More Related Content
Similar to โครงงานฉบับสมบูรณ์
Similar to โครงงานฉบับสมบูรณ์ (20)
โครงงานฉบับสมบูรณ์
- 4. 4
โครงงานวิทยาศาสตร์ ระดับมัธยมศึกษาตอนปลาย สาขาชีวภาพ ประเภททีม
ชื่อเรื่อง การศึกษาสารสกัดจากธรรมชาติที่สามารถยับยั้งเชื้อราที่ปนเปื้อนในการเพาะเลี้ยง
เนื้อเยื่อพืช
ชื่อผู้วิจัย 1.นางสาวณัฐธยาน์ วาณิชยกุลวงษ์
2.นางสาวปรียานุช เปรมสมาน
3.นางสาวปริญญา ยั่งสันติวงศ์
ชื่ออาจารย์ที่ปรึกษา ครูมงคล ปัญญารัตน์
โรงเรียน ยุพราชวิทยาลัย 238 ถนนพระปกเกล้า อาเภอเมือง จังหวัดเชียงใหม่
รหัสไปรษณีย์50200 โทรศัพท์ 053-418673-5 โทรสาร 053-418673-5
ระยะเวลาทาโครงงาน ตั้งแต่เดือน มีนาคม 2559 – เดือนกรกฎาคม 2560
บทคัดย่อ
สภาพปลอดเชื้อถือว่าเป็นหัวใจสาคัญต่อการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เทคนิคการทาให้ปลอดเชื้อ
มีหลายวิธี วิธีการทางเคมีเป็นวิธีหนึ่งที่นามาใช้ทดแทนการใช้เครื่อง Autoclave ที่มีราคาแพง ปัจจุบันพบมี
รายงานการใช้ไฮเตอร์ผสมในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ซึ่งสามารถทาให้ปลอดเชื้อจากแบคทีเรียได้ดี
แต่ยังพบว่ามีการปนเปื้อนจากเชื้อราอยู่จากเนื้อเยื่อของพืชเพาะเลี้ยง อีกทั้งเกรงว่าไฮเตอร์จะสะสมอยู่ใน
พืชเพาะเลี้ยง คณะผู้จัดทาจึงสนใจที่จะศึกษาสารสกัดจากธรรมชาติที่หาได้ง่ายในท้องถิ่นที่สามารถยับยั้ง
การเจริญของเชื้อราที่พบปนเปื้อนในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้จากการคัดแยกเชื้อราปนเปื้อน
ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช พบว่าได้จานวน 8 ไฮโซเลต คือ เชื้อรา1 เชื้อรา2 เชื้อรา3 เชื้อรา4 เชื้อรา5 เชื้อรา6
เชื้อรา7 และ เชื้อรา8 เมื่อนาสารสกัดสมุนไพรจานวน 13 ชนิดมาทดสอบความสามารถในการยับยั้งเชื้อราที่
คัดแยกได้ด้วยวิธีการทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดจากธรรมชาติในการยับยั้งเชื้อราที่แยกได้
พบว่ากระเทียมยับยั้งเชื้อรา2 ได้เพียงชนิดเดียว
ข
- 5. 5
สารบัญ
เรื่อง หน้า
กิตติกรรมประกาศ ก
บทคัดย่อ ข
สารบัญ ค
สารบัญตาราง ง
สารบัญภาพ จ
บทที่ 1 บทนา 1
บทที่ 2 เอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 3
บทที่ 3 วิธีดาเนินโครงงาน 10
บทที่ 4 ผลและอภิปรายผลโครงงาน 13
บทที่ 5 สรุปผลโครงงาน 16
ภาคผนวก 18
บรรณานุกรม 22
ค
- 7. 7
สารบัญภาพ
ภาพที่ หน้า
ภาพ 2.1 กานพลู 5
ภาพ 2.2 กระชาย 6
ภาพ 2.3 มะกรูด 7
ภาพ 2.4 ชะพลู 8
ภาพ 3.1 อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เจาะหลุมและวางเชื้อราทดสอบแล้ว 12
ภาพ 4.1 เชื้อรา 8 ไอโซเลตที่แยกได้จากอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 13
ภาพภาคผนวก 1.1 เตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสูตรกิตติศักดิ์ 19
ภาพภาคผนวก 1.2 การเตรียมสมุนไพรโดยการชั่ง 19
ภาพภาคผนวก 1.3 การเตรียมสมุนไพรโดยการปั่น 20
ภาพภาคผนวก 1.4 สกัดสารโดยใช้ Ethyl Alcohol 20
ภาพภาคผนวก 1.5 การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดหยาบจากสมุนไพรในการยับยั้งเชื้อรา 21
ภาพภาคผนวก 1.6 ผลการทดลอง 21
จ
- 8. 8
บทที่ 1
บทนา
1.1 ที่มาและความสาคัญของโครงงาน
หลักการการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชให้สาเร็จ อยู่ที่องค์ประกอบของสารอาหารและเทคนิคการปลอดเชื้อ
เนื้อเยื่อพืชจึงจะเจริญเติบโตได้ดีและปลอดโรค ปัจจุบันมีเทคนิคการทาให้ปลอดเชื้อโดยใช้ไฮเตอร์เป็นสาร
ฆ่าเชื้อในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชแทนการฆ่าเชื้อโดยใช้หม้อนึ่งความดันไอน้า121 องศาเซลเซียส 15
ปอนด์ 15 นาที ด้วย Autoclave การฆ่าเชื้อโดยไฮเตอร์ดังกล่าวสามารถฆ่าเชื้อแบคทีเรียได้แต่ยังพบปัญหา
การปนเปื้อนจากเชื้อรา จึงควรคัดเลือกสารกลุ่มอื่นมาช่วยในการฆ่าเชื้อราและด้วยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
ที่มีขั้นตอนยุ่งยาก ยากต่อการที่เกษตรกรจาได้สาเร็จจึงควรเลือกใช้สารที่มีราคาถูกและหาได้ง่ายในท้องถิ่น
เป็นส่วนผสมและยังต้องไม่มีฤทธิ์เป็นพิษต่อเซลล์พืช ผู้ทาวิจัยจึงสนใจที่จะศึกษาสารสกัดจากธรรมชาติมา
