1. By NA 1
Diagnosi Prenatale II

2. By NA 2
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
• Cromosomi di cui non è riconoscibile con
le metodiche classiche la provenienza
• Frequenza alla nascita 0.14-0.72/1000
• Difficile correlazione genotipo-fenotipo in
diagnosi prenatale
• Importante il rilievo della caratterizzazione
molecolare

3. By NA 3
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
In più del 50% dei casi è oggi possibile
fare previsioni fenotipiche corrette:
• Invdup15 (50% ESAC)
• Cromosomi sessuali

4. By NA 4
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Amniocentesi paziente di 41 aa
Presenza di un ESAC in tutti i cloni
de novo
piccole dimensioni

5. By NA 5

6. By NA 6

7. By NA 7
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
CBG positivo DA/DAPI positivo
FISH centromero 15 positiva
Invdup(15)
Definizione del tipo

8. By NA 8

9. By NA 9

10. By NA 10
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
FISH sonde pericentromeriche
(D15S11; GABR3) NEGATIVA
Invdup(15) tipo I
Assenza di anomalie del fenotipo

11. By NA 11
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Rischio di Disomia Uniparentale
15q11-q13 da origine postzigotica
del marcatore
Materna Paterna
s. Prader/Willi s. Angelman

12. By NA 12

13. By NA 13

14. By NA 14
D15S130 D15S165
P F M P F M
Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE

15. By NA 15
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE
CON MARCATORI POLIMORFICI DEL
CROMOSOMA 15

16. By NA 16

17. By NA 17

18. By NA 18

19. By NA 19

20. By NA 20
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Amniocentesi paziente di 35 aa
Presenza di un ESAC
de novo
piccole dimensioni

21. By NA 21
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
CBG positivo DA/DAPI negativo
FISH 13,14,15,21,22,X,Y negativa
Rischio alterazioni fenotipiche 5%
Ecografia/Ecocardiografia
Riduzione rischio di 1/3

22. By NA 22
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Paziente in gravidanza di 31 aa
↓
Riscontro ecografico NT aumentata

23. By NA 23
Toshiba Instruments

24. By NA 24
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
NT aumentata
↓
↑↑ rischio aneuploidie
↓
Prelievo villi coriali a 11 settimane
↓
Presenza di ESAC de novo
piccole dimensioni, bisatellitato

25. By NA 25
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
FISH 13,14,15,21,22
↓
Positiva per
centromero 22
↓
invdup(22)
↓
Cat/Eye syndrome

26. By NA 26
Cat Eye syndrome
Malf. orecchio 86%
Malf.anorettali 81%
Malf. urogenitali 71%
Coloboma occhio 61%
Altre Malformazioni

27. By NA 27
Cat Eye syndrome
Malformazioni
cardiache 62%
di cui 1/3 Anomalie del
Ritorno Venoso
Polmonare

28. By NA 28
Cat Eye syndrome
RITARDO MENTALE ??
Severo 7%
Moderato/lieve 47%

29. By NA 29
Cat Eye syndrome
Assenza di
correlazioni tra
estensione/regioni
geniche presenti nel
cromosoma
invdup(22) ed
anomalie del
fenotipo

30. By NA 30
Cat Eye syndrome
CES Tipo I vs CES
Tipo II non ha
utilità dal punto
di vista clinico

31. By NA 31

32. By NA 32
Cellule normali Cellule del paziente
estrazione del DNA
DNA
genomico
DNA
genomico
Ibridazione
marcatura marcatura
Metafase maschile normale
DNA di riferimento rosso DNA test verde
microscopio a fluorescenza
acquisizione dell’immagine
elaborazione dell’immagine
analisi del rapporto di fluorescenza
lungo l’asse cromosomico
CGH

33. By NA 33
p q
Ideogramma
amplificazione
delezione
Intensità di
fluorescenza
Verde/Rosso
area del
cromosoma
area del
cromosoma

34. By NA 34

35. By NA 35

36. By NA 36
Sindrome plurimalformativa
 tetraparesi spastica di grado medio
 ritardo mentale
 turbe comportamentali
 stereotipia
 microcefalia
 dismorfismi cranio facciali

37. By NA 37
Mosaicismo
• Amniocentesi → cellule dall’epiblasto della
massa cellulare interna.
• Villocentesi – Coltura a breve termine →
cellule del trofoblasto.
• Villocentesi – Coltura a lungo termine →
cellule dello stroma (mesoderma
extraembrionario).

