Методи мікроскопіювання

1. Лабораторна робота №1
Частина2. Методи
мікроскопіювання

2. Метод фазово-контрастної мікроскопії
дозволяє перетворити невидимі фазові
зміни, що супроводжують проходження
світлової хвилі через мікробну клітину,
у видимі амплітудні і тим самим
підвищити контрастність зображення.
Мікроскопія в темному полі заснована
на висвітленні об'єкта косими
променями світла. Спостерігач бачить
на чорному тлі інтенсивно світні об'єкти,
навіть якщо їхній діаметр у 10 разів
менший, ніж роздільна здатність
об'єктива.
Методи мікроскопії:

3. Люмінесцентна мікроскопія заснована
на здатності ряду речовин біологічного
походження і деяких барвників
світитися під впливом падаючого на
них світла. Викликати люмінесценцію
можна або короткохвильовою
частиною видимого спектра (синьо-
фіолетові промені, λ = 460 нм), або
ультрафіолетовими променями (λ=
360-380 нм). В обох випадках виникає
кольорове зображення об'єкта.
Електронна мікроскопія. Електронні
мікроскопи застосовують для вивчення
об'єктів і структур, що знаходяться за
межами видимості звичайних
мікроскопів. Роль світлових променів в
електронному мікроскопі грає пучок
електронів, випромінюваних
спеціальним джерелом - електронною
гарматою. Зображення фокусується на
спеціальному екрані.
Методи мікроскопії:

4. Інші сучасні методи дослідження
клітин Метод рентгеноструктурного аналізуМетод рентгеноструктурного аналізу заснований на явищі
дифракції рентгенівських променів і дає можливість визначити
просторове розташування молекул. Застосовується для вивчення
структури білків, нуклеїнових кислот та інших речовин, що входять до
складу цитоплазми і ядра клітини.
 Методи цито- і гістохіміїМетоди цито- і гістохімії засновані на здатності барвників вибірково
зафарбовувати хімічні речовини. Методи використовуються для
вивчення хімічного складу тканин і клітин із збереженням їх
структури, а також для визначення локалізації хімічних речовин.
Наприклад, реакція Фельгена на ДНК або фарбування метиловим-
зеленим-піроніном на нуклеїнові кислоти (метод Браше). В основі
реакції Фельгена лежить кислотний гідроліз ДНК на зрізі фіксованої
тканини, у процесі якого від ДНК відокремлюється альдегідна група,
що і реагує з реактивом Шиффа (фуксинсерністою кислотою). У
результаті ДНК хроматину надобуває яскравого червоно-фіолетового
забарвлення. Під час фарбування за методом Браше піронін
зв'язується із РНК, зафарбовує її в рожевий колір, а метиловий
зелений зв'язується тільки із ДНК, зафарбовучи її в синьо-зелений
колір.

5. Інші сучасні методи
дослідження клітин
 Метод диференціального центрифугуванняМетод диференціального центрифугування заснований на різній швидкості осадження
(седиментації) окремих частинок під дією відцентрової сили й використовується для розділення
внутрішньоклітинних структур. Коефіцієнт седиментації (S) визначається швидкістю руху
макромолекул у полі із прискоренням, рівним І, виміряюється в одиницях, що мають назву
СВЕДБЕРГИ (1 S = 1⋅10-13
с). Для визначення S використовується центрифугування за умов
високої швидкості (30 000...60 000 обертів/хв). Досліджуваний матеріал попередньо подрібнюють
у гомогенізаторі. Для швидкісної седиментації використовується середовище однакової щільності
(наприклад з СsCl2). Компоненти клітини, спочатку рівномірно розподілені по всьому обсязі
пробірки (А), під час центрифугування осідають кожний зі своєю швидкістю (В). У результаті, уміст
пробірки розділяється на фракції (шари), з яких нижній представлений найважчими структурами,
а верхній – найлегшими (С).

6.  Метод цитоспектрофотометріїМетод цитоспектрофотометрії заснований на тому, що
інтенсивність поглинання променів прямо пропорційно
концентрації речовини. За допомогою спеціального приладу
(мікроспектрофотометра) вимірюється оптична густина
пофарбованих цито- і гісто- хімічними методиками субстратів
(нуклеїнових кислот, білків, вуглеводів, ферментів). Величина
оптичної густини характеризує концентрацію досліджуваної
речовини в структурах. Для кількісного аналізу необхідно
знати площу й об’єм структур (ядер, цитоплазми), у яких
вимірюється оптична густина субстрату. Кількість речовини
виражається в умовних одиницях (ДНК можна виразити в
одиницях плоїдності, якщо прийняти як стандарт сперматиди
сім’яників (n) або лімфоцити крові (2n)). Метод
застосовується для вивчення плоїдності ядер, для вивчення
концентрації РНК, полісахаридів, білків та інших речовин в
умовах розвитку патологічного процесу або за
експериментального впливу.
Інші сучасні методи дослідження
клітин

7.  Метод гістоавторадіографії (авторадіографії)Метод гістоавторадіографії (авторадіографії)
заснований на використанні радіоактивних
ізотопів: тритію (Н3
), сульфуру S35
, карбону С14
та ін.
Коли будь-яку речовину, що містить радіоактивний
атом, вводять у живу клітину, то клітина
використовує її нарівні з нерадіоактивними
ізотопами для синтезу нових речовин. Сліди
радіоактивних частинок реєструють шляхом
нанесення світлочутливої емульсії на гістологічний
препарат. У місцях проходження частинок
світлочутлива емульсія засвічується, а після
проявлення ці ділянки виглядають як чорні крапки
(треки). Метод використовується для вивчення
обмінних процесів (реплікації ДНК, синтезу білка)
на клітинному й тканинному рівнях.
Інші сучасні методи дослідження
клітин

8.  Метод культивування клітин і тканинМетод культивування клітин і тканин заснований на вирощуванні (експлантації)
ізольованих клітин, шматочків тканин, органів поза організмом (іn vіtro). Розрізняють
клітинне, тканинне й органне культивування. При клітинному й тканинному культивуванні
окремі клітини або шматочки тканини вирощують зануреними в поживне середовище Такий
спосіб дозволяє зберегти морфологічну структуру клітин і тканин, що культивуються.
Культури клітин дають можливість одержати однорідний клітинний матеріал у великих
кількостях. На клітинних культурах можна вивчати фізичні й хімічні впливи. На культурах
клітин розроблений комплекс спеціальних методів, у тому числі гібридизація соматичних
клітин і утворення гетерокаріонів. При органному культивуванні клітини шматочки тканини
або органа (найчастіше взяті в ембріона) вирощують на поверхні поживного середовища.
Органне культивування дозволяє зберегти морфологічну структуру органу, що вирощується,
властиву йому в умовах цілого організму. При цьому зберігається не тільки морфологічна
структура, але й функціональні властивості тканини, що дозволяє спостерігати процеси
диференціювання, виявляти дію біологічно активних речовин на культуру, простежити за
динамікою змін, що виникають.
Інші сучасні методи дослідження
клітин