เป็นองค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชหรือใช้ในขั้นตอนการฆ่าเชื้อจากเนื้อเยื่อพืชร่วมกับไฮเตอร์เพื่อ
ฆ่าเชื้อราที่ปนเปื้อนในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
1.2 วัตถุประสงค์ของโครงงาน
1. เพื่อคัดแยกเชื้อราที่ปนเปื้อนในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย
2. เพื่อหาสารสกัดจากธรรมชาติที่มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราที่ปนเปื้อนในการเพาะเลี้ยง
เนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย
1.3 สมมติฐานของโครงงาน
สารสกัดจากธรรมชาติสามารถยับยั้งเชื้อราที่ปนเปื้อนในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้
1.4 ขอบเขตของโครงงาน
1.4.1 ตัวแปร
ตัวแปรต้น สารสกัดจากธรรมชาติ
ตัวแปรตาม ความสามารถในการยับยั้งการเจริญเติบโตเชื้อรา
ตัวแปรควบคุม ปริมาณอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ สูตรอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
ชนิดเนื้อเยื่อพืช อุณหภูมิ สถานที่ทาการทดลอง ปริมาณที่ใช้ทดสอบ ขนาดของขวดอาหาร
1.4.2 ระยะเวลาที่ใช้ในการทาโครงงาน เดือนมีนาคม พ.ศ.2559 ถึงเดือนกรกฎาคม พ.ศ.2560
- 9. 9
1.4.3 สถานที่ใช้ในการทาการทดลอง -ห้องปฏิบัติการชีววิทยาโรงเรียนยุพราชวิทยาลัย
-ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ศูนย์วิทยาศาสตร์
และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเชียงใหม่
1.5 นิยามศัพท์เฉพาะ
1.5.1 การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช หมายถึง การเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนพืชหรืออาจหมายถึงการเพาะเลี้ยง
เซลล์ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ หรือการเพาะเลี้ยงอวัยวะในอาหารสังเคราะห์สูตรต่าง ๆ ภายใต้สภาวะที่
เหมาะสมและปลอดเชื้อ (สมพร, 2549)
1.5.2 สภาพปลอดเชื้อ หมายถึง ปราศจากจากจุลินทรีย์ที่เป็นอันตรายและที่ทาให้เน่าเสียที่เจริญได้
ที่อุณหภูมิห้อง (สุรพงษ์, 2554)
1.5.3 สารสกัดจากธรรมชาติ หมายถึง การแยกสารออกฤทธิ์ออกจากวัตถุดิบจากธรรมชาติ โดยใช้
ตัวทาละลายซึ่งสามารถละลายสารออกฤทธิ์ที่ต้องการออกมา (พิมพร,2544)
1.5.4 การยับยั้งการเจริญเติบโต หมายถึง สภาพคงที่หรือไม่เจริญ (วัชวัลย์, 2558)
1.6 ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับ
1.6.1 ได้เชื้อราที่มักพบปนเปื้อนในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
1.6.2 ได้สารสกัดจากธรรมชาติที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราที่ปนเปื้ อนใน
กระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
1.6.3 นาไปประยุกต์สร้างสูตรอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชที่ปลอดการปนเปื้อนเชื้อแบคทีเรียและ
เชื้อรา โดยไม่ใช้ Autoclave ในการฆ่าเชื้อ
2
- 10. 10
บทที่ 2
เอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง
2.1 เอกสารที่เกี่ยวข้อง
2.1.1 การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (Plant tissue culture)
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือ การนาเอาส่วนใดส่วนหนึ่งของพืช ไม่ว่าจะเป็นส่วนอวัยวะ หรือ
ส่วนเนื้อเยื่อมาเลี้ยงในอาหารวิทยาศาสตร์ที่ประกอบด้วย แร่ธาตุ น้าตาล วิตามิน และสารควบคุม
ความเจริญเติบโต ภายใต้สภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์และอยู่ในสภาวะควบคุมอุณหภูมิ แสง ความชื้น โดยส่วน
ของพืชที่นามาเลี้ยงนี้จะสามารถเติบโตพัฒนาได้หลายรูปแบบ เช่น พัฒนาเป็นส่วนอวัยวะ เกิดเป็นกลุ่ม
เซลล์ที่เรียกว่า แคลลัส หรือ คัพภะ (ต้นอ่อนขนาดเล็ก) ที่เรียกว่า เอ็มบริโอ และยังสามารถบังคับให้ส่วน
ต่างๆ เหล่านี้เกิดเป็นต้นใหม่ที่มีรากที่สมบูรณ์สาหรับการนาไปปลูกลงดินต่อไปได้ (สานักงานพัฒนา
วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2542)
พืชที่เกิดขึ้นมาจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะมีลักษณะเหมือนกับพืชต้นพันธุ์ที่นามาใช้เพาะเลี้ยง
ทุกประการ จึงเป็นวิธีการหนึ่งที่สามารถนามาใช้ในการขยายพันธุ์พืช และการเก็บรักษาและอนุรักษ์