38. By NA 38

39. By NA 39
MOSAICISMO
• I Livello: singola cellula
• II Livello: due o più cellule in una flask con
la stessa anomalia o singolo clone
• III Livello: due o più cellule in più flask con
la stessa anomalia o almeno 2 cloni

40. By NA 40
Liquido Amniotico Mosaicismi
• Livello I  2.5-7 %
• Livello II  0.7-1.1 %
• Livello III  < 0.2 %

41. By NA 41
MOSAICISMO
• PSEUDOMOSAICISMO
• MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA
(chorion, amnion)
• MOSAICISMO VERO
La grande maggioranza dei mosaicismi in
diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali

42. By NA 42
Mosaicismo trisomia 11
Paziente di 29 anni
Indicazione: familiarità s. Down

Cariotipo fetale
46,XX (10 cloni)/47,XX,+11 (1 clone)

Mosaicismo II livello

43. By NA 43
Linee Guida work-up
Moderato: altre 10 cellule dalla flask con anomalia oppure altri 12 cloni.
Flask
• Cr. Sessuale sovra-numerario
(SC,MC)
• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7,
10,11,16,17,19 (SC, MC)
• 45,X - Monosomie (MC)
• Alt. bilanciate (MC)
• Marcatore (SC)
In situ
• Cr. Sessuale sovra-numerario
(SCo,MCo)
• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7,
10,11,16,17,19 (SCo, MCo)
• 45,X - Monosomie (SCo, MCo)
• Alt. bilanciate (MCo)
• Marcatore (SCo)

44. By NA 44
Mosaicismo trisomia 11
Estensione analisi a 41 cloni

Cariotipo
46,XY (39 cloni)/47,XY,+11 (2 cloni)

Mosaicismo III livello

45. By NA 45
Liquido Amniotico
Mosaicismi - Livello III
• Conferma sino al 40 % alla cordocentesi
ed al 50%(autosomi), 80% (ESAC) e
90% (cr. sessuali) al follow-up
• Tipo di Cromosoma (es. ESAC)
• Utilizzo e limiti della Cordocentesi

46. By NA 46
Mosaicismo trisomia 11
• Solo 2 casi in letteratura, con bassa
frequenza (2.7 e 5.5%), apparentemente
non associati ad alterazioni fenotipiche
• Rischio s. Beckwith-Wiedemann da
disomia uniparentale 11

47. By NA 47
Meccanismi UDP
• Complementazione gametica
• Recupero dello zigote trisomico
• Duplicazione mitotica
• Errore post-zigotico

48. By NA 48

49. By NA 49
DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA
11
Regione 11p15.5 eterodisomia paterna
↓
Alterata espressione di geni da imprinting genomico
↓
2 casi di s. Beckwith-Wiedemann

50. By NA 50
DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA
11
Polimorfismi Cromosoma 11 - Tecnica PAGE
P F M P F M P F M

51. By NA 51
Mosaicismo trisomia 11
• Esame citogenetico:
Cariotipo 46,XY
(150 metafasi)
Attesa Fenotipo nella norma
(follow-up a 24 mesi)
• Screening molecolare con
microsatelliti cromosoma
11:
Esclusione UDP

52. By NA 52
Mosaicismo trisomia 4
Paziente di 40 anni
Indicazione: età

Cariotipo fetale
46,XX (31 cloni)/47,XX,+4 (9 cloni)

Mosaicismo III livello

53. By NA 53
Mosaicismo trisomia 4
Solo 3 casi in letteratura:
- 2 con bassa frequenza (<= 10%),
apparentemente non associati ad alterazioni
fenotipiche
- 1 con an. faciali e malf. multiple: ad 1 anno
buon follow-up
- Problema UPD

54. By NA 54
Mosaicismo trisomia 4
Counselling
• Ecografia/Ecocardiografia fetale
• Prelievo sangue funicolare per esame
cariotipo ed esclusione UPD
In caso di interruzione:
Esame citogenetico su tessuti diversi

55. By NA 55
Mosaicismo trisomia 4
• Ipoplasia cerebellare
• Ventricolomegalia
borderline
Fetal MRI

56. By NA 56
Mosaicismo trisomia 4
CAV completo

57. By NA 57
Mosaicismo trisomia 4
• Micrognazia
• Ipotelorismo
• Deformità rachide
(emivertebre)
• s. atresia esofagea

58. By NA 58
Mosaicismo trisomia 4 DISOMIA
UNIPARENTALE
Polimorfismi Cromosoma 4 - Tecnica PAGE
D4S243 D4S175
P CF M P CF M

59. By NA 59
Diagnosi Malattie DNA
• Numero elevato malattie
• Numero elevato di mutazioni (es.
Fibrosi cistica)
• Coinvolgimento geni diversi (es.
Retinite pigmentosa)

