2,7* 57,0±1,8*
АМФ 15,0±2,5 22,0±4,0 30,0±5,0 38,0±5,0 38,0±1,0 35,0±1,0
3 сутки ПМФ 22,0±4,0 34,0±0,5 42,0±1,0* 58,0±0,9* 64,0±3,0* 68,0±2,1*
АМФ 16,0±3,0 19,0±1,5 28,0±4,0 40,0±4,0 38,0±3,0 29,0±4,0
5 сутки ПМФ 35,0±4,0* 38,0±4,0 46,0±1,0* 62,0±1,2* 60,0±1,5* 54,0±2,8*
АМФ 19,0±1,0 24,0±2,5 32,0±1,3 38,0±1,1 36,0±4,0 29,0±1,1
7 сутки ПМФ 31,0±5,0 36,0±1,9 45,0±1,2* 61,0±5,0 69,0±1,0* 65,0±5,0*
АМФ 17,0±5,0 21,0±1,0 25,0±1,5 31,0±3,0* 29,0±4,0* 22,0±1,4*
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05.
ИЗФ макрофагов, выделенных в различные сроки после введения лектина,
достоверно не отличались от контроля и имели отрицательные значения, что
свидетельствовало о незавершенном характере фагоцитоза.
Введение лектина ЛII в организм белым мышам не оказывало достоверно-
го влияния на завершенность процесса фагоцитоза E. coli Ca 53 перитонеальны-
ми макрофагами во все сроки иммуногенеза. В отношении альвеолярных ма-
крофагов, выделенных из организма белых мышей, которым вводили лектин
ЛII, на 5 и 7 сутки иммуногенеза наблюдали усиление их адгезивной способно-
сти и переваривания бактерий при фагоцитозе. В тоже время усиление фагоци-
тарной активности АМФ сопровождалось разрушением значительного их числа
к 6 часам инкубации с бактериями.
Во все сроки исследования после введения животным лектина активность
ПМФ в процессе фагоцитоза Y. enterocolitica 295-82 имела сходные показатели,
которые были ниже контрольных значений. Следует также отметить, что актив-
ность ПМФ из организма мышей после введения лектина ЛII практически не
изменялась на протяжении 6 часов инкубации с бактериями.
10

11. Было показано, что активность АМФ, выделенных из организма мышей во
все сроки иммуногенеза, в процессе фагоцитоза иерсиний была сходной с ак-
тивностью АМФ интактных животных. Достоверное превышение контрольных
значений было отмечено только на стадии 30 минутного фагоцитоза иерсиний
этими макрофагами.
Сравнение ИЗФ Y. enterocolitica 295-82 макрофагами, полученными в
разные сроки после введения мышам лектина, с ИЗФ макрофагов, выделенных
из организма интактных животных, не выявило достоверных различий в завер-
шенности фагоцитоза (рис. 1). ИЗФ иерсиний перитонеальными макрофагами
из организма животных после введения лектина незначительно отличались от
контрольных значений (0<ИЗФ<1), за исключением отрицательных значений
ИЗФ через 1 сутки исследования (ИЗФ=-1,12).
Рис. 1. Индексы завершенности фагоцитоза Y. enterocolitica 295-82 макрофага-
ми, полученными в разные сроки после введения мышам лектина
Таким образом было показано, что введение лектина ЛII P. polymyxa 1460 в
концентрации 0,4 мкг/мл белым мышам увеличивало адгезию макрофагами бак-
териальных клеток, но не оказывало существенного влияния на завершенность
процесса фагоцитоза.
Влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 in vitro
на активность и завершенность процесса фагоцитоза бактерий
11