เชื้อพันธุ์พืชต่างๆ โดยอาศัยการเก็บกลุ่มเซลล์ที่เรียกว่า แคลลัสของพืชไว้ที่อุณหภูมิเย็นจัดถึง -196 °C
ภายใต้ไนโตรเจนเหลว ซึ่งวิธีนี้จะสามารถเก็บพืชได้เป็นเวลานานโดยไม่มีการกลายพันธุ์ หรืออาจใช้ใน
การเก็บรวบรวมพันธุ์พืชโดยบังคับให้พืชโตช้าๆ ในขวดแก้วเล็กๆ ซึ่งการอนุรักษ์พันธุ์พืชเช่นนี้จะใช้พื้นที่
น้อยกว่าการเก็บพันธุ์พืชที่ผลิตเป็นต้นพืชโดยตรง (สานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ,
2542)
นอกจากนี้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชยังมีประโยชน์ต่อการแลกเปลี่ยนพันธุ์พืชกับต่างประเทศ
ที่สะดวกขึ้นพืชที่อยู่ในขวดสะอาดปราศจากเชื้อจุลินทรีย์และราที่จะทาอันตรายต่อพืชโดยเฉพาะ
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสมุนไพรในรูปแบบเซลล์แขวนลอยยังช่วยในการผลิตสารต่างๆที่ใช้เป็น
ยารักษาโรคหรือสารที่ใช้เป็นยาฆ่าแมลงได้ อีกทั้งยังเป็นประโยชน์มหาศาลในการปรับปรุงพันธุ์พืชให้พืช
ต้านทานโรคและแมลงได้ดีขึ้นหรือให้ผลผลิตมากขึ้นโดยอาศัยเทคนิคในการเลี้ยงต้นอ่อนขนาดเล็กเทคนิค
ในการเพาะเลี้ยงอับละอองเกสรและละอองเกสรพืชหรือเทคนิคในการชักนาให้พืชกลายพันธุ์เป็น
พันธุ์ใหม่ๆ โดยอาศัยสารเคมีหรือการฉายรังสี เป็นต้น (สานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
แห่งชาติ, 2542)
- 11. 11
2.1.2 อาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
อาหารเพาะเลี้ ยงเนื้อเยื่อพืชในโครงงานนี้ ใช้สูตรอาหารของผู้ช่วยศาสตราจารย์
ดร.กิตติศักดิ์ โชติเดชาณรงค์ในการศึกษา ซึ่งมีส่วนประกอบและวิธีการ คือ ชั่งวุ้นปริมาณ 8 กรัม และ
น้าตาล 30 กรัม ต่อการทาอาหาร 1 ลิตร ละลายน้าตาล 30 g ในน้า 500 ml คนให้ละลาย เติมสูตรอาหาร
ไฮโดรโปนิก สูตร A และ B ปริมาตรอย่างละ 5 ml ปรับ pH ให้เท่ากับ 5.8 ใส่ผงวุ้นตรานางเงือกปริมาณ 7
กรัม นาไปต้มจนเดือด ปรับอุณหภูมิให้เย็นลงเหลือ 60 องศาเซลเซียส เติมน้ายาฆ่าเชื้อไฮเตอร์ปริมาตร 0.5
มิลลิลิตร แล้วเทลงใน plate (กิตติศักดิ์, 2556)
2.1.3 พืชที่ใช้ในงานวิจัย
1) กานพลู
ชื่อวิทยาศาสตร์: Syzygium aromaticum
วงศ์ : MYRTACEAE
ชื่อสามัญ : Clove, Clove tree
ถิ่นกาเนิด : พืชประจาถิ่นของประเทศฟิลิปปินส์ แต่ปัจจุบันประเทศแทนซาเนียเป็นผู้ผลิตกานพลู
ส่งออกประมาณร้อยละ 80 ของปริมาณที่มีการใช้ในโลกที่เหลือผลผลิตจะได้จากอินโดนีเซียศรีลังกา
บราซิล และอินเดียตะวันตก
ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ : กานพลู เป็นไม้ยืนต้น สูง 5 – 10 m ใบเดี่ยว เรียงตรงข้าม รูปวงรีหรือรูป
ใบหอก กว้าง 2.5 - 4 cm ยาว 6 - 10 cm ขอบเป็นคลื่น ใบอ่อนสีแดงหรือน้าตาลแดง เนื้อใบบางค่อนข้าง
เหนียว ผิวมัน ดอกช่อ ออกที่ซอกใบ กลีบดอกสีขาวและร่วงง่าย กลีบเลี้ยงและฐานดอกสีแดงหนาแข็ง
ผลเป็นผลสด รูปไข่
สารสกัดจากกานพลู : การควบคุมโดยชีววิธีเป็นทางเลือกที่ดีสาหรับใช้ในการควบคุมโรคพืช
ทดแทนการใช้สารเคมีซึ่งสามารถปนเปื้อนในอาหารและก่อให้เกิดปัญหาสิ่งแวดล้อมโดยการใช้จุลินทรีย์
ปฏิปักษ์หรือสารสกัดจากธรรมชาติในการยับยั้งเชื้อราสาเหตุโรคงานวิจัยนี้เป็นการทดสอบกิจกรรมต้าน
เชื้อราของสารสกัดจากกานพลูพลูและขมิ้นต่อเชื้อรา 3 ชนิดได้แก่ Aspergillu ssp., Fusarium sp. และ
Penicillium sp. ซึ่งเป็นเชื้อราที่แยกได้จากกระเทียมและเกี่ยวข้องกับโรคหลังการเก็บเกี่ยวและประเมิน
ประสิทธิภาพการเป็นจุลินทรีย์ปฏิปักษ์ด้วยวิธี dual culture ของเชื้อรา Trichoderma spp. จานวน 1 ไอโซเลต
และ Bacillus subtilis ต่อเชื้อราทั้งสามชนิดด้วยผลการศึกษาพบว่าสารสกัดจากพืชทั้งหมดที่ทดสอบมีฤทธิ์
การยับยั้งเชื้อราโดยสารสกัดจากกานพลูที่ความเข้มข้น 5 และ 10 mg/ml มีประสิทธิภาพดีที่สุดโดยยับยั้ง
เชื้อราทั้งหมดที่ทดสอบได้อย่างสมบูรณ์ทุกไอโซเลตของ Trichoderma spp. มีความสามารถในการยับยั้ง
4
- 12. 12
การเจริญของโคโลนีเชื้อรา Fusarium sp. ในระดับปานกลางถึงระดับสูงโดยมีค่าร้อยละการยับยั้งระหว่าง
35-76 และประสิทธิภาพของ B. Subtilis ต่อการยับยั้งเชื้อรา Aspergillu ssp. สูงกว่าการยับยั้งFusarium sp.
และ Penicillium sp.