60. By NA 60
Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti
→ Conoscenza gene/i
• Identificazione della specifica
mutazione

61. By NA 61
Conoscenza geni
Mendeliane
• Talassemia
• Fibrosi cistica
• Chorea di Huntington
• Distrofia di
Duchenne
Complesse
(loci suscettibilità)
• ApoE → Alzheimer
• 19p13;Xq24 → Cefalea
• 12q;2q → Diabete NID
• 3q21 → Psoriasi

62. By NA 62
Conoscenza geni
8000 malattie
↓
geni noti 30%
(60-70% pazienti)

63. By NA 63
Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti
• Conoscenza gene/i implicati
→ Identificazione della
specifica mutazione

64. By NA 64
Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)
•Una delle più comuni malattie genetiche dell’infanzia
•Ubiquitariamente diffusa nel mondo
•Colpiti pressochè esclusivamente maschi
•Ereditata come malattia recessiva X-linked
Si manifesta con debolezza muscolare
progressiva. I muscoli mostrano una pseudo-
ipertrofia, molto evidente nel polpacci: in realtà le
fibre muscolari sono rimpiazzate da tessuto
grasso/adiposo.

65. By NA 65
DIAGNOSI DMD
• Progressiva perdita
muscolare e debolezza.
• Ridotta contrazione
muscolare.
• Incurvamento della colonna
vertebrale.
• Posizionamento doloroso
delle articolazioni.
• Difficoltà nei movimenti
quotidiani.
↑↑ livelli CK
Biopsia muscolare

66. By NA 66
DIAGNOSI DMD
• ANALISI DI DELEZIONE (60% circa dei casi):
– PCR multipla per 26 esoni dei 79 presenti nel gene.
– Evidenziazione degli amplificati su gel-elettroforesi
– Si diagnostica la delezione quando un prodotto di
amplificazione è assente in due separate reazioni di
amplificazione.
• ANALISI COMPLETA DEL GENE:
– Se non è presente una delezione ampia, allora si ricorre ad
uno studio dettagliato del gene mediante tecniche analitiche,
sino al sequenziamento diretto.
– Una volta trovata la mutazione nel probando, è possibile
testare rapidamente qualsiasi soggetto della famiglia a rischio.

67. By NA 67
MULTIPLEX P.C.R.

68. By NA 68
DIAGNOSI DMD
Paziente di 27 anni in gravidanza
con fratello affetto da DMD
↓
Analisi Fratello
↓
Delezione degli esoni 45-52
↓
Studio familiare di linkage
(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)
↓
Paziente Portatrice della Mutazione

69. By NA 69
DIAGNOSI DMD
Paziente 27 anni portatrice in gravidanza
↓
Prelievo dei Villi coriali a 10 settimane
90% dei villi 10% dei villi
ESTRAZIONE DNA (se possibile)
Analisi molecolare Analisi cariotipo
con PCR multipla

70. By NA 70
DIAGNOSI DMD
Paziente di 23 anni in gravidanza
con due nipoti deceduti per DMD
↓
Studio familiare di linkage
(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

71. By NA 71
DIAGNOSI DMD

72. By NA 72
DIAGNOSI DMD
Paziente non Portatrice dell’Aplotipo associato
alla DMD
↓
DIAGNOSI PRENATALE
NON NECESSARIA !!!

73. By NA 73
DIAGNOSI DMD
Paziente di 26 anni in gravidanza (13 settimane)
con due figli affetti da DMD
↓
Analisi Figli
↓
No Delezione degli esoni
↓
Studio di linkage

74. By NA 74
DIAGNOSI DMD
Aplotipo fetale
ricombinante
Rischio DMD
per il feto: 14%
(62/79 esoni derivano
dal materno normale)

75. By NA 75
Fibrosi cistica
1000 variazioni di sequenza
- 83% (>800) mutazioni - 17% polimorfismi
Caucasici 70% ∆F508

76. By NA 76
31 Mutazioni
più frequenti
D.R. = 80%

77. By NA 77
Caratterizzazione clinica complessa
Ragazza 17 anni
Alla età di 12 anni:
Iridi stellate
Ritardo mentale s. Williams
Personalità cocktail party

78. By NA 78
SINDROME DI WILLIAMS
• Dismorfismo faciale (“elfin
facies”)
• Ritardo di crescita pre e
postnatale
• Deficit cognitivi (alt.
integrazione spazio-visiva);
lieve RM
• Stenosi aortica
sopravalvolare, s.
polmonare, difetti di
setto, prolasso mitrale
• Ipercalcemia infantile
DELEZIONE 7q11.23
gene ELN