12. Следующим этапом наших исследований было изучение на клеточном
уровне взаимодействие лектина ЛII P. polymyxa 1460 с макрофагами белых мы-
шей в культуре in vitro. При внесении лектина в пробирки с макрофагами ин-
тактных мышей перед инкубацией их со стафилококками, была отмечена актив-
ная адгезия микробных клеток. Однако стадия образования фаголизосомы за-
вершалась гибелью макрофагов, вероятно, вследствие чрезмерного количества
поглощенных ими бактериальных клеток. При этом мы наблюдали эффект «на-
фаршированных» макрофагов. В процессе фагоцитоза S. aureus 100 б ИЗФ для
перитонеальных макрофагов, стимулированных лектином, составил 0,75, а для
альвеолярных ИЗФ=0,57. Эти данные превышали контрольные значения и сви-
детельствовали о частичном переваривании макрофагами бактериальных кле-
ток.
Концентрация лектина 0,04 мкг/мл, как было обнаружено в эксперименте,
способствовала резкой активации стадии адгезии, вследствие чего макрофаги
поглощали чрезмерное количество бактерий и разрушались, не успев завершить
процесс фагоцитоза. Поэтому, в дальнейших исследованиях мы уменьшили
дозу лектина ЛII P. polymyxa в 10 раз до 0,004 мкг/мл.
При фагоцитозе E. coli Ca 53 ПМФ, обработанные лектином, обладали по-
вышенной фагоцитарной активностью только на стадии адгезии, к 6 ч инкуба-
ции с бактериями их активность снижалась до уровня контроля. При внесении
лектина в среду непосредственно перед инкубацией АМФ с эшерихиями отме-
чена сходная с контрольными макрофагами динамика их активности (рис. 2).
При фагоцитозе Y. enterocolitica 295-82 ПМФ и АМФ на фоне действия лек-
тина in vitro характеризовались сходной динамика активности. Результаты ис-
следований показали, что лектин ЛII в концентрации 0,004 мкг/мл не оказывал
достоверных влияний на завершенность процесса фагоцитоза E. coli Ca 53 и Y.
enterocolitica 295-82, несмотря на некоторое усиление адгезивной способности
макрофагов.
12

13. Рис. 2. Активность макрофагов, обработанных лектином, в процессе фагоцито-
за E. coli Ca 53
Изучение взаимодействия лектина ЛII P. polymyxa 1460
с поверхностными структурами макрофагов
Лектин P. polymyxa 1460 является гликопротеидом (Карпунина, 2002). Для
выявления специфичности взаимодействия лектина ЛII с рецепторными струк-
турами макрофагов была проведена серия экспериментов по моделированию
процесса фагоцитоза E. coli Ca 53 перитонеальными и альвеолярными макрофа-
гами интактных мышей на фоне действия белка, не обладающего лектиновыми
свойствами, и лектина, блокированного смесью специфичных углеводов
(рис. 3).
A - ПМФ Б – АМФ
Рис. 3. Активность макрофагов, обработанных различными соединениями, в
процессе фагоцитоза E. coli Ca 53
13

14. Показано, что фагоцитарная активность макрофагов в присутствии БСА
была аналогичной контролю. При воздействии блокированного специфичными
углеводами лектина на макрофаги было отмечено некоторое повышение фаго-
цитарной активности, особенно АМФ. БСА не оказывал влияния на завершен-
ность фагоцитоза бактерий макрофагами (ИЗФ<0, как и в контроле). В присут-
ствии лектина, блокированного специфичными углеводами, наблюдалось ча-
стичное переваривание эшерихий макрофагами.
Полученные результаты позволили говорить о специфическом связывании
лектина ЛII с поверхностными рецепторами ПМФ. Можно предположить, что
на молекулярном уровне лектин ЛII P. polymyxa 1460 помимо специфического
взаимодействия с рецепторными структурами альвеолярных макрофагов может
участвовать и в различных неспецифических реакциях. Аналогичные результа-
ты были получены и рядом других авторов, которые показали неполное подав-
ление бактериальной адгезии при использовании углеводов для торможения ре-
акции взаимодействия макрофагов с бактериями, имеющими пилийные адгези-
ны (Sharon, 1976; McArtur, Ceri, 1983).
Оценка активности кислородзависимого киллинга бактерий на фоне
действия лектина ЛII P. polymyxa 1460
Для характеристики механизма кислородзависимого киллинга бактерий
макрофагами на фоне действия in vitro бациллярного лектина нами была прове-
дена серия экспериментов по изучению активности миелопероксидазы в про-
цессе фагоцитоза S. aureus 100 б. Отмечено увеличение содержания миелопе-
роксидазы в АМФ до начала фагоцитоза. Определение активности миелоперок-
сидазы в макрофагах, обработанных лектином ЛII, в процессе фагоцитоза S. au-
reus 100 б не выявило существенных различий по сравнению с активностью
этого фермента у макрофагов в контроле.
Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма проводили с
помощью цитохимического варианта НСТ-теста. При изучении действия лекти-
на ЛII на макрофаги отмечено достоверное увеличение показателя спонтанного
14