ภาพ 2.1 กานพลู (ที่มา : https://goo.gl/3B836F)
2) กระชาย
ชื่อวิทยาศาสตร์: Boesenbergia rotunda
วงศ์ : ZINGIBERACEAE
ชื่อสามัญ : Fingerroot, Chinese ginger, Chinese keys, Galingale
ถิ่นกาเนิด : ในแถบร้อนอยู่ที่บริเวณเอเชียตะวันออกเชียงใต้จะพบขึ้นอยู่บริเวณในป่าดิบร้อนชื้น
ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ : มีความสูงประมาณ 2-3 ฟุต มีลาต้นใต้ดินเรียกว่า "เหง้า" เป็นเหง้าสั้น
แตกหน่อได้ เช่นเดียวกับขิง ข่า และขมิ้น รากอวบรูปทรงกระบอกหรือรูปไข่ค่อนข้างยาวปลายเรียวแหลม
ออกเป็นกระจุก มีผิวสีน้าตาลอ่อนเนื้อใบสีเหลืองมีกลิ่นหอมเฉาะตัว ส่วนที่อยู่เหนือดินเป็นกาบใบที่หุ้ม
ซ้อนกันเป็นชั้นๆ สีแดงเรื่อๆ ใบเป็นใบเดี่ยว เรียงสลับตัวใบรูปรีปลายใบเรียวแหลม ขอบใบเรียบ
เส้นกลางใบ ก้านใบและกาบใบด้านบนเป็นร่อง ด้านล่างนูนเป็นสัน ออกดอกเป็นช่อสีขาวหรือขาวอมชมพู
ที่ยอด (แทรกอยู่ระหว่างกาบใบ) ดอกบานทีละดอก มีลักษณะเป็นถุง ผลเป็นผลแห้งเมื่อแก่แล้ว
สารสกัดจากกระชาย : โครงงานวิทยาศาสตร์ เรื่อง ยับยั้งเชื้อราด้วยสมุนไพรในท้องถิ่น เพื่อศึกษา
ว่า สมุนไพรในท้องถิ่นสามารถนามายับยั้งเชื้อราได้หรือไม่ โดยสมุนไพรที่นามาใช้ทดลอง ได้แก่ ขมิ้น
หน่อไม้หวาน กระชาย กล้วยลูกอ่อน และลูกยอสุก พบว่า สมุนไพรที่เกิดเชื้อราน้อยที่สุดคือ กระชาย
จากนั้นหาความเข้มข้นของน้ากระชายที่ทาให้เกิดเชื้อราช้าและน้อยที่สุด พบว่า ความเข้มข้นที่ทาให้เกิด
เชื้อราช้าและน้อยที่สุดคือ 20 ml และขนมปังที่มีน้ากระชายเป็นส่วนผสม เกิดเชื้อราช้าและน้อยกว่าขนมปัง
ที่ไม่มีน้ากระชายเป็นส่วนผสม หลังจากศึกษาค้นคว้าแล้วพบว่า กระชายมีคุณสมบัติยับยั้งการเจริญเติบโต
ของเชื้อราขึ้นขนมปัง
5
- 13. 13
ภาพ 2.2 กระชาย (ที่มา : https://goo.gl/peJCCC)
3) มะกรูด
ชื่อวิทยาศาสตร์: Citrus hystrix
วงศ์: RUTACEAE
ชื่อสามัญ : Porcupine Orange, Kiffir Lime, Leech Lime
ถิ่นกาเนิด : ประเทศลาว อินโดนีเซีย มาเลเซีย และไทย ในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้
ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ : เป็นไม้ยืนต้นขนาดเล็ก เป็นไม้เนื้อแข็ง ลาต้นและกิ่งมีหนามยาว
เล็กน้อย ใบเป็นใบประกอบชนิดลดรูป มีใบย่อย 1 ใบ เรียงสลับ รูปไข่ คือมีลักษณะคล้ายกับใบไม้ 2 ใบ
ต่อกันอยู่ คอดกิ่วที่กลางใบเป็นตอน ๆ มีก้านแผ่ออกใหญ่เท่ากับแผ่นใบ ทาให้เห็นใบเป็น 2 ตอน กว้าง
2.5-4 cm ยาว 4-7cm ใบสีเขียวแก่พื้นผิวใบเรียบเกลี้ยง เป็นมัน ค่อนข้างหนา มีกลิ่นหอมมากเพราะมีต่อม
น้ามันอยู่ ซึ่งผลแบบนี้เรียกว่า hesperidium (ผลแบบส้ม) ใบด้านบนสีเข้ม ใต้ใบสีอ่อน ดอกออกเป็นกระจุก
3 – 5 ดอก กลีบดอกสีขาว เกสรสีเหลือง ร่วงง่าย มีกลิ่นหอม มีผลสีเขียวเข้มคล้ายมะนาวผิวเปลือกนอก
ขรุขระ ขั้วหัวท้ายของผลเป็นจุก ผลอ่อนมีเป็นสีเขียวแก่ เมื่อผลสุกจะเปลี่ยนเป็นสีเหลืองสด พันธุ์ที่มีผลเล็ก
ผิวจะขรุขระน้อยกว่าและไม่มีจุกที่ขั้ว ภายในมีเมล็ดจานวนมาก ๆ
สารสกัดจากมะกรูด : ผ้าไหมเป็นผลิตภัณฑ์ผ้าทอจากธรรมชาติที่สาคัญทางภาคเหนือของไทยซึ่ง
ขึ้นชื่อในเรื่องของคุณภาพและความสวยงาม แต่ตัวหนอนไหมซึ่งให้เส้นใยไหมมักประสบปัญหาการติดเชื้อ
จุลชีพในฤดูฝนและฤดูร้อน ทาให้ผ้าไหมมีคุณภาพต่าลง เกษตรกรผู้เลี้ยงไหมมีการใช้ฟอร์มาลีนใน
การทาลายเชื้อจุลชีพ แต่อาจส่งผลเสียต่อมนุษย์และสัตว์เกิดความเป็นพิษและปนเปื้อนในตัวหนอนไหมซึ่ง
เมื่อนามารับประทานอาจก่อให้เกิดอันตรายได้ จึงมีการทดสอบฤทธิ์ในการกาจัดเชื้อราของสมุนไพรไทย
11 ชนิดได้แก่ กะเพรา สะระแหน่ ขิง ข่า ขมิ้น ตะไคร้ มะกรูด ไพล ช้าพลู โหระพา และพลู โดยเตรียม
6
- 14. 14
สมุนไพรจากการสกัดโดยวิธี soxhlet เป็นการสกัดโดยใช้ความร้อนและการควบแน่นและ maceration เป็น
การสกัดโดยการแช่สมุนไพรในตัวทาละลายโดยไม่ใช้ความร้อน ทดสอบฤทธิ์ ยับยั้ง
เชื้อรา Aspergillus 3 ชนิดได้แก่ A. flavus,A.oryzae และ A.nigerด้วยเทคนิค paperdiscdiffusion(หลักการ
ทั่วไปคือ การทาให้สารสกัดสมุนไพรที่มีในแผ่นกระดาษกรอง paper disc ที่เตรียมไว้ก่อน ซึมไปในอาหาร
เลี้ยงเชื้อที่ได้กระจายเชื้อในจานวนที่เหมาะสมไว้ แล้วนาไปเพาะเลี้ยงให้เชื้อเจริญเติบโต อ่านผลการ
ทดสอบโดย การวัดขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางของ inhibition zone ซึ่งจะเห็นเป็นวงใสไม่มีโคโลนีเชื้อรอบๆ
แผ่น disc ความสามารถในการยับยั้งเชื้อแปรตามขนาดของ inhibition zone) และเทคนิค microplate assays
(เป็นการทดสอบหาความเข้มข้นของสมุนไพรในการยับยั้งเชื้อจุลชีพในถาดหลุม) ผลการทดสอบพบว่า
มะกรูด ไพล และขมิ้นมีฤทธิ์ยับยั้งการงอกของสปอร์และการเจริญเติบโตของเชื้อราโดยมีค่าความเข้มข้น
ต่าสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อของสารสกัดสมุนไพร (MIC) เท่ากับ 6.25-1.25 ppm ในขณะที่กลุ่มควบคุมที่ใช้
ฟอร์มาลีนและ ยา ketoconazole ให้ค่า MIC ที่ 3.12-6.25 ppm. ดังนั้นพืชสมุนไพร 3 ชนิดดังกล่าวจึงมีฤทธิ์
ยับยั้งเชื้อราได้
ภาพ 2.3 มะกรูด (ที่มา :https://goo.gl/G87SGr)
4) ชะพลู
ชื่อวิทยาศาสตร์: Piper sarmentosum Roxb
วงศ์ : PIPERACEAE
ชื่อสามัญ : Wildbetal Leafbush
ถิ่นกาเนิด : เขตร้อนของเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ทางตะวันออกเฉียงเหนือของอินเดีย และตอนใต้
ของจีน และไกลถึงหมู่เกาะอันดามัน
ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ : ชะพลูเป็นพืชล้มลุกขนาดเล็ก มักขึ้นทั่วไปตามที่เปียกชื้น ปลูกขึ้นง่าย
เจริญเติบโตได้ดี มีลักษณะเป็นเถาเลื้อยอยู่รวมกันเป็นกลุ่ม ลาต้นแบ่งเป็นข้อโดยตามข้อจะมีรากช่วยในการ
7
- 15. 15
ยึดเกาะ มีกลิ่นเฉพาะตัว ใบมีสีเขียวสดเป็นมัน คล้ายกันกับใบ พลูที่ใช้เคี้ยวกินกับหมาก ฐานใบกว้าง ปลาย
ใบแหลมคล้ายรูปหัวใจหรือใบโพธ์เล็กน้อย เห็นเส้นใบชัดเจน ใบมีกลิ่นฉุน มีรสเผ็ดเล็กน้อย ดอกสีขาวมี
ขนาดเล็ก จะออกเป็นช่อ
สารสกัดจากชะพลู : จากการนาส่วนใบพืชสมุนไพร 3 ชนิด คือ ใบพลู (Piper betle Linn.) ใบชะพลู
(Piper sarmentosum Roxb.) และใบกระบือ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) มาสกัดด้วยตัวทาละลาย
2 ชนิด คือ Hexane และ Ethanol 95% เพื่อทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งการ เจริญเติบโตของเชื้อรา
2 ชนิด ได้แก่ Colletotrichum gloeosporioides และ Sclerotium rolfsii บนอาหาร PDA โดยการทดสอบด้วย
วิธี Paper disc diffusionโดยใช้สารสกัดที่ระดับความเข้มข้น 100000 ppm พบว่าส่วนสกัดหยาบที่สามารถ
ยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides ได้ดีที่สุดคือ ส่วนสกัด Ethanol จากใบพลู
โดยมีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเท่ากับ 43.77 และส่วนสกัดหยาบที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา
Sclerotium rolfsii ได้ดีที่สุด คือ ส่วนสกัด Hexane จากใบชะพลู โดยมีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเท่ากับ 45.47 และ
เมื่อนาส่วนสกัดหยาบที่ให้ผลดีในการยับยั้งการเจริญของเชื้อมาปรับความเข้มข้นเป็น 5 ระดับ ได้แก่
100000, 50000, 10000, 5000 และ 1000 ppm แล้วนาไปทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้ออีกครั้งด้วย
วิธีเดียวกัน ผลปรากฏว่า ที่ระดับความเข้มข้นของส่วนสกัด 50000 ppm เป็นต้นไป สามารถยับยั้ง การ
เจริญเติบโตของเชื้อราได้ดีในระดับที่ใกล้เคียงกับการใช้สารเคมี ซึ่งอาจนาไปใช้ทดแทนการใช้ สารเคมีใน
ปัจจุบันได้
ภาพ 2.4 ชะพลู (ที่มา : https://goo.gl/a3SSCr)
8
- 16. 16
2.2 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง
กิตติศักดิ์ โชติกเดชาณรงค์ (2556) ศึกษาผลของยาปฏิชีวนะและสารฆ่าเชื้อการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ใน
อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ค้นพบเทคนิคการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอย่างง่าย ต้นทุน
ต่า และมีประสิทธิภาพในการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์เทียบเท่าหม้อนึ่งความดันไอโดยการการต้มอาหารวุ้นสูตร MS
จนกระทั่งวุ้นละลายหมด แล้วรอให้อุณหภูมิลดถึง 60 °Cจึงเติมน้ายาฟอกขาวความเข้มข้นร้อยละ 0.1 ml/l
ลงในอาหารและคนให้เข้ากันก่อนเทลงในขวดเพาะเลี้ยงขนาด 4 oz แล้วปิดฝา เมื่ออาหารวุ้นแข็งตัวสามารถ
ใช้ได้ทันที ดังนั้นวิธีการดังกล่าวนี้สามารถลดต้นทุน ขั้นตอนและเวลาในการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในอาหาร
เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อลงอย่างมากเนื่องจากไม่ต้องใช้หม้อนึ่งความดันไอที่มีราคาแพงและสิ้นเปลือง
สุธานันทน์ นาคประนม (2550) ศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดหยาบจากสมุนไพรบางชนิดใน
การยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Colletotrichum gloeosporioides และ Sclerotium rolfsii เชื้อราสาเหตุ
โรคพืชโดยทดลองนาส่วนสกัดหยาบจากพืช 3 ชนิด คือ ใบพลู ใบชะพลู และใบกระบือที่สกัดด้วย
ตัวทาละลาย Hexane และ Ethanol 95% มาทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา
Colletotrichum gloeosporioides และเชื้อรา Sclerotium rolfsii ด้วยวิธี Paper disc diffusion ที่ระดับความ
เข้มข้นเดียวกันคือ 100,000 ppm พบว่าใบพลูที่สกัดด้วยตัวทาละลาย Ethanol สามารถยับยั้งเชื้อรา
Colletotrichum gloeosporioides ได้ดี และใบชะพลูที่สกัดด้วย Hexane สามารถยับยั้งเชื้อรา Sclerotium
rolfsii ได้ดี สารสกัดหยาบทั้ง 2 ชนิดให้ค่าประสิทธิภาพยับยั้งการเจริญของเชื้อราใกล้เคียงกับการใช้สารเคมี
แมนโคเซบ ซึ่งความเป็นไปได้ที่จะนาส่วนสกัดดังกล่าวไปพัฒนาเพื่อใช้ทดแทนสารเคมีที่ใช้อยู่ในปัจจุบัน