15. НСТ-теста у АМФ по сравнению с данными показателями у ПМФ и контроль-
ных макрофагов. Аналогичные данные были получены при действии на АМФ
белка нелектиновой природы (БСА) и лектина, обработанного смесью специфи-
ческих углеводов.
При постановке индуцированного НСТ-теста не было выявлено достовер-
ного различия в активности кислородзависимого киллинга макрофагами бакте-
рий E. coli Ca 53 и Y. enterocolitica 295-82 на фоне действия лектина ЛII по срав-
нению с показателями контрольных макрофагов. При фагоцитозе клеток S. au-
reus 100 б перитонеальными макрофагами, обработанными лектином, показате-
ли активности киллинга были выше контрольных значений.
Обработка макрофагов БСА не влияла существенно на механизм кислород-
зависимого киллинга по показателям индуцированного эшерихиями НСТ-теста.
Действие лектина, обработанного специфичными углеводами, на фагоцитирую-
щие макрофаги, приводило к снижению активности кислородзависимого кил-
линга бактерий.
При изучении влияния лектина ЛII in vivo на кислородзависимый киллинг
иерсиний макрофагами было отмечено увеличение показателей индуцированно-
го НСТ-теста на 1 сутки для АМФ и на 7 сутки для ПМФ (табл. 2).
Таблица 2
Показатели СЦК спонтанного и индуцированного НСТ-теста макрофагов,
выделенных из организма мышей в разные сроки после введения лектина
Срок иммуноге-
неза
Средний цитохимический коэффициент (M±m), усл.ед.
ПМФ АМФ
без бакте-
рий
Y. enterocolitica
295-82
без бакте-
рий
Y. enterocolitica
295-82
Контроль (без
лектина)
1,14±0,04 1,70±0,12* 0,77±0,05 1,34±0,12*
1 сутки 1,21±0,39 1,26±0,20 0,54±0,24 2,02±0,28*
3 сутки 1,14±0,31 0,71±0,28 0,75±0,25 0,64±0,28
5 сутки 0,84±0,20 0,61±0,17 0,71±0,16 0,80±0,26
7 стуки 0,86±0,25 1,70±0,43* 0,55±0,20 0,88±0,23
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05.
15

16. Оценка активности кислороднезависимого киллинга бактерий
на фоне действия лектина ЛII P. polymyxa 1460
Для оценки влияния лектина in vitro на активность механизмов кислород-
независимого киллинга определяли содержание в макрофагах щелочной и кис-
лой фосфатаз и катионных белков в процессе фагоцитоза бактериальных клеток
S. aureus 100 б.
При добавлении лектина ЛII в макрофаги без внесения бактерий показано
снижение активности щелочной фосфатазы в ПМФ. На активность данного
фермента в АМФ бациллярный лектин не влиял. При действии лектина ЛII ак-
тивность щелочной фосфатазы не изменялась в фагоцитирующих АМФ, но зна-
чительно снижалась в ПМФ на ранних стадиях фагоцитоза стафилококков.
Показано также, что лектин ЛII P. polymyxa 1460 увеличивал активность
кислой фосфатазы в альвеолярных макрофагах до фагоцитоза и не оказывал до-
стоверного влияния на активность данного фермента при фагоцитозе бактерий
(рис. 4).
Рис. 4. Динамика активности кислой фосфатазы в макрофагах на фоне действия
лектином
При действии лектина на макрофаги без бактерий отмечено увеличение со-
держания катионных белков в цитоплазме ПМФ, в отличие от АМФ, у которых
содержание этих белков не отличалось от контрольных значений. В процессе
фагоцитоза S. aureus 100 б перитонеальными макрофагами, обработанными лек-
16

17. тином, наибольшее содержание катионных белков было зарегистрировано через
3 часа, а наименьшее – через 1 час инкубации с бактериями, что, однако, не пре-
вышало контрольных значений. Содержание катионных белков в АМФ, обрабо-
танных лектином, в процессе фагоцитоза стафилококков не отличалось досто-
верно от их содержания в цитоплазме фагоцитирующих макрофагов без дей-
ствия лектина.
Влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 на метаболическую ак-
тивность макрофагов в процессе фагоцитоза бактерий
Для оценки влияния лектина ЛII P. polymyxa 1460 на метаболическую ак-
тивность макрофагов нами были проведены эксперименты по определению со-
держания гликогена и липидов в цитоплазме этих клеток в процессе фагоцитоза
бактерий.
Обработка макрофагов лектином не оказала достоверного влияния на со-
держание гликогена в их цитоплазме. Отмечено лишь незначительное увеличе-
ние содержания гликогена в цитоплазме нефагоцитирующих ПМФ, для АМФ
подобный эффект установлен не был (табл. 3).
Таблица 3
Содержание гликогена в обработанных лектином ЛII P. polymyxa 1460 ма-
крофагах в процессе фагоцитоза in vitro S. aureus 100 б
Время фаго-
цитоза, ч
Средний цитохимический коэффициент (M±m), усл.ед.
перитонеальные макрофаги альвеолярные макрофаги
контроль лектин контроль лектин
без бактерий 1,13±0,12 1,48±0,10* 1,46±0,12 1,45±0,09
1 1,18±0,12 1,50±0,09* 1,44±0,09 1,48±0,11
3 1,08±0,11 1,68±0,12* 1,43±0,12 1,27±0,18
6 1,25±0,15 1,29±0,10 1,32±0,12 1,42±0,13
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05.
Изучение содержания липидов в цитоплазме ПМФ выявило достоверное
их увеличение через 3 и 6 часов инкубации с бактериями на фоне действия лек-
тина по сравнению с фагоцитирующими макрофагами без лектина. Полученные
данные совпадают с данными фагоцитарной активности макрофагов на фоне
17