พรพนา นาคสิงห์ (2550) ทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดเอทานอลจากเปลือกผลทับทิม ในการ
ยับยั้งเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides สาเหตุโรคแอนแทรคโนสของพริก ทดสอบด้วยวิธี
Poison Food Technique บนอาหาร PDA โดยใช้สารสกัดที่ความเข้มข้น 20,000 40,000 60,000 80,000 และ
100,000 ppm พบว่าสารสกัดจากเปลือกผลทับทิมทุกระดับความเข้มข้นสามารถยับยั้งการเจริญขิงโคโลนี
ของเชื้อรา C. gloeosporioides ได้ โดยที่ระยะเวลาในการทดสอบ 5 วัน สารสกัดจากเปลือกผลทับทิมความ
เข้มข้น 100,000 ppm มีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อได้สูงสุด 64.97% ในการทดสอบการ
ยับยั้งการงอกของสปอร์เชื้อรา C. gloeosporioides โดยวิธี Spore germination Test พบว่าสารสกัดจากเปลือก
ผลทับทิมระดับความเข้มข้น 100,000 ppm ทาให้สปอร์ของเชื้อรามีการงอก 73% และจัดการทดสอบการ
ยับยั้งการเจริญของเส้นใยที่ความเข้มข้น 100,000 ppm สามารถยับยั้งการเจริญเป็นเส้นใยได้โดยมีความยาว
42 μ𝑚 เมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม
9
- 17. 17
บทที่ 3
วิธีการดาเนินงาน
3.1 วัสดุอุปกรณ์
3.1.1 สมุนไพรทดลอง
1) ใบชะพลู 30 g
2) ลาต้นตะไคร้ 30 g
3) เหง้าขมิ้น 30 g
4) ใบผักแพว 30 g
5) ใบสะระแหน่ 30 g
6) เปลือกมะกรูด 30 g
7) ใบมะกรูด 30 g
8) น้ามะกรูด 30 g
9) หัวกระเทียม 30 g
10) กานพลูอบแห้ง 30 g
11) เหง้าขิง 30 g
12) ใบโหระพา 30 g
13) เหง้ากระชาย 30 g
3.1.2 วัสดุและอุปกรณ์
1) บีกเกอร์ขนาด 25 ml,50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml อย่างละ 5 ใบ
2) บีกเกอร์สแตนเลส 1,000 ml และ 2,000 ml อย่างละ 1 ใบ
3) จานเพาะเชื้อ 16 คู่
4) ขวดคูแลน 500 ml 2 ขวด
5) ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อขนาด 4 oz 8 ขวด
6) หลอดทดลอง 8 หลอด
7) กระบอกฉีดน้า 1 กระบอก
8) เข็มฉีดยา 1 อัน
9) แท่งแก้วคนสาร 2 แท่ง
10) โกร่งบด 2 ใบ
11) ช้อนตักสาร 2 คัน
12) เข็มเขี่ยเชื้อ 3 เล่ม
- 18. 18
13) ตะเกียงแอลกอฮอล์ 2 ตะเกียง
14) มีด 2 เล่ม
15) กระดาษฟรอยด์ 1 แผ่น
16) ผ้าขาวบาง 1 ผืน
3.1.3 สารเคมี
1) ปุ๋ ยไฮโดรโปนิกส์ชนิดเหลว สูตร A 5 ml/l
2) ปุ๋ ยไฮโดรโปนิกส์ชนิดเหลว สูตร B 5 ml/l
3) น้าตาลทราย 30 g
4) ผงวุ้น (ตรานางเงือก) 8 g
5) Methyl alcohol 50 ml
6) Ethyl alcohol 200 ml
3.1.4 เครื่องมือวัดต่างๆ
1) เครื่องชั่ง 1 เครื่อง
2) เทอร์มอมิเตอร์ 1 อัน
3) ตู้ย้ายเนื้อเยื่อ 1 ตู้
4) หม้อนึ่งความดันไอ 1 เครื่อง
5) เครื่องปั่นน้าผลไม้ไฟฟ้า 1 เครื่อง
6) เตาไฟฟ้า 1 เครื่อง
3.2 วิธีดาเนินโครงงาน
ตอนที่1 การคัดแยกเชื้อราที่ปนเปื้อนในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
เลือกอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่กาลังเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีเชื้อราเจริญเติบโต จาแนกชนิดของเชื้อรา
จากลักษณะทางกายภาพคือสี เส้นใย ลักษณะการเจริญเติบโต นาขวดอาหารเพาะเลี้นงเนื้อเยื่อที่ปนเปื้อน
เชื้อราแตกต่างชนิดกันไปแยกให้เชื้อราบริสุทธิ์
การแยกเชื้อราให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี sceptic technique โดยการตัดชิ้นอาหารวุ้นที่มีเชื้อราเป็นชิ้นเล็กๆ
แล้วเอาไปเลี้ยงบนอาหารสูตรกิตติศักดิ์, 2556 (ภาคผนวก) นาไปบ่มที่อุณหภูมิห้อง (25 °C) 3-5วัน จากนั้น
นาเชื้อที่เลี้ยงไปทาการแยกอีกครั้งโดยการ streak plate บนจานอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อใหม่ให้เชื้อบริสุทธิ์
11
- 19. 19
ตอนที่ 2 การสกัดสารสกัดจากธรรมชาติ
นาสมุนไพรที่ต้องการทดสอบจานวน 13 ชนิด คือ ใบชะพลู ลาต้นตะไคร้ เหง้าขมิ้น ใบผักแพว
ใบสะระแหน่ เปลือกมะกรูด ใบมะกรูด น้ามะกรูด หัวกระเทียม กานพลูอบแห้ง เหง้าขิง ใบโหระพา เหง้า
กระชาย มาชั่งอย่างละ 30 g แล้วนาไปปั่นให้ละเอียดจากนั้นนาไปบดด้วยโคร่งบดอีกครั้งพร้อมทั้งใส่
ethylalcohol 95% ปริมาตร 10ml ลงไปขณะที่บดด้วย แล้วกรองด้วยผ้าขาวบางเพื่อเอาแต่ส่วนที่เป็นน้า
ตอนที่ 3 การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดจากธรรมชาติในการยับยั้งเชื้อราที่แยกได้
เตรียมอาหารวุ้นสูตรกิตติศักดิ์, 2556 (ภาคผนวก) เทลงในจานเพาะเชื้อ ด้วยปริมาตร 20 ml ทิ้งไว้
1 คืน จากนั้นใช้ที่เจาะขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 ml (ใช้ก้นหลอดหยดแก้วจุ่มแอลกอฮอล์ ลนไฟ แล้วทิ้งไว้
ให้เย็น) มาเจาะบนอาหารวุ้นให้ได้เป็นหลุม แล้วนาสารสกัดหยาบจากสมุนไพรมาหยดลงในหลุมที่เจาะไว้
4 หยด (1 หลุมต่อ 1 สารสกัดสมุนไพร ส่วนชุดควบคุมคือ ใช้ Ethanol 95% หยดลงในหลุม) จากนั้นนา
เชื้อราที่เพาะเลี้ยงไว้มาตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆแล้ววางบนผิวหน้าอาหารดังกล่าว นาไปบ่มที่อุณหภูมิห้อง