18. действия лектина, когда через 6 часов инкубации с бактериями было отмечено
значительное количество активных макрофагов, хотя процесс фагоцитоза был
незавершенным.
Полученные нами данные свидетельствовали о том, что лектин ЛII
P. polymyxa 1460 способствовал небольшому увеличению энергетических запа-
сов (гликогена и липидов) в интактных перитонеальных макрофагах и их под-
держанию на стабильном уровне в динамике процесса фагоцитоза бактериаль-
ных клеток.
Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о влиянии лек-
тина ЛII на адгезивную способность макрофагов в процессе фагоцитоза бакте-
рий и на активность некоторых микробоцидных факторов в макрофагах до фа-
гоцитоза.
ВЫВОДЫ
1. Установлено влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 in vivo на активность
макрофагов при фагоцитозе бактерий: Staphylococcus aureus 100 б, Es-
cherichia coli Ca 53, Yersinia enterocolitica 295-82. Введение лектина в кон-
центрации 0,4 мкг/мл белым мышам увеличивало адгезивную способность
макрофагов, не влияя существенно на завершенность процесса фагоцитоза
бактериальных клеток.
2. Лектин ЛII в концентрации 0,04 мкг/мл при действии in vitro на макро-
фаги мышей усиливал процесс адгезии и поглощения бактерий S. aureus
100 б, однако процесс фагоцитоза завершался гибелью большинства макро-
фагов. Снижение концентрации лектина до 0,004 мкг/мл незначительно
усиливало адгезию бактериальных клеток макрофагами, но не влияло на за-
вершенность процесса фагоцитоза E. coli Ca 53 и Y. enterocolitica 295-82.
3. Показана возможность специфического связывания лектина ЛII с по-
верхностными структурами макрофагов. Использование в аналогичных
условиях белка нелектиновой природы – БСА не приводило к усилению ад-
гезии макрофагами бактериальных клеток. При действии лектина ЛII, бло-
18

19. кированного специфичными углеводами, фагоцитарная активность перито-
неальных макрофагов не изменялась по сравнению с контролем, у альвео-
лярных макрофагов – увеличивалась.
4. Показано влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 на активность отдель-
ных микробоцидных факторов в цитоплазме макрофагов до фагоцитоза.
Выявлено увеличение активности миелопероксидазы и кислой фосфатазы,
усиление образования активных форм кислорода в альвеолярных макрофа-
гах; увеличение содержания катионных белков и снижение активности ще-
лочной фосфатазы в перитонеальных макрофагах.
5. Установлено, что лектин ЛII не оказывал влияния in vitro на активность
кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий макрофа-
гами.
6. Показано, что лектин ЛII P. polymyxa 1460 способствовал увеличению
содержания гликогена и липидов в интактных перитонеальных макрофагах
по сравнению с контролем (в 1,3 раза), а при фагоцитозе бактериальных
клеток запас этих соединений в цитоплазме оставался на постоянном уров-
не.
7. Выявлены различия в фагоцитарной и метаболической активности пери-
тонеальных и альвеолярных макрофагов на фоне действия лектина ЛII in
vitro и in vivo: ПМФ были более активны в процессе фагоцитоза разных ви-
дов бактерий.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Кочергина (Абросимова) О.П., Новоселова Е.Н., Мухачева Е.С., Тихо-
мирова Е.И., Карпунина Л.В. Влияние бактериального лектина на актив-
ность процесса фагоцитоза и индукцию цитокинов // Стратегия взаимо-
действия микроорганизмов с окружающей средой: Тез. первой региональ-
ной конференции молодых ученых, Саратов, 26 – 27 марта 2002. – Сара-
тов, 2002. – С. 34 – 36.
19