ดังภาพ 3.1 แล้วทาการบันทึกผลโดยสังเกตวงใสที่เกิดขึ้นจากการวัดวงใสด้วยไม้บรรทัดในหน่วย mm
ภาพ 3.1 อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เจาะหลุมและวางเชื้อราทดสอบแล้ว
เชื้อทดสอบ
12
- 20. 20
บทที่ 4
ผลการทดลอง
ตอนที่ 1 การคัดแยกเชื้อราที่ปนเปื้อนในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
จากการเลือกเชื้อราจากอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่กาลังเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีเชื้อราเจริญเติบโต
แยกชนิดของเชื้อราจากลักษณะทางกายภาพ คือจากสี ลักษณะการเจริญเติบโต พอได้เชื้อราตามที่ต้องการ
แล้วเอาไปแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ และเทคนิคการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี Aseptic Technique พบว่า สามารถ
แยกเชื้อที่ปนเปื้อนบนอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ 8 ไอโซเลต คือ เชื้อรา01 เชื้อรา02 เชื้อรา03 เชื้อรา04
เชื้อรา05 เชื้อรา06 เชื้อรา07 เชื้อรา08 มีลักษณะกายภาพดังภาพ
เชื้อรา01 เชื้อรา05
เชื้อรา02 เชื้อรา06
เชื้อรา03 เชื้อรา07
เชื้อรา04 เชื้อรา08
ภาพ 4.1 เชื้อรา 8 ไอโซเลตที่แยกได้จากอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
- 21. 21
ตอนที่ 2 การทดสอบความสามารถของสารสกัดจากธรรมชาติต่อการยับยั้งการเจริญของเชื้อราที่แยกได้
เมื่อนาสารสกัดจากธรรมชาติมาทดสอบความสามารถในการยับยั้งการเจริญของเชื้อราที่แยกได้ 8
ไอโซเลต ด้วยวิธีการเจาะหลุมบนอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสูตรกิตติศักดิ์,2558 ที่เพาะเลี้ยงเชื้อราด้วยวิธี
Aseptic Technique ที่ทิ้งไว้ประมาณ 2-3 วัน สังเกตวงที่เกิดขึ้นรอบสารสกัดจากธรรมชาติ พบว่า สารสกัด
จากกระเทียมสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อราที่แยกได้ 5 ไอโซเลต คือ เชื้อรา01 เชื้อรา02 เชื้อรา03
เชื้อรา04 และเชื้อรา06 โดยวัดเส้นผ่านศูนย์กลางวงใสมีค่าเท่ากับ 17.60 mm 21.30 mm 14.40 mm 22.00 mm
20.10 mm ตามลาดับแสดงผลดังตาราง 4.1
ตาราง 4.1 ผลการทดสอบความสามารถของสารสกัดจากธรรมชาติต่อการยับยั้งการเจริญของเชื้อรา
จานวน 8 ไอโซเลต
สารสกัด เส้นผ่านศูนย์กลางวงใส(mm)
เชื้อรา01 เชื้อรา02 เชื้อรา03 เชื้อรา04 เชื้อรา05 เชื้อรา 06 เชื้อรา07 เชื้อรา 08
1.ผักแพว 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
2.สะระแหน่ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
3.ตะไคร้ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
4.ขิง * 0.00 * 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
5.เปลือก
มะกรูด
0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.0 0.00 0.00
6.โหระพา 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
7.ขมิ้น 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
8.ชะพลู 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 * 0.00 0.00
9.ใบมะกรูด 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
10.กานพลู * 0.00 * 0.00 0.00 0.00 * 0.00
11.กระเทียม 17.60 21.30 14.40 22.00 0.00 20.10 * *
12.กระชาย 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
13.น้ามะกรูด 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
14.แอลกอฮอล์ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
หมายเหตุ
* คือ พบวงใสแต่ไม่สามารถวัดเส้นผ่านศูนย์กลางได้เนื่องจากมีขนาดเล็ก
อภิปรายผลการทดลอง
14
- 22. 22
จากการบันทึกผลการทดสอบความสามารถในการยับยั้งการเจริญของเชื้อราที่แยกได้ 8 ไอโซเลต
จะเห็นได้ว่าสารสกัดกระเทียมสมารถยับยั้งเชื้อราที่แยกได้ ได้ดีที่สุดโดยสภาพยับยั้งเชื้อราได้ 5 ไอโซเลต
คือ เชื้อรา01 เชื้อรา02 เชื้อรา03 เชื้อรา04 และเชื้อรา06 โดยวัดเส้นผ่านศูนย์กลางวงใสเท่ากับ 17.60 mm
21.30 mm 14.40 mm 22.00 mm 20.10 mm ตามลาดับ และมีฤทธิ์ยับยั้งได้น้อยในเชื้อราไอโซเลตที่ เชื้อรา07
และเชื้อรา08 ผลการทดลองที่ได้มีความสอดคล้องกับงานวิจัยของนางสาวนุชยา สงฆ์รักษ์ ที่ศึกษาพบว่า
กระเทียมสามารถต้านการเจริญของเชื้อราได้ดีที่สุดจากพืช 7 ชนิด ได้แก่ ขมิ้น กระเทียม ส้มโอ มะนาว
มะกรูด สะเดา และสะเดาช้าง และสามารถยับยั้งเชื้อราทั้ง 6 ไอโซเลตที่พบบนแผ่นยางพาราดิบจาก
Hevea brasiliensis ที่ค่าความเข้มต่าสุดของสารสกัดที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อรา
ทั้งนี้ สารสกัดจากกระเทียมจึงมีแนวโน้มในการนามาผสมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เพื่อพัฒนาสูตร
อาหารที่ปลอดเชื้อจุลินทรีย์ โดยไม่ใช้สารเคมีอีกต่อไป
15
- 23. 23
บทที่ 5
สรุปและอภิปรายผลการทดลอง
5.1 สรุปผล
1. จากการแยกเชื้อราที่พบปนเปื้อนในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช โดยการสังเกตความแตกต่างทาง
กายภาพ ด้วยเทคนิค Aseptic Technique สามารถแยกได้8 ไอโซเลต คือ เชื้อรา01 เชื้อรา02 เชื้อรา03
เชื้อรา04 เชื้อรา05 เชื้อรา06 เชื้อรา07 และเชื้อรา08
2. จากการทดสอบความสามารถต่อการยับยั้งเชื้อราที่แยกได้ พบว่า สารสกัดจากกระเทียมมี
ความสามารถในการยับยั้งเชื้อราที่แยกได้ ได้ดีที่สุด คือสามารถยับยั้งได้ 5 ไอโซเลต คือ เชื้อรา01 เชื้อรา02
เชื้อรา03 เชื้อรา04 และเชื้อรา06
5.2 อภิปรายผล
การที่สารสกัดจากกระเทียมสามารถยับยั้งเชื้อราได้ดีที่สุด เป็นเพราะมีรายงานกล่าวว่า กระเทียมมี
สารประกอบทางเคมีหลายชนิด โดยมีกามะถันเป็นองค์ประกอบหลักที่มีคุณสมบัติเด่น ได้แก่ Allistatin
Allicin Alliin Gralicin Agoene ซึ่งสารประกอบเหล่านี้มีคุณสมบัติเด่นในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ
แบคทีเรีย เชื้อรา และเชื้อไวรัสหลายชนิด อีกทั้งผลที่ได้ยังสอดคล้องกับงานวิจัยของ นางสาวนุชยา
สงฆ์รักษ์ ที่ศึกษาพบว่า กระเทียมสามารถต้านการเจริญของเชื้อราได้ดีที่สุดจากพืช 7 ชนิด ได้แก่ ขมิ้น
กระเทียม ส้มโอ มะนาว มะกรูด สะเดา และสะเดาช้าง และสามารถยับยั้งเชื้อราทั้ง 6 ไอโซเลตที่พบบนแผ่น
ยางพาราดิบจาก Hevea brasiliensis ที่ค่าความเข้มต่าสุดของสารสกัดที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อรา และ
สอดคล้องกับงานวิจัยของ สิริรัตน์ จงฤทธิพร และคณะ เรื่อง การยับยั้งการเจริญของเชื้อราโดยใช้แผ่นฟิล์ม
ไคโตซาน พบว่า แผ่นฟิล์มที่เตรียมจากสารละลายไคโตซานที่เติมสารสกัดจากกระเทียม(Allicin) สามารถ
ยับยั้งการเจริญของเชื้อรา Penicilliium roquefortii และ Aspergillus awamori ได้ดีกว่าแผ่นฟิล์มที่เตรียมจาก
สารละลายไคซานอย่างเดียว
ดังนั้นสารสกัดจากกระเทียมจึงน่านาไปศึกษาต่อ โดยเอาไปผสมในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เพื่อ
สร้างสภาพปลอดเชื้อจากสารเคมีต่อไป
- 26. 26
ภาคผนวก
สูตรอาหารกิตติศักดิ์ 2556
1. ชั่งวุ้นปริมาณ 7 กรัม และน้าตาล 30 กรัม ต่อการทาอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช 1 ลิตร
2. ละลายน้าตาลปริมาณ 30 กรัมในน้า 500 มิลลิลิตร คนให้น้าตาลละลาย
3. เติมสูตรอาหารไฮโดรโปนิก สูตร A และ B ปริมาตรอย่างละ 5 มิลลิลิตร
4. ปรับ pH ให้เท่ากับ 5.8
5. ใส่วุ้นปริมาณ 7 กรัม นาไปต้มจนน้าเดือด
6. ปรับอุณหภูมิให้เย็นลงเหลือ 60 องศาเซลเซียส
7. เติมน้ายาฆ่าเชื้อไฮเตอร์ ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร
8. เทลงในขวดหรือจานอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อ ทิ้งไว้2 วัน
ภาพประกอบการทาโครงงาน
ภาพภาคผนวก1.1 เตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสูตรกิตติศักดิ์
19
- 29. 29
บรรณานุกรม
_____. 2554. สารที่มีประสิทธิภาพในการฆ่าเชื้ออาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. วารสารวิจัยราชภัฎเชียงใหม่
หน้า 150-154
_____. 2542. ประโยชน์จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. สานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
แห่งชาติ. หน้า 16. (ระบบออนไลน์). แหล่งที่มา : https://goo.gl/edvLsK ,(วันที่สืบค้น 16 มิถุนายน
2560)
กิตติโชติ วรโชติกาจร. 2544. Aseptic technique. (ระบบออนไลน์). แหล่งที่มา :
www.wkittich@ratree.psu.ac.th ,(วันที่สืบค้น 16 มิถุนายน 2560)
กิตติศักดิ์ โชติกเดชาณรงค์. 2556. เอกสารประกอบการสอนวิชาการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สาขาวิชาชีววิทยา
คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฎเชียงใหม่
รศ.ดร.อรพิน เกิดชูชื่น. 2551. การยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา. (ระบบออนไลน์). แหล่งที่มา :
www.chemtrack.org ,(วันที่สืบค้น 16 มิถุนายน 2560)
รองศาสตรจารย์พิมพร ลีลาพรพิสิฐ. 2544. เครื่องสาอางธรรมชาติ ผลิตภัณฑ์สาหรับผิวหนัง. พิมพ์ครั้งที่ 2.
สานักพิมพ์คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่. หน้า 140,144,212,227,260. (ระบบออนไลน์).
แหล่งที่มา : https://goo.gl/2E38yc ,(วันที่สืบค้น 16 มิถุนายน 2560)
สมพร. 2549. ความหมายการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. (ระบบออนไลน์). แหล่งที่มา : https://goo.gl/aU9DGD
,(วันที่สืบค้น 16 มิถุนายน 2560)
สรวิทย์สิมะรักษ์อาไพ. 2542. การป้ องกันการปนเปื้อนจุลินทรีย์ด้วยสารเคมีในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช.
สถาบันราชภัฎสุรินทร์
สารานุกรมไทยสาหรับเยาวชนฯ. 2547. เทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร (เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช).
โครงการสารานุกรมไทยฯ. เล่มที่ 28
แสงจันทร์ เอี่ยมธรรมชาติ. 2547. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. คณะวิทยาศาสตร์เทคโนโลยี.
มหาวิทยาลัยราชภัฎเชียงใหม่
22