20. 2. Кочергина (Абросимова) О.В., Новоселова Е.А., Мухачева Е.С. Влияние
лектина ЛII Bacillus polymyxa 1460 на активность процесса фагоцитоза //
Науки о человеке: Сб. статей третьего конгресса мол. ученых и специали-
стов, Томск, 16 – 17 мая 2002. – Томск, 2002. – С. 175 – 176.
3. Новоселова Е.А., Кочергина (Абросимова) О.В., Мухачева Е.С. Влияние
лектина ЛII Bacillus polymyxa 1460 на индукцию цитокинов // Науки о че-
ловеке: Сб. статей третьего конгресса мол. ученых и специалистов, Томск,
16 – 17 мая 2002. – Томск, 2002. – С. 185 – 186.
4. Кочергина (Абросимова) О.В., Тихомирова Е.И., Горельникова Е.А., Ру-
дик Д.В., Карпунина Л.В. Изменение фагоцитарной активности макрофа-
гов при действии лектина ЛII Paenibacillus polymyxa 1460 // Актуальные
проблемы медицины и биологии: Сб. научных работ, Томск, 2003. – Вып.
2. – С. 112 – 114.
5. Горельникова Е.А., Тихомирова Е.И., Кочергина (Абросимова) О.В., Ру-
дик Д.В., Мухачева Е.С. Синтез провоспалительных цитокинов макрофа-
гами мышей при действии лектина ЛII Paenibacillus polymyxa 1460 // Ак-
туальные проблемы медицины и биологии: Сб. научных работ, Томск,
2003. – Вып. 2. – С. 106 – 107.
6. Тихомирова Е.И, Абросимова О.В., Горельникова Е.А., Карпунина Л.В
Особенности фагоцитоза патогенных бактерий и индукция цитокинов на
фоне действия бактериального лектина // Russian Journal of Immunology. –
2004. – V.9. – С. 55.
7. Абросимова О.В., Горельникова Е.А. Анализ активности фагоцитоза энте-
ропатогенных бактерий на фоне действия лектина Paenibacillus
polymyxa // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей
средой: Тез. второй региональной конференции молодых ученых, Сара-
тов, 26 – 28 октября 2004. – Саратов, 2004. – С. 28 – 29.
8. Горельникова Е.А, Абросимова О.В. Влияние лектина бацилл на синтез
провоспалительных цитокинов при фагоцитозе Yersinia enterocolitica //
Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Тез.
20

21. второй региональной конференции молодых ученых, Саратов, 26 – 28
октября 2004. – Саратов, 2004. – С. 29 – 30.
9. Абросимова О.В., Горельникова Е.А., Тихомирова Е.И., Карпунина Л.В.
Некоторые аспекты действия бактериального лектина на фагоцитирую-
щие макрофаги мышей // Успехи современного естествознания. – 2004. –
№4. – С.97 – 98.
10. Горельникова Е.А., Абросимова О.В., Тихомирова Е.И., Карпунина Л.В.
Синтез ИЛ-1 и ФНО-α макрофагами мышей на фоне действия бактери-
ального лектина // Успехи современного естествознания. – 2004. – №4. –
С. 104 – 105.
11.Abrosimova O.V. Bacterial lectin influences activity of adhesion stage in
phagocytosis of conditionally pathogenic bacteria by macrophages and synthe-
sis of antiphlogistic cytokines // Abstract 7th
John Humphrey advanced summer
programme in immunology, Moscow, September 5 – 9, 2005. – Moscow, 2005.
– P. 3.
12. Абросимова О.В., Тихомирова Е.И., Карпунина Л.В. Влияние лектина
Paenibacillus polymyxa на фагоцитоз Yersinia enterocolitica макрофагами //
Вавиловские чтения – 2005: Материалы конференции, посвященной 118
годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 23 – 25 ноября
2005, секция ветеринария и биотехнология. – Саратов, 2005. – С. 3 – 6.
13. Абросимова О.В., Тихомирова Е.И., Карпунина Л.В. Изучение функцио-
нальной активности макрофагов на фоне действия лектина Paenibacillus
polymyxa // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавило-
ва. – 2006. – №1. – С. 3 – 6.
14. Абросимова О.В., Сенотова О.В. Изменение метаболической активности
фагоцитирующих макрофагов, обработанных in vitro лектином ЛII
Paenibacillus polymyxa // Биология наука XXI века: Тез. 10 Пущинской
школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинско-
го научного центра, Пущино, 17 – 21 апреля 2006. – Пущино, 2006. – С.
124.